Связывание C1q - ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского
реклама
На правах рукописи БИЧУЧЕР Анна Мироновна СВЯЗЫВАНИЕ C1Q – ИНГИБИРОВАНИЕ, АКТИВАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТА, ОПСОНИЗАЦИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ 14.00.36 – аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна Ведущая организация: Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России Защита диссертации состоится «______»___________________2008 г. в ____ часов на заседании специализированного совета Д 208.046.02 ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ. Автореферат разослан «____» __________________2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.И. Новикова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Комплемент является передовым и неспецифическим барьером в защите организма от внешней агрессии и внутренних нарушений. Важным звеном в запуске каскада активации наиболее мощного классического пути комплемента является узнавание первым компонентом комплемента – его C1q субкомпонентом – активаторов: иммунных комплексов в антителозависимом ответе и в антителонезависимом ответе некоторых структур, являющихся индикаторами патологического процесса. Поскольку каскад активации комплемента в конечном итоге приводит к уничтожению клеток, опознанных агрессивными или патологическими, и развитию реакций воспаления, становится понятным желание регулировать действие комплемента, особенно в тех случаях, когда по ряду терапевтических соображений процесс, определенный комплементом как патологический, оказывается для организма полезным. Явлениями с участием комплемента, которые необходимо отменить, являются, например, отторжение трансплантата или воспаление при аутоиммунных заболеваниях (Roos A., Daha M.R., 2002). Циркулирующие в кровотоке иммунные комплексы как результат проявления иммунной защиты или аутоиммунной агрессии являются индикатором иммунного процесса, а также частью патологического звена. Свои функции иммунные комплексы проявляют при воздействии на комплемент, а именно при узнавании их субкомпонентом C1q (Schumaker V.N., 1986). Поэтому мерилом патогенности циркулирующих иммунных комплексов является их опсонизация C1q. Защита комплементом от инфекций и инвазий может начинаться даже при отсутствии в организме антител к агрессору. В этом случае определенные поверхностные структуры последнего могут опознаваться непосредственно C1q или участниками альтернативного пути (Haeney M.R., 1998, Nauta A.J. et al., 2002). Необходимо понимание роли антителонезависимой защиты от различных возбудителей инфекции и инвазии. Одним из важных способов контроля функционирования комплемента является блокирование активации его классического пути (Roos A. et al., 2001). Такое блокирование достигается ингибированием реакции связывания C1q с активатором комплемента, в частности с иммунными комплексами. Поскольку на сегодняшний день известны многие соединения, способные в той или иной степени ингибировать связывание комплемента, целесообразно при создании лекарственных веществ - ингибиторов комплемента осуществлять поиск ингибиторов среди уже имеющихся препаратов, разрешенных к применению. Все изложенное выше свидетельствует о необходимости создания методов для изучения реакции связывания C1q с активатором, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует C1q. Поэтому исследование: «Связывание C1q – ингибирование, активация комплемента, опсонизация иммунных комплексов» является актуальным. Цель настоящего исследования Создание методов и изучение с их помощью связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует C1q. Задачи исследования 1. Разработать иммуноферментные методы определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента. Сравнить результаты определения констант ингибирования, вычисленных с помощью иммуноферментных методов, с данными, полученными гемолитическим методом и в опытах на модельных животных. 2. Исследовать механизм связывания C1q с IgG на соединениях, имитирующих обоих участников реакции. 3. Определить константы ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами с целью обнаружения потенциальных регуляторов системы комплемента. 4. Изучить способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем. 5. Разработать иммуноферментный метод количественного определения C1qсвязывающих иммунных комплексов и сравнить его с другими методами определения ЦИК на реальном материале. 6. Разработать иммуноферментный метод определения антител, способных образовывать с антигенами иммунные комплексы, связывающие комплемент. Научная новизна 1. Впервые разработан иммуноферментный метод определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента. Метод применен для изучения механизма связывания C1q с IgG. Показана роль ионных взаимодействий. 2. Определение констант ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами выявило механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента. 3. Разработан экономичный иммуноферментный метод количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов. 4. Установлена способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем. 5. Полученные результаты позволили углубить знания о природе взаимодействия С1q со своими мишенями и о взаимосвязи между структурой веществ и их ингибирующей активностью. 