015644 B1 015644 B1 (11) 015644

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(12)
(45)
015644
(13)
B1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
Дата публикации и выдачи патента
2011.10.31
(21)
(11)
(51) Int. Cl. A61K 31/18 (2006.01)
A61P 19/02 (2006.01)
Номер заявки
200970224
(22)
Дата подачи заявки
2007.08.24
(54)
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ХРЯЩА
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к лечению заболевания хряща и, в частности, остеоартрита. Более
конкретно оно относится к применению FGF-18 в схемах лечения и для изготовления
лекарственного средства для лечения пациентов, имеющих заболевание хряща, такое как
остеоартрит, такое как, например, остеоартрит коленного сустава или вторичный остеоартрит
бедренного сустава. Особо представлена предпочтительная схема лечения, включающая введение
один раз в неделю соединения FGF-18 за цикл лечения.
Джимона Альберто, Ладель Кристоф
Х., Фом Баур Эльмар (CH)
Медведев В.Н. (RU)
B1
015644
(56)
MOORE
E.
E.
ET
AL.: "FIBROBLAST GROWTH FACTOR-18
STIMULATES
CHONDROGENESIS
AND
CARTILAGE REPAIR IN A RAT MODEL
OF
INJURY-INDUCED
OSTEOARTHRITIS"
TRANSCRIPTS OF THE ANNUAL MEETING OF
THE ORTHOPAEDIC RESEARCH SOCIETY, XX,
XX, vol. 13, 7 March 2004 (2004-03-07), pages
623-631, XP008055754 abstract page 624, left-hand
column, last paragraph
WO-A-2006014444
WO-A2-2004032849
015644
(31) 06119557.4; 60/840,600
(32) 2006.08.25; 2006.08.28
(33) EP; US
(43) 2009.08.28
(86) PCT/EP2007/058830
(87) WO 2008/023063 2008.02.28
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АРЕС ТРЕЙДИНГ С.А. (CH)
015644
Изобретение относится к области медицины и касается лечения заболеваний хряща и, в частности,
остеоартрита. Более конкретно, оно относится к применению FGF-18 в схемах лечения и для изготовления лекарственного средства для лечения пациентов, имеющих заболевания хряща, такие как остеоартрит, такой как, например, остеоартрит коленного сустава или вторичный остеоартрит бедренного сустава. Особо представлена предпочтительная схема лечения, включающая в себя введение один раз в неделю соединения FGF-18 за цикл лечения.
Уровень техники
FGF18 был идентифицирован как член семейства FGF, который является наиболее родственным по
отношению к FGF8 и FGF17. Активность, связанная с FGF18, включает в себя стимуляцию линии дифференцировки мезенхимальных клеток, в частности, сердечных миоцитов, остеобластов и хондроцитов
(патент США № 6352971). FGF18 связывается и активирует FGFR4 и IIIc сплайсинговый вариант FGFR3
и FGFR2.
Ремоделирование кости представляет собой динамический процесс, посредством которого поддерживается масса ткани и строение скелета. Процесс представляет собой баланс между резорбцией кости и
образованием кости, в которых, как представляется, основными участниками являются два клеточных
типа. Указанными клетками являются остеобласты и остеокласты. Остеобласты синтезируют и откладывают матрикс, который должен стать новообразованной костью. Активность остеобластов и остеокластов
регулируется многими факторами, системными и местными, включая факторы роста.
Хрящ представляет собой тип плотной соединительной ткани. Он состоит из клеток, называемых
хондроцитами, которые диспергированы в твердой гелеподобной субстанции, называемой матриксом.
Хрящ является аваскулярным (не содержит кровеносных сосудов), и питательные вещества диффундируют через матрикс. Хрящ находится в суставах, в грудной клетке, в ухе, в носу, в гортани и между межпозвоночными дисками. Существуют три основных типа хряща: гиалиновый, эластический и волокнистый хрящи. Главной целью хряща является создание остова, на котором могло бы начаться отложение
кости. Другой важной целью хряща является создание гладких поверхностей и механическая защита при
движении костей, составляющих сустав.
Замещение поврежденного хряща, в частности суставного хряща, поврежденного в результате
травмы или заболевания, представляет собой основную проблему для врачей, а имеющиеся в настоящее
время способы лечения считаются непредсказуемыми и эффективными лишь в течение ограниченного
времени. Фактически, все доступные в настоящее время способы лечения при повреждении хряща фокусируются на облегчении боли, при малой эффективности или при отсутствии эффективности в отношении регенерации поврежденных тканей. Таким образом, большинство пациентов молодого возраста не
предпринимают попыток лечиться, или им рекомендуют отложить лечение на как можно более длительный срок. Когда лечение требуется, стандартной процедурой является тотальная замена сустава или микроперелом, процедура, которая включает в себя проникновение в субхондральную кость для стимуляции
отложения волокнистого хряца хондроцитами.