6. Впервые разработан иммуноферментный метод определения C1q-связывающих специфических антител. Практическая значимость Иммуноферментный метод количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов с использованием поликлональных антител позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод пригоден для использования в практической медицине для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Созданная методика определения констант ингибирования связывания C1q позволяет проводить поиск ингибиторов C1q среди лекарственных и нелекарственных веществ. Практическая ценность работы подтверждена двумя патентами. Положения, выносимые на защиту Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания C1q с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Определение констант ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами позволило выявить механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента, и позволило предложить метод поиска потенциальных регуляторов системы комплемента. Иммуноферментные методы количественного определения C1q-связывающих иммунных комплексов и определения C1q-связывающих специфических антител могут использоваться для оценки клинической роли специфических антител и их иммунных комплексов. Апробация работы Апробация проведена на заседании секции «Общая и прикладная иммунология» Ученого Совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ 23 июня 2008 года, протокол № 4. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (СанктПетербург, июнь 2002), международной конференции, посвященной 80-летию института им. Л.Пастера (С.-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003), III Международном симпозиуме «All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)» (Плевна, Болгария, 2005), Х Европейском конгрессе «Complement in Health and Disease» (Хайдельберг, Германия, 2005), IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007). Публикации По теме диссертации опубликовано 17 работ. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 262 источника, в том числе 27 на русском языке. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 8 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе были использованы сыворотки крови пациентов КДЦ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ и нормальная донорская сыворотка (ГВКГ им. Н.Н. Бурденко), кроличья сыворотка с поликлональными моноспецифическими антителами к С1q субкомпоненту комплемента человека, препарат С1q собственного изготовления, пероксидазные конъюгаты анти-С1q, анти-С3, антиIgG, белка А собственного изготовления, сыворотка крови норок стандартной коричневой породы (зверосовхоз «Салтыковский»), эритроциты барана, антигены герпеса I типа, кори, цитомегаловируса, субклеточная дифтерийная вакцина Кодивак, пероксидаза хрена, алифатические диамины и дикарбоновые кислоты, ряд лекарственных веществ из аптечной сети. Для выполнения исследований применялись следующие коммерческие наборы: набор для микроанализа циркулирующих иммунных комплексов с помощью осаждения полиэтиленгликолем (Набор реагентов для определения циркулирующих иммунных комплексов "Микроанализ ЦИК", ООО "НПО СИНТЭКО, Россия), тест-набор CIC-C1Q ELISA (Bühlmann Laboratories AG, Швейцария) для определения иммунных комплексов. В работе использованы разработанные иммуноферментные методы определения константы ингибирования связывания C1q с активаторами, метод количественного определения комплементсвязывающих иммунных комплексов. Иммуноферментный анализ проводился в микропанелях для иммунологических реакций с использованием автоматического ридера «Multiskan EX» (ThermoLabsystems). В ходе работы были использованы компьютерные программы по вычислению: средних значений, среднестатистического отклонения, линейной регрессии (Microsoft Office), константы ингибирования Ki, количества белка по диаметру кольца преципитации (Л.В. Козлов). Ряд разделов работы выполнен с участием соавторов: В.Л. Дьякова (выделение IgG3), З.П. Белкина (эксперименты на мышах), С.В. Буреевой (синтез некоторых ингибиторов C1q), Т.А. Мамаевой (определение антител к вирусу кори), Е.А. Шмелевой и Ю.А. Парамоновой (определение антител к Кодиваку), Л.И. Новиковой (определение антител к герпесу I типа), Г.В. Бобылевой (определение антител к цитомегаловирусу). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иммуноферментные методы определения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути системы комплемента Определение функциональной активности C1q Для определения функциональной активности субкомпонента C1q первого компонента комплемента была использована способность функционально активного C1q связываться с активаторами классического пути комплемента. Способ, в котором в качестве активаторов были использованы иммуноглобулины G и M человека, сорбированные на микропанели для иммуноферментного анализа, был разработан ранее и на него был получен патент. Количество связавшегося функционально активного C1q определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена IgG антител против C1q человека. Мы также показали, что и другие активаторы классического пути комплемента, например, липополисахариды (пирогенал), цитомегаловирус, могут быть использова- ны для иммуноферментного определения функциональной активности субкомпонента C1q. При использовании в качестве активатора миеломного моноклонального IgG3, который, как известно, лучше других IgG связывается с C1q, было проведено сравнение метода ИФА с количественным определением C1q методом радиальной иммунодиффузии с использованием стандартной сыворотки с известным содержанием С1q (РИД) и гемолитическим методом определения функциональной активности C1q в 9 сыворотках пациентов. Результаты приведены на рис. 1. Рис. 1. Сравнение иммуноферментного метода определения функционально активного C1q с гемолитическим методом определения активности и метода радиальной иммунодиффузии определения количества C1q Данные, полученные методом ИФА, вполне сопоставимы с результатами определения количества С1q методом РИД и функциональной активности гемолитическим методом. Разработка иммуноферментных методов определения ингибирования связывания C1q Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом C1q комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания C1q с сенсибилизированными эритроцитами барана, т.е. ингибировании инициации каскада активации комплемента, завершающегося лизисом эритроцитов. Гемолитический метод, используемый в этом способе, не отличается высокой степенью воспроизводимости и связан с необходимостью приготовления гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того, метод требует удаления из системы исследуемого ингибитора после стадии связывания C1q с антителами, поскольку нельзя исключить возможности действия ингибитора на поздних этапах каскада активации, что усложняет процесс определения ингибирующего действия. Для изучения ингибирования связывания C1q с активаторами классического пути было предложено два подхода, основанных на использовании иммуноферментного метода анализа. В первом случае предварительно инкубировали смесь ингибитора в различных концентрациях с раствором чистого C1q в одной определенной концентрации или с сывороткой крови, содержащей C1q, в подобранном разведении. Затем инкубационные смеси вносили в лунки микропанели для ИФА, в которых был сорбирован активатор классического пути – IgG3 или липополисахарид (ЛПС). Связавшийся C1q после инкубации и отмывания лунок от несвязавшегося C1q определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена кроличьих IgG антител против C1q человека. В другом подходе ингибитор в различных концентрациях вносили в лунки микропанели, в которых был предварительно сорбирован C1q, в смеси с конъюгатом неспецифического IgG человека с пероксидазой хрена. Во всех случаях определяли максимальное связывание z0 в отсутствие ингибитора и zi – связывание в присутствии ингибитора в концентрации [I]. Константу ингибирования Ki определяли по линейному уравнению 1/ zi = [I]/(z0Ki) + 1/z0], строя график зависимости 1/ zi от [I] (рис. 2). дисульфофенилантрон Рис. 2. Определение Ki для ингибирования связывания C1q дисульфофенилантроном: Результаты определения ингибирования связывания C1q разными методами приведены в таблице 1. Табл. 1. Ингибирование связывания C1q, определенное методами ИФА Ингибитор гексаметилендиамин глутаровая кислота на C1q 0.185 ± 0.016 0.493 ± 0.025 Ki, мг/мл на IgG3 на ЛПС 0.214 ± 0.017 0.191 ± 0.022 0.534 ± 0.024 0.709 ± 0.038 Как следует из данных таблицы, наблюдается практическое совпадение констант, определенных разными методами, что свидетельствует об адекватности этих методов. Новые методы давали также сопоставимые по порядку величин результаты и с разработанными ранее гемолитическими методами (табл. 2). Однако в гемолитическом методе константы ингибирования были ниже, чем определенные методом ИФА. Причиной этого может быть разное соотношение партнеров связывания (C1q и иммуноглобулинов) в этих двух методах. Табл. 2. Ингибирование связывания C1q, определенное методом ИФА и гемолитическим методом Ингибитор ИФА лизоцим дисульфат бетулина сульфат бетулиновой кислоты (4.7 0.2)10-4 М (42.2 2.6)10-6 М (57.3 12.2)10-6 М Гемолитический метод (2.9 0.9)10-4 M (8.6 1.8)10-6 М (14.6 3.5)10-6 М Сравнение ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo Обнаружение ингибирующего действия вещества на комплемент и определение константы ингибирования этим веществом активации комплемента на стадии связывания C1q в опытах in vitro, является лишь первым этапом на пути создания лекарственных веществ, блокирующих действие комплемента. Важным является знание действия веществ на комплемент на уровне организма. Чтобы изучить влияние вещества in vivo, необходима животная модель. В литературе описана модель (Higgins PJ, 1997), в которой морской свинке внутривенно вводят кроличью иммунную сыворотку, содержащую антитела к эритроцитам морской свинки. Для сравнения ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo мы воспользовались разработанным ранее способом, позволяющим определять ингибирующее действие веществ на комплемент на модельных животных. В качестве модельных животных использовали беспородных мышей, а в качестве источника комплемента и антител к клеткам крови животного сыворотку крови норок, комплемент которой обладает высокой активностью и в которой присутствуют в высоких титрах естественные антитела к эритроцитам мышей. В контрольных группах животным вводили в ретроорбитальное венозное сплетение 0.06-0.08 мл сыворотки крови норки, доведенной до объема 1 мл раствором 0.15 М NаС1. В опытных группах животных в этом растворе дополнительно содержалось 10 мг ингибитора. В одном из опытов 10 мг ингибитора в объеме 0.5 мл вводили за 2 мин до введения сыворотки норки также в общем объеме 0.5 мл. Число погибших животных подсчитывали через сутки. В контрольной группе без ингибиторов наблюдалась 100 % гибель мышей. Было проведено изучение действия сурамина и гепарина на гибель мышей в результате парентерального введения им сыворотки норки. При этом в опытах одновременно с сывороткой норки мышам вводили соответствующий ингибитор в различных количествах. Введение 10 мг ингибиторов на мышь полностью отменяет гибель животных. Изучение дозозависимости отмены гибели животных под действием ингибиторов показало, что частичная гибель мышей начинает наблюдаться при введении 0.1 мг на мышь гепарина или 1 мг на мышь сурамина. Если учесть общий объем крови мыши 1-2 мл и 1 мл вводимого физиологического раствора, содержащего ингибитор и сыворотку норки, то достигаемые концентрации ингибиторов в условиях частичной гибели животных соответствуют константам ингибирования, полученным в опытах in vitro (для сурамина Ki 411 29 мкг/мл, а для гепарина 36.4 1.7 мкг/мл). Таким образом, действие гепарина в опытах in vitro и in vivo по сравнению с сурамином в 10 раз сильнее в весовом соотношении. Такая корреляция свидетельствует о том, что в опытах на мышах причиной их гибели является действие комплемента, а ингибирование последнего приводит к выживанию животных. Роль электростатических взаимодействий при связывании C1q с активаторами Роль ионных взаимодействий между C1q и IgG при связывании хорошо известна. Важно было установить, наличие каких зарядов (положительных