Для пациентов с остеоартритом нехирургическое лечение состоит из физиотерапии, изменения образа жизни (например, ограничения активности), иммобилизации, ношения поддерживающих устройств,
введения пероральных и парентеральных лекарственных средств (например, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств) и медицинского контроля. Хирургические варианты лечения сильно зависят от тяжести остеоартрита и могут обеспечить обычно лишь кратковременное облегчение симптомов. Тибиальная или феморальная остеотомия (рассечение кости для ребалансировки износа сустава)
может облегчить симптомы, способствовать поддержанию активного образа жизни и отсрочить необходимость тотальной замены сустава. Тотальная замена сустава может облегчить симптомы запущенного
остеоартрита, но обычно требует изменения образа жизни и/или уровня активности пациента.
Таким образом, было бы желательно иметь способ лечения, профилактики или облегчения симптомов заболеваний хряща, который позволит регенерировать поврежденную ткань. Помимо этого, было бы
желательно, чтобы указанный способ был насколько это возможно безопасным и эффективным. Кроме
того, поскольку заболевания хряща могут быть хроническими, было бы желательно, чтобы указанный
способ позволял осуществлять повторное лечение пациента.
Сущность изобретения
Изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего заболеванием хряща, который
включает введение соединения FGF-18, в котором соединение FGF-18 вводят по меньшей мере два раза,
с интервалами приблизительно 4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, подлежащее лечению, представляет собой остеоартрит, соединение FGF-18 представляет собой фрагмент FGF-18, обозначенный в настоящем
документе как FGF-18(170AA), а цикл дозировок составляет от 10 до 30 мкг на внутрисуставную инъекцию, один раз в неделю, в течение 3 недель подряд (один цикл лечения). В предпочтительном варианте
осуществления настоящего изобретения указанные циклы лечения можно повторять спустя 4 или 6 месяцев. Например, в случае повторения цикла лечения через 6 месяцев, если первый цикл лечения начинают в январе данного года, то второй цикл лечения можно начинать в июле указанного года.
Далее в настоящем документе описано применение соединения FGF-18 для изготовления лекарст-1-
015644
венного средства для лечения пациента, имеющего заболевание хряща, в котором соединение FGF-18
вводят по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 4,
предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. Также, в настоящем документе описано применение соединения FGF-18 для лечения пациента, имеющего заболевание хряща, в котором соединение FGF-18 вводят
по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.
Также, в настоящем документе описано применение соединения FGF-18 для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, имеющего заболевание хряща; лекарственное средство адаптировано для введения по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к подходящим способам лечения, включая подходящие схемы введения для
лечения различных заболеваний хряща, такие как, в частности, остеоартрит, соединениями FGF-18, такими как, например, белковый фрагмент FGF-18(170AA). В контексте настоящего изобретения неожиданно было установлено, что соединения FGF-18 оказывают оптимальное облегчающее заболевание или
симптомы действие при заболеваниях хряща, когда их вводят в соответствии со способами и применением, описанными в настоящем документе. Было установлено, что менее частые схемы введения, чем те,
которые предусматриваются настоящим изобретением, могут не являться полностью эффективными, в
то время как более частые схемы введения, чем те, которые предусматриваются настоящим изобретением, могут вызывать воспаление и/или другие, приводящие к обратным результатам, воздействия на окружающую хрящ или сустав среду, при том, что используются те же или сравнимые с предусматриваемыми настоящим изобретением дозами.
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего заболеванием хряща, который включает введение соединения FGF-18, в котором соединение
FGF-18 вводят по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют интервалами приблизительно в
4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. Например, когда введения разделяются интервалом приблизительно в 4 дня, второе введение можно осуществлять приблизительно через 96 ч после первого введения; например, в случае, когда введение осуществляют в день 1, утром, то следующие 3 календарных дня
пациент не будет получать лекарственное средство (день 2, день 3, день 4), и пациент снова получит лекарственное средство в день 5, утром.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные введения разделяются интервалом приблизительно в 6, 7 или 8 дней. В одном предпочтительном варианте
осуществления настоящего изобретения они разделяются интервалом приблизительно в 7 дней.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения FGF-18 для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, имеющего заболевание хряща, в котором соединение FGF-18 вводят по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 6, 7 или 8
дней. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения они разделяются интервалом приблизительно в 7 дней.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные введения разделяют интервалом приблизительно в 7 дней. Предпочтительно соединение FGF-18 вводят с регулярными
интервалами, один раз в неделю.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению соединения FGF-18
для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, имеющего заболевание хряща; лекарственное средство адаптировано для введения по меньшей мере два раза; указанные введения разделяют
интервалами приблизительно в 4, предпочтительно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные введения разделяют интервалами приблизительно в 6, 7 или 8 дней. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения они разделяются интервалом приблизительно в 7 дней.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные введения разделяют интервалом приблизительно в 7 дней. Предпочтительно соединение FGF-18 вводят с регулярными
интервалами, один раз в неделю.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение FGF-18 вводят в
течение по меньшей мере 2 недель подряд, по меньшей мере 3 недель подряд или по меньшей мере 4
недель подряд за цикл лечения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения
цикл лечения представляет собой ряд последовательных недель, в течение которого соединение FGF-18
вводят каждую неделю. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение FGF-18 вводят в течение 2 недель подряд, 3 недель подряд или 4 недель подряд за цикл
лечения, и указанное лечение может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов лечения в год. В одном
предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение FGF-18 вводят в течение 3 недель подряд за цикл лечения. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего
-2-
015644
изобретения указанное лечение включает в себя 2 цикла лечения в год.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает в себя
внутрисуставное введение соединения FGF-18. Альтернативно, лечение может включать в себя внутривенное введение соединения FGF-18.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает введение в дозе 1-100 мкг или, предпочтительно, 1-60 микрограммов (мкг) или, предпочтительно 3-50
мкг или, предпочтительно, 5-40 мкг или, предпочтительно 10-30 мкг на одно внутрисуставное введение
соединения FGF-18. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение
включает введение в дозе приблизительно 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 мкг на одно внутрисуставное введение соединения FGF-18. Предпочтительные дозы включают в себя 5, 10, 15, 20, 25 и 30
мкг на одно внутрисуставное введение соединения FGF-18.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает введение в дозе 50-200 мкг/кг, предпочтительно 8-120 мкг/кг, на одно внутривенное введение соединения FGF-18. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает
введение в дозе 80, 90, 100, 110 или 120 мкг/кг на одно внутривенное введение соединения FGF-18.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое
лечат любым из способов по настоящему изобретению, представляет собой остеоартрит, такой как, например, остеоартрит стадии II или стадии III по классификации OARSI. В предпочтительном примере
остеоартрит может представлять собой остеоартрит колена или остеоартрит бедра, такой как вторичный
остеоартрит бедра. Специалистам известна классификация остеоартрита, использующаяся в настоящее
время. В частности, специалистам известна классификация OARSI. Специалисты могут руководствоваться "Guidelines for medical management of osteoarthritis" (Marc C. Hochberg, Roy D. Altman, Kenneth D.
Brandt, Bruce M. Clark, Paul A. Dieppe, Marie R. Griffin, Roland W. Moskowitz, Thomas J. Schnitzer, Arthritis
& Rheumatism, том 38, издание 11, 1995 г. Страницы 1535-1546).
Предпочтительные соединения FGF-18 по настоящему изобретению выбраны из FGF-18 или FGF18(170AA) человеческого дикого типа.
Соединения по настоящему изобретению
Нативный FGF-18 или FGF-18 дикого типа представляет собой белок, экспрессируемый хондроцитами суставного хряща. Настоящее изобретение, главным образом, относится к применению соединения
фактора роста фибробластов 18 (FGF-18) для лечения остеоартрита. Соединение FGF-18 по настоящему
изобретению включает в себя, например, нативный FGF-18 или FGF-18 дикого типа, в частности человеческий FGF-18, его биологически активные варианты, такие как биологически активные аллельные варианты, и биологически активные укороченные формы FGF-18. Настоящее изобретение может относиться
к любому варианту или модификации FGF-18, которые сохраняют желательную биологическую активность FGF-18, как описано в настоящем документе, такую как, в частности, увеличение отложения хряща. Виды биологической активности FGF-18 включают в себя виды, описанные в разделе "Примеры",
представленном ниже, такие как, в частности, виды активности на in vivo моделях заболевания, описанных в настоящем документе.
Нуклеотидная последовательность кДНК человеческого FGF-18 описана в SEQ ID NO. 1, a его логически выведенная аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO. 2. FGF-18 сначала был
обозначен как zFGF-5 и полностью описан в патентах США №№ 635271, 5989866 и в публикации патентной заявки США US2005/0043234, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Анализ кДНК, кодирующей полипептид человеческого FGF-18 (SEQ ID NO: 1), выявил открытую рамку
считывания, кодирующую 207 аминокислот (SEQ ID NO: 2), включающую в себя зрелый полипептид из
180 аминокислот (от остатка 28 до остатка 207 SEQ ID NO: 2).