или отрицательных) следовало бы ожидать в связывающих центрах молекулы C1q и ее лиганда и наиболее благоприятные расстояния между этими зарядами. Для этого было проведено определение констант ингибирования связывания C1q с его активаторами для ряда гомологичных диаминов и дикарбоновых кислот. Ингибирование связывания C1q с IgG3 диаминами и дикарбоновыми кислотами изучали методом ИФА с сорбированным IgG3 человека в лунках микропанели и сывороткой крови в качестве источника C1q. Результаты показаны в табл.3 и на рис.3. Табл. 3. Константы ингибирования диаминами и дикарбоновыми кислотами связывания C1q с сорбированным на микропанели IgG3. Ингибитор 1,3-Диаминопропан 1,4-Диаминобутан 1,5-Диаминопентан 1,6-Диаминогексан 1,7-Диаминогептан 1,10-Диаминодекан Малоновая кислота Янтарная кислота Глутаровая кислота Адипиновая кислота Пимелиновая кислота Пробковая кислота Расстояние между заряженными группами, нм 0.49 0.59 0.75 0.87 1.00 1.39 0.44 0.51 0.66 0.71 0.89 0.94 Ki, мМ 59.30 ± 5.70 17.70 ± 2.20 8.33 ± 0.23 1.06 ± 0.09 1.76 ± 0.64 1.26 ± 0.04 8.73 ± 2.21 0.66 ± 0.05 0.49 ± 0.08 1.15 ± 0.20 3.01 ± 0.21 3.71 ± 0.44 Рис. 3. Зависимость констант ингибирования взаимодействия C1q с иммуноглобулином G3 от расстояния заряженных групп в ингибиторах. Полученные результаты показали, что как для диаминов, так и для дикарбоновых кислот существуют расстояния между заряженными группами, обеспечивающие наилучшее ингибирование связывания. Это 0.87 нм для диаминов и 0.66 нм для дикарбоновых кислот. Можно предположить, что ингибитор, блокируя взаимодействие двух партнеров связывания, имитирует какой-либо один из них. Мы провели измерения констант ингибирования связывания C1q с активатором, используя различные активаторы классического пути и преинкубацию ингибитора с различными партнерами такого взаимодействия без отмывки ингибитора после инкубации и с отмывкой. Результаты исследования приведены в таблице 4. Табл. 4. Константы ингибирования гексаметилендиамина и глутаровой кислоты в зависимости от способа определения. Гексаметилендиамин Способ измерения Отношение Ki, мг/мл R2 констант На C1q 0.184 ± 0.016 0.99 2.2 На C1q с отмывкой 0.413 ± 0.075 0.91 На IgG3 0.214 ± 0.017 0.98 5.0 На IgG3 с отмывкой 1.07 ± 0.13 0.96 На ЛПС 0.191 ± 0.022 0.98 1.9 На ЛПС с отмывкой 0.353 ± 0.101 0.86 На ЦМВ 0.733 ± 0.010 0.99 2.4 На ЦМВ с отмывкой 1.79 ± 0.087 0.99 Глутаровая кислота Отношение Ki, мг/мл R2 констант 0.493 ± 0.0249 0.99 4.4 2.19 ± 0.38 0.94 0.534 ± 0.024 0.99 36 19.2 ± 1.0 0.99 0.709 ± 0.038 0.99 9.8 6.97 ± 0.07 0.99 3.21 ± 0.10 0.99 - В таблице приведены результаты экспериментов по определению констант ингибирования для гексаметилендиамина и глутаровой кислоты. В первых двух строках в иммуноферментном методе анализа на C1q, сорбированном на микропанели, показано связывание конъюгата IgG человека с пероксидазой хрена в присутствии ингибитора и после отмывки преинкубированного в лунках планшета ингибитора. Во вторых двух строках представлено связывание C1q с сорбированным на микропанели IgG3 человека. Связавшийся C1q определяли с помощью конъюгата кроличьих антител против C1q с пероксидазой хрена. Точно также определяли связывание с ЛПС и цитомегаловирусом (ЦМВ), сорбированными на микропанели. Эти данные подтвердили способность C1q связываться с ЛПС и ЦМВ антителонезависимым способом. Как следует из данных таблицы по отношению констант, при отмывке преинкубированного гексаметилендиамина, последний лучше связывается с C1q, ЛПС и ЦМВ, по сравнению с IgG3. В случае ЛПС гексаметилендиамин, по-видимому, блокирует две фосфатные группировки липида А, необходимые для связывания с C1q, как это происходит при блокировании этим диамином связывания липида А с рецептором ЛПС по данным литературы. Для ЦМВ ответственной за связывание с C1q, повидимому, является ДНК вируса, при этом связывание с вирусом глутаровой кислоты маловероятно. Это позволяет предполагать наличие в связывающем центре C1q как положительно заряженных групп (ответственных за связывание с ЛПС и ЦМВ), так и отрицательно заряженных (существенных для связывания с иммуноглобулинами). Глутаровая кислота задерживается после отмывки лучше всего на C1q, что характеризует наличие положительно заряженных групп в связывающем центре C1q и, возможно, моделирует отрицательно заряженные группы в комплементсвязывающем участке иммуноглобулина. Данные о преимущественном связывании глутаровой кислоты с C1q коррелируют с полученными ранее в нашей группе результатами по ингибированию полиметакриловой кислотой гемолитической активности комплемента вследствие преимущественного связывания с C1q. Исследование действия лекарственных веществ на комплемент Лекарственные вещества могут оказывать действие на систему комплемента (Козлов Л.В., 2007). Исследованию способности ингибировать классический путь активации комплемента подвергли разнообразный набор лекарственных веществ, включающий нестероидные противовоспалительные препараты, вещество растительного происхождения, антибиотик, дезинфицирующие, антилепрозное, антималярийное и антипротозойное средства. Результаты приведены в таблице 5. Табл. 5. Константы ингибирования связывания комплемента лекарственными веществами. Лекарство Ki C1q, мкг/мл Необходимая доза, мг сульфетрон мирамистин деринат куркумин лизоцим диклофенак слабилен гепарин мелоксикам кромогликат сурамин делагил гентамицин 0.06 ± 0.01 0.10 ± 0.03 4.45 ± 0.19 5.29 ± 0.17 6.71 ± 1.76 19.0 ± 2.9 25.5 ± 1.64 36.4 ± 1.7 116 ± 18 349 ± 33 411 ± 29 544 ± 178 47200 ± 3100 0.3 0.5 20 27 35 95 128 180 580 1750 2055 2720 236000 Максимальная суточная терапевтическая доза, мг 1500 ? 75 665 150 50 167 280 15 5000 1600 1000 80 Для того чтобы можно было сравнить ингибирующее действие веществ по их эффективности, в таблице приведены максимальные терапевтические дозы этих лекарственных соединений и необходимая доза принимаемого препарата для достижения эффекта половинного ингибирования комплемента, рассчитанная из концентрации в крови, равной константе ингибирования, и общего объема крови 5 л. Конечно, такой расчет не всегда правилен. Для исследованных веществ его нельзя применять для мирамистина (препарата наружного применения) и проблематично для кромогликата натрия (ингаляционного препарата). Тем не менее, можно было бы ожидать, что в случаях, когда необходимая доза ниже максимальной терапевтической, должно наблюдаться подавление функциональной активности комплемента на стадии его активации. Если исключить из рассмотрения уже упомянутые мирамистин и кромогликат натрия, то выпадают из потенциально активных гентамицин, сурамин, мелоксикам, диклофенак и делагил. Гентамицин существенно различается по необходимой и максимальной дозам. Что касается мелоксикама, делагила и диклофенака, как известно обладающих противовоспалительным действием, то следует отметить, во-первых, интересующие нас необходимая и максимальная дозы для диклофенака и делагила в принципе сопоставимы, а во-вторых, можно предполагать, что эти соединения, как и большинство нестероидных противовоспалительных препаратов, активны на другой стадии активации комплемента и блокируют образование C3/C5-конвертаз. Описанные в литературе константы половинного подавления гемолитической реакции для классического пути комплемента для слабилена, сульфетрона и куркумина практически совпадают с нашими данными по определению константы ингибирования первой стадии процесса активации комплемента. Предложенный метод определения действия лекарственных веществ на систему комплемента на первой стадии процесса активации позволяет обнаружить и оценить эффективность исследуемых веществ в их воздействии на комплемент. Метод полезно использовать для поиска препаратов, обладающих способностью ингибировать комплемент, а также для изучения побочного действия лекарственных веществ. Антителонезависимая активация комплемента антигенами гельминтов Гельминтозы сопровождаются гуморальным иммунным ответом, что объясняется возможным контактом паразитов или их антигенов с кровью или слизистой хозяина. Важным критерием развития иммунного ответа является способность комплемента опсонизировать антиген, узнавая его антителонезависимым способом. Система комплемента антителонезависимо активируется: 1) классическим путем при прямом связывании компонента C1q с активатором без посредства антител; 2) альтернативным путем, если активатор способен связывать на себе активированный компонент C3. Исследована способность секреторно-экскреторных антигенов Trichinella sp., Оpisthorchis felineus, Toxocara sp., Echinococcus sp. активировать систему комплемента антителонезависимым способом по двум из перечисленных выше путей. Для этого были использованы полистироловые планшеты, содержащие сорбированные секреторно-экскреторные антигены трихинелл, описторхисов, токсокар, эхинококков, производства «Вектор-Бест» и нормальная человеческая сыворотка, не содержащая антител ни к одному из указанных гельминтов. Для изучения связывания комплемента и его активации в лунках планшетов с антигенами инкубировали сыворотку крови человека в условиях активации классического пути комплемента (с ионами Ca2+ и Mg2+) и альтернативного пути (с ионами Mg2+ в отсутствие ионов Ca2+). После инкубации с помощью конъюгатов соответствующих антител с пероксидазой определяли связывание на сорбированных антигенах компонентов C1q и C3. Связывание C1q свидетельствовало об антителонезависимом узнавании антигена классическим путем активации комплемента, а связывание компонента C3 – об активации классического или альтернативного путей. Полученные данные приведены в таблице 6. Табл. 6. Определение активации альтернативного и классического путей комплемента на поверхностных антигенах гельминтов. Антигены гельминтов Trichinella Оpisthorchis Echinococcus Toxocara Альтернативный путь Связывание C3, у.е. 32 510 106 223 Классический путь Связывание C3, у.е. 58 27 51 14 Связывание C1q, у.е. 53 69 30 28 Все исследованные антигены оказались способными связывать C1q и активировать оба пути комплемента. Соотношения в эффективности антигенов трихинелл, описторхисов, эхинококков и токсокар, в связывании C1q приблизительно соответствовали 5:7:3:3, в активации классического пути – 6:3:5:1 и альтернативного пути – 1:16:3:7. Активация комплемента не только приводит к лизису клеток, несущих антиген, но и к включению других защитных систем организма хозяина – выбросу цитокинов, инициированию реакции воспаления, лейкоцитозу. Полученные данные свидетельствуют о вероятном участии комплемента в защите от паразитарных инвазий. Иммуноферментный метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов На сегодняшний день существует множество методов определения ЦИК, различных по сложности и стоимости. Однако практически все методы плохо согласуются между собой, и часто рекомендуется использовать несколько из них (Van Hoeyveld E., 2000). В данной работе предложен иммуноферментный метод определения ЦИК, основанный на способности иммунных комплексов связывать компонент C1q комплемента. В предлагаемом методе иммуноферментный планшет покрывали моноспецифическими поликлональными кроличьими антителами против C1q человека. Иммунные комплексы, опсонизированные C1q, из сыворотки крови связываются с сорбированными антителами, и их количество определяли с помощью конъюгатов с пероксидазой антител против IgG, IgM или IgA. В работе проводится сравнение предлагаемого метода с наиболее применяемыми в настоящее время, и обсуждаются возможные причины наблюдаемых различий результатов определений реальных ЦИК. Из многих имеющихся на сегодня методов определения ЦИК в нашей стране наиболее распространен в клинической практике метод обнаружения комплексов, осаждаемых полиэтиленгликолем и измеряемых по светорассеянию (далее метод ПЭГ). За рубежом популярны иммуноферментные методы анализа (ИФА), основанные на связывании C1q-несущих ЦИК с мышиными моноклональными анти-C1qантителами, сорбированными в лунках микропанели, c детектированием мечеными пероксидазой F(ab’)-антителами к IgG человека (далее MAb-C1q метод). Иногда и у нас и за рубежом используют метод ИФА, в котором для связывания ЦИК на микропанели сорбируют C1q. Одной из разновидностей последнего метода является коммерческий набор CIC-C1Q ELISA (Bühlmann Laboratories AG, Швейцария), строго говоря, не являющийся иммуноферментным (далее метод CIC-C1Q). Он основан на связывании ЦИК с сорбированным на микропанели C1q и оценке количества связавшихся иммунных комплексов с помощью конъюгата белка А с щелочной фосфатазой. Для получения адекватных результатов определения комплементсвязывающих ЦИК с использованием более дешевых реагентов был предложен рассматриваемый здесь метод. Он основан на связывании C1q-несущих ЦИК с кроличьими моноспецифическими поликлональными анти-C1q-антителами, сорбированными в лунках микропанели, c детектированием мечеными пероксидазой козьими моноспецифическими поликлональными антителами к IgG (IgM или IgA) человека (далее анти-C1q метод). Методом анти-C1q было проведено определение содержания ЦИК в сыворотках здоровых доноров крови и больных ревматоидным артритом. Результаты определения приведены в таблице 7. Табл. 7. Результаты определения комплементсвязывающих ЦИК у доноров крови и больных ревматоидным артритом (РА). Параметр Среднее ± станд. откл., мкг/мл Максимум, мкг/мл Норма (ср. + 2 ст.откл.), мкг/мл Число сывороток Превышение нормы, чел. (%) Доноры 7 ± 12 35 до 31 24 2 (8%) Больные РА 47 ± 32 137 20 14 (70%) По литературным данным (Reckel R.P., 1984), среднее содержание ЦИК у нормальных доноров крови составляет 3.8 ± 15.3 мкг/мл, а норма (ср. + 2 ст. откл.) до 34 мкг/мл. Результаты, полученные предлагаемым анти-C1q методом (7 ± 12 мкг/мл и до 31 мкг/мл), практически совпадают с литературными. По литературным данным, повышенное содержание ЦИК обнаруживается у 86% или 81.1% (Antes U., 1991) больных РА при определении по MAb-C1q методу, 77.2% (Hašková V., 1978) при определении с осаждением ПЭГ и 67% (Antes U., 1987) при использовании метода ИФА, в котором для связывания ЦИК применяли сорбированный C1q. Следует отметить, что метод MAb-C1q может давать завышенные результаты, поскольку в крови человека могут присутствовать антитела к иммуноглобулинам мыши (Olds L.C., 1984). Можно также ожидать завышения результатов при использовании ПЭГ метода из-за возможного осаждения помимо ЦИК других высокомолекулярных комплексов и белков. Таким образом, данные, полученные предлагаемым анти-C1q методом (70%) приближаются к данным, в которых отсутствует завышение определяемых ЦИК. Предлагаемый метод анти-C1q был проверен сравнением с ПЭГ методом на модельных ЦИК (термически агрегированных неспецифических IgG человека), опсонизированных C1q (рис. 4). Было найдено полное совпадение результатов. Следует отметить, что определение модельных ЦИК, опсонизированных C1q, коммерческим методом CIC-C1Q дает при линейной калибровочной линии существенно заниженные результаты (рис. 5). y = 0,9999x + 1,8217 R = 0,9884 ПЭГ y = 0,9999x + 0,0009 R = 0,9847 7,5 Иммунные комплексы (определение), мкг/мл анти-C1q Иммунные комплексы (определение), мкг/мл 350 300 250 200 150 100 50 0 -50 0 50 100 150 200 250 300 y = 0,013x + 2,8228 R = 0,9945 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 350 -50 50 IgG(агр), мкг/мл 100 150 200 250 300 350 IgG(агр), мкг/мл Рис. 4. Определение иммунных комплексов методом анти-C1q и методом ПЭГ на модельных комплексах, полученных тепловой агрегацией IgG человека. Рис. 5. Определение иммунных комплексов методом CIC-C1Q на модельных комплексах, полученных тепловой агрегацией IgG человека. 1,2 0,25 1 0,23 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 -0,2 ЦИК (метод CIC-C1Q), мкг/мл ЦИК (метод анти-C1q), ед.ОП (450 нм) Полученные данные можно объяснить тем, что опсонизация комплексов субкомпонентом C1q мешает связыванию с C1q, сорбированным на микропанели. Следовательно, и при определении реальных ЦИК в сыворотке опсонизация комплексов эндогенным C1q может мешать их связыванию на микропанели. Было проведено сопоставление данных, полученных тремя методами, при определении реальных ЦИК в 31 сыворотке крови обследуемых пациентов. На рис. 6 показано, что данные определения методом ПЭГ и методом анти-C1q обнаруживают по крайней мере два типа ЦИК, проявляющихся по-разному в двух различных методах. Такая же картина наблюдается при сравнении методов ПЭГ и CIC-C1Q (рис. 7). Отличия ЦИК, дающих различные картины при сравнении метода осаждения ПЭГ с иммуноферментными методами, в основе которых лежит связывание иммунными комплексами C1q, могут состоять в размерах этих иммунных комплексов. 0,21 0,19 0,17 0,15 0,13 0,11 0,09 0,07 0 -0,4 50 100 150 200 ЦИК (метод ПЭГ), у.е. ЦИК (метод ПЭГ), у.е. Рис. 6. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом анти-C1q и методом ПЭГ в сыворотках крови обследуемых пациентов. Рис. 7. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом CIC-C1Q и методом ПЭГ в сыворотках крови обследуемых пациентов 18 Более удовлетворительные данные были получены при сравнении близких методов анти-C1q и CIC-C1Q (рис. 8). В последнем случае 7 из 31 точки (около 20%) выпадают из общей тенденции. Кроме того, концентрации ЦИК, полученные методом CIC-C1Q, ниже, чем для метода анти-C1q. О возможных причинах этого говорилось выше. Одной из положительных особенностей метода анти-C1q является его пригодность для определения не только IgG-содержащих иммунных комплексов, но также и для IgA-ЦИК и IgM-ЦИК, поскольку, как уже было сказано, C1q связывается, кроме IgG, также и с IgM и IgA. Правда, в последнем случае такие иммунные комплексы не способны активировать классический путь комплемента, а только альтернативный. 90 анти-C1q, мкг/мл 80 70 60 y = 1,8848x + 14,184 R = 0,90956 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 CIC C1Q, мкг/мл Рис. 8. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом CIC-C1Q и анти-C1q в сыворотках крови обследуемых пациентов. 40 IgA и IgM ЦИК, ед. ОП (450 нм) Для того чтобы метод анти-C1q применить для определения IgA-ЦИК и IgM-ЦИК, достаточно лишь поменять анти-IgG конъюгат, на анти-IgA или анти-IgM. 1,4 IgA-ЦИК y = 0,2055x + 0,02 R = 0,7791 IgM-ЦИК y = -0,1968x + 0,6923 R = 0,2233 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 IgG-ЦИК, ед.ОП (450 нм) 1 Рис. 9. Корреляция содержания IgAЦИК и IgM-ЦИК с IgG-ЦИК при определении методом анти-C1q в сыворотках крови обследуемых пациентов. На рис. 9 показана корреляция содержания IgA-ЦИК и IgM-ЦИК с IgG-ЦИК при определении методом анти-C1q в сыворотках крови обследуемых пациентов. Интересно отметить, что увеличение содержания IgG-ЦИК приводит также к повышению содержания IgA-ЦИК. Обратная корреляция IgG-ЦИК и IgM-ЦИК объяснима тем обстоятельством, что первоначально иммунный ответ развивается в виде IgM антител, а затем происходит переключение на синтез IgG антител. Поэтому с ростом специфических IgG антител содержание специфических IgM антител должно падать. Очевидно, что такая тенденция должна проявляться и для иммунных комплексов. Все изученные методы дают одинаково хорошие результаты при исследовании модельных ЦИК. Однако результаты определения реальных ЦИК в испытуемых сыворотках не вполне совпадают при определении разными методами. Одной из причин этого может быть влияние размеров комплексов на результаты количественных определений ЦИК этими методами. Метод, предлагаемый в данной работе, основан на оп- ределении иммунных комплексов, связанных с C1q. Поскольку связывание C1q может приводить к активации комплемента, то патогенность ЦИК определяется именно этим обстоятельством. В связи с этим, а также с его относительной дешевизной метод можно считать предпочтительным для клинического применения. Определение содержания C1q-связывающих специфических антител Описанный выше метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов был применен для обнаружения специфических антител в составе ЦИК, создаваемых путем добавления в тестируемую сыворотку специфического антигена. Этот подход напоминает традиционную реакцию связывания комплемента, в которой гемолитический метод заменен иммуноферментным. Привлекательность такого подхода состоит в том, что, имея одну лишь тест-систему для определения иммунных комплексов, можно было бы определять любые специфические антитела при наличии специфического антигена. Возможность такого подхода была апробирована с использованием вирусных и бактериальных антигенов. Была исследована зависимость количества IgG в иммунных комплексах (образующихся при добавлении антигена к иммунным сывороткам крови), содержащих C1q и связывающихся на микропанели, покрытой антителами к C1q, от количества иммунных IgG, определяемых в тех же сыворотках с помощью микропанелей со связанным антигеном. Было найдено, что специфические иммунные комплексы различаются способностью опсонизироваться комплементом. То есть, число специфических иммунных комплексов, опсонизированных C1q, не дает однозначной линейной зависимости от числа иммунных антител, а обнаруживается несколько линейных зависимостей. Такая гетерогенность антител дискретна и ограничена небольшим набором типов, что, повидимому, может быть использовано для характеристики индивидуального иммунного ответа для каждого пациента. Для определения количества специфических иммунных антител IgG класса были использованы коммерческие или сконструированные собственные ИФА тестсистемы, в которых на микропанели сорбировали антиген, в лунки микропанели добавляли испытуемые сыворотки в подобранном разведении и количество связавшихся иммунных антител определяли с помощью конъюгата антител против IgG человека. Для определения количества специфических иммунных антител IgG класса, способных формировать комплементсвязывающие иммунные комплексы с исследуемым антигеном, проводили преинкубацию испытуемых сывороток с подобранным количеством антигена. Полученные опсонизированные эндогенным C1q иммунные комплексы связывались на микропанели с сорбированными антителами против C1q человека. Количество специфических иммунных антител в составе иммунных комплексов определяли с помощью конъюгата антител против IgG человека. Для проверки адекватности определения количества специфических иммунных антител IgG класса вторым методом результаты, полученные им, наносили на график против результатов, полученных первым методом. Полученные графики показаны на рис. 10. Во всех случаях с иммунными сыворотками против вакцины Кодивак (а), вирусов герпеса I типа (б), кори (в) и цитомегаловируса (г) графики представляли собой набор прямых линий (от двух до четырех), которые свидетельствовали о гетерогенности специфических иммунных антител IgG класса, существующих в разных типах иммунных сывороток. При этом всегда обнаруживалась популяция антител, которая при их низком содержании по данным прямого определения показывала наличие высокого содержания опсонизированных C1q иммунных комплексов, образованных специфическими иммунными антителами. Эту популяцию антител из-за их низкой концентрации мы склонны отнести к «базовым», существующим до развития индуцированного ответа и исчезающим после накопления в более высоких концентрациях «иммунных» антител. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами по вакцинации против менингококка: до вакцинации в сыворотках обнаруживались антитела к наиболее сильному эпитопу, а после вакцинации эти антитела исчезали, зато появлялись антитела к слабым эпитопам. Причина наблюдаемой гетерогенности специфических антител пока не ясна. Можно лишь предполагать, что в более крупных иммунных комплексах может обнаруживаться предлагаемым методом меньшее количество антител, что обусловлено стерическими препятствиями. Тем не менее, можно говорить о различиях в типе иммунного ответа различных индивидуумов и таких типов ответа существует для данного антигена ограниченное число. а б г в Рис. 10. Зависимость количества C1q-связывающих специфических иммунных комплексов от количества специфических иммунных антител против вакцины кодивак (а), вирусов герпеса (б), кори (в), цитомегаловируса (г) в сыворотках иммунных больных. ВЫВОДЫ 1. 2. 3. 4. Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания C1q с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Показана роль электростатических взаимодействий при связывании C1q с активаторами. Определены константы ингибирования связывания C1q некоторыми лекарственными веществами. Предложен механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента. Выявлена способность паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента без участия антител. Разработан иммуноферментный метод количественного определения C1qсвязывающих иммунных комплексов. Метод позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов. 5. Разработанный иммуноферментный метод определения специфических антител к вирусным и бактериальным антигенам показал гетерогенность этих антител в отношении образования C1q-связывающих иммунных комплексов. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Романов С.В., Лахтин В.М., Бичучер А.М., Андина С.С., Колесникова Е.А. Функциональная активность компонентов комплемента – новый диагностический критерий// Материалы третьей международной конференции посвященной 80-летию Ин-та им. Пастера. С.-Петербург. 2003. С. 167. 2. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л., Романов С.В., Бичучер А.М. Действие иммуноглобулинов различных классов на систему комплемента// Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения». Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». 2003. С. 10-11. 3. Козлов Л.В., Белкин З.П., Бичучер А.М., Баталова Т.Н., Дьяков В.Л. Сравнение действия ингибиторов комплемента в опытах in vitro и in vivo: иммуноферментный метод изучения ингибирования субкомпонента C1q и ингибирование действия комплемента на модельных животных// Биомедицинская химия. 2003. Т.49. №3. С.284290. 4. Козлов Л.В., Романов С.В., Андина С.С., Бичучер А.М., Колесникова Е.А., Дьяков В.Л. Влияние наличия в крови IgG антител к патогену на изменение функциональной активности компонентов комплемента// Патогенез. 2004. № 4. С. 47-52. 5. Бичучер А.М., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Иммуноферментный метод определения комплемент-связывающих иммунных комплексов// Иммунология Урала. 2005. №1(4). С. 184-185. 6. Bureeva S.V., Bichucher A.M., Andia-Pravdivy J.E., Igumnov M.A., Moskaleva V.V., Rukosueva N.V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Kozlov L.V., Kaplun А.P. Synthetical immunomodulators: inhibition of C1q-IgG interaction by negative charged low weight compounds// Abstracts of III International Symposium “All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)” Pleven. Bulgaria 2-5 June 2005. С.53. 7. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Bichucher A., Orishchenko D., Kaplun A. QSAR of inhibition of classical pathway of complement activation by dicarboxylic acids// Mendeleev Commun. 2005. № 6. P. 253-256. 8. Bichucher A.M., Kozlov L.V. The inhibition of binding C1q to aggregated IgG by aliphatic diamines and dicarboxylic Acids// Mol. Immunol. 2006. V.43. P.151. 9. Bureeva S.V., Andia-Pravdivy J.E., Bichucher A.M., Igumnov M.A., Moskaleva V.V., Rukosueva N.V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Popenko V.I., Kozlov L.V., Kaplun A.P. Negative charged low weight compounds inhibit classical pathway of complement activation blocking C1q-IgG interaction. // Mol. Immunol. 2006. V.43. P.188. 10. Козлов Л.В., Романов С.В., Андина С.С., Бичучер А.М., Колесникова Е.А., Дьяков В.Л. Влияние сывороточных IgG антител к Chlamydia trachomatis на функциональную активность компонентов комплемента // ЖМЭИ. 2006. №3. С. 81-86. 11. Бичучер А.М., Козлов Л.В. Антителонезависимая активация комплемента секреторно-экскреторными антигенами гельминтов// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов. микробиологов и паразитологов. Москва. 2007. Т. 3. С.13-14. 12. Бичучер А.М., Козлов Л.В., Новикова Л.И., Парамонова Ю.А., Шмелева Е.А. Определение содержания специфических антител к инфекционным агентам унифицированным методом// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов. микробиологов и паразитологов. Москва. 2007. Т. 3. С.252-253. 13. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Symon A., Bichucher A., Moskaleva V., Popenko V., Shpak A., Shvets V., Kozlov L., Kaplun A. Selective inhibition of the interaction of C1q with immunoglobulins and the classical pathway of complement activation by steroids and triterpenoids sulfates.// Bioorg. Med. Chem. 2007. V.15. P. 3489-3498. 14. Бичучер А.М., Козлов Л.В. Исследование действия лекарственных веществ на комплемент. Ингибирование связывания субкомпонента C1q с мишенью// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т. 70. №6. С.25-28. 15. Козлов Л.В., Бичучер А.М., Дьяков В.Л. Заявка на изобретение № 2006125176 «Способ и набор иммуноферментного определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов» // Бюллетень изобретений № 19 10.07.2008. Патенты: 1. Козлов Л.В., Бичучер А.М., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. патент РФ № 2190219 на изобретение «Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента C1q» // Бюллетень изобретений № 27. 27.09.2002. 2. Козлов Л.В., Бичучер А.М,. Дьяков В.Л. патент РФ № 2313094 С1 на изобретение «Способ и набор для иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонента C1q комплемента» // Бюллетень изобретений №35 20.12.2007.