Полинуклеотидная последовательность мышиного FGF-18, показанная в SEQ ID NO: 3, и соответствующая аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 4, как было установлено, имеют высокую степень гомологичности по отношению к человеческому ортологу. На аминокислотном
уровне мышиный и человеческий полипептиды были приблизительно на 98% идентичными, с тремя
аминокислотными заменами. Специалистам будет понятно, что последовательности, описанные в SEQ
ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, или в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, представляют собой один аллель человеческого и мышиного гена и полипептида FGF-18, соответственно, и что ожидается, что будет наблюдаться аллельная вариация и альтернативный сплайсинг.
Как уже упоминалось, соединение FGF-18 по настоящему изобретению включает в себя, например,
нативный FGF-18 или FGF-18 дикого типа, в частности, человеческий FGF-18, его биологически активные варианты, такие как биологически активные аллельные варианты, и биологически активные укороченные формы FGF-18. Настоящее изобретение может относиться к любому варианту или модификации
FGF-18, которые сохраняют желательную биологическую активность FGF-18, как описано в настоящем
документе, такую как, в частности, увеличение отложения хряща.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение FGF-18 представляет собой
укороченную форму человеческого FGF-18. В особом варианте осуществления настоящего изобретения
указанная укороченная форма FGF-18 включает в себя или состоит из остатков с 28 по 175 SEQ ID NO: 2,
-3-
015644
или функциональное производное или вариант или мутеин, как описано в настоящем документе. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная укороченная форма FGF-18 включает в
себя или состоит из остатков с 28 по 176, с 28 по 177, с 28 по 178, с 28 по 179, с 28 по 180, с 28 по 181, с
28 по 182, с 28 по 183, с 28 по 184, с 28 по 185, с 28 по 186, с 28 по 187, с 28 по 189, с 28 по 190, с 28 по
191, с 28 по 192, с 28 по 193, с 28 по 194, с 28 по 195, с 28 по 196, с 28 по 197, с 28 по 198, с 28 по 199, с
28 по 200, с 28 по 201, с 28 по 202, с 28 по 203, с 28 по 204, с 28 по 205, с 28 по 206, с 28 по 207 SEQ ID
NO: 2, или функциональное производное или вариант или мутеин, как описано в настоящем документе.
Указанные полипептиды, функциональное производное или вариант или мутеин может включать в себя
дополнительный N-концевой аминокислотный остаток, предпочтительно, метионин. Действительно, в
зависимости от системы и условий экспрессии, полипептиды по настоящему изобретению могут экспрессироваться в рекомбинантной клетке-хозяине с исходного метионина.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является укороченная форма FGF-18, содержащая 170 аминокислот (АА), далее в настоящем документе называемая "FGF-18
(170АА)".
Нативная форма или форма дикого типа имеет длину 207 АА, из которых 27 АА представляют собой сигнальную последовательность, а остальные 11 АА опущены в FGF-18(170AA) (как может быть
продемонстрировано и для встречающегося в естественных условиях FGF-18 in vivo). FGF-18(170АА)
может экспрессироваться в E.coli, поскольку отсутствует сигнальная последовательность, и АА последовательность начинается с метионина, за которым следуют АА28, и заканчивается на АА196. Молекулярная масса FGF-18(170AA) составляет 19,83 кДа, pI ~ 10. FGF-18(170AA) дополнительно описан в SEQ ID
NO. 5, ниже в настоящем документе. FGF-18(170АА) увеличивает пролиферацию/дифференцировку хондроцитов и отложение хряща, что приводит к восстановлению и реконструкции ряда хрящевых тканей.
Члены семейства FGF характеризуются гепаринсвязывающими доменами. Предполагаемый гепаринсвязывающий домен для FGF-18 был идентифицирован в области от аминокислотного остатка 148
(Gly) до аминокислотного остатка 169 (Gln) последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. Было
высказано предположение, что опосредованная рецепторами сигнализация инициируется после связывания лиганда FGF, комплексированного с гепаринсульфат-протеогликанами клеточной поверхности.
Многие члены семейства FGF можно поместить в одно из двух родственных семейств на основании
их структуры и функции. aFGF и bFGF состоят из трех экзонов, разделяемых двумя интронами различной длины. FGF-18 состоит из пяти экзонов, первые три из которых соответствуют первому экзону aFGF
и bFGF. Все известные члены семейства FGF сплайсированы с формированием одиночных полипептидов.
Анализ лиганд-рецепторного комплекса FGF-18 показал, что FGF-18 обладает специфичностью в
отношении FGF-18 и "IIIc" сплайсинговых вариантов FGFR3 и FGFR2. FGFR3-IIIC и FGFR2-IIIC экспрессируются хондроцитами хрящевой ткани, и, в частности, оба рецептора были обнаружены в суставном хряще человека. FGFR3 и FGFR2 были выявлены в пластинке роста у млекопитающих, и они играют
важную роль в формировании эндохондральной и интрамембранозной кости. FGFR2 сначала экспрессируется в конденсирующейся мезенхиме, а экспрессия FGFR3 инициируется по мере дифференцировки и
пролиферации хондроцитов. В развивающихся костях черепа FGFR3 обнаруживают в твердой мозговой
оболочке и надкостнице, в то время как FGFR2 экспрессируется в клетках-предшественниках остеоцитов
в остеогенном слое, разделяющем швы. FGFR2 также экспрессируется в трабекулярной кости. Ранее было установлено, что FGF18 представляет собой пролиферативный агент для хондроцитов и остеобластов,
в зависимости от состояния дифференцировки указанных типов клеток и способа введения (см. патенты
США №№ 6352971 и 5989866; Ellsworth et al. Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320, 2002; Shimoaka et
al., J. Bio. Chem. 277 (9) 7493-500, 2002).
Предпочтительно соединение FGF-18 по настоящему изобретению увеличивает отложение хряща.
Указанное увеличение можно измерить как in vivo, так и in vitro. Выработка гиалинового хряща, эластического хряща и волокнистого хряща является ценной как средство лечения и как компонент биологических матриксов. Соединения FGF-18, такие как FGF-18 (170AA), и композиции, содержащие соединения
FGF-18 ("композиции FGF-18"), будут полезны для лечения дефектов суставного хряща в синовиальных
суставах, которые связаны с возрастным образованием волокон на поверхности, дегенерации хряща, которая связана с остеоартритом, и очаговых хондральных и остеохондральных дефектов, которые связаны
с повреждением или заболеванием.
Соединения и композиции FGF-18 также могут быть пригодными для лечения заболевания суставов, вызванного рассекающим остеохондритом, и дегенеративного заболевания суставов. В области реконструктивной и пластической хирургии композиции FGF-18 будут пригодными для аутогенного и аллогенного увеличения объема и перемещения хряща для реконструкции обширных тканевых дефектов.
Соединения и композиции FGF-18 также могут быть пригодными для распространения клеток и
индуцирования образования эластического хряща. Распространение клеток и индуцирование образования эластического хряща будут полезны для генерации и восстановления ткани уха и носа. Соединения и
композиции FGF-18 также могут быть использованы для роста популяций хондроцитов в культуре для
аутогенной или аллогенной трансплантации хондроцитов, с последующим введением с одновременным
-4-
015644
лечением, заключающимся в введении композиций FGF-18, или без него. В указанных процедурах, например, хондроциты можно собирать артроскопически с неповрежденной области пораженного сустава,
несущей минимальную нагрузку, и культивировать в присутствии композиций FGF-18, чтобы увеличить
количество клеток перед трансплантацией. Увеличенные таким образом культуры затем можно смешивать с композициями FGF-18 и помещать в пространство сустава или непосредственно на дефект. Композиции FGF-18 можно использовать в комбинации с периостальными или перихондральными трансплантатами, которые содержат клетки, способные образовывать хрящ и/или удерживать трансплантированные хондроциты или их предшественники на месте. Композиции FGF-18 можно использовать для
восстановления повреждения хряща в сочетании с лаважем сустава, стимуляцией костного мозга, абразионной артропластикой, субхондральным сверлением или микропереломом субхондральной кости. Помимо этого, после роста хряща, вызванного введением композиции FGF-18, может понадобиться дополнительное хирургическое лечение для придания соответствующих контуров вновь образованной хрящевой поверхности.
Соединение FGF-18 по настоящему изобретению также может представлять собой функциональное
производное, вариант или мутеин белка FGF-18 дикого типа.
Термин "функциональные производные", используемый в настоящем документе, включает в себя
производные FGF-18 и его варианты или мутеины и гибридные белки, которые можно изготовить из
функциональных групп, которые имеют место в качестве боковых цепей на остатках, или N-, или Сконцевых групп, способами, которые известны специалистам. Указанные функциональные производные
входят в объем изобретения до тех пор, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не
нарушают активность белка, которая является практически идентичной или превосходит активность
FGF-18 и не сообщает токсических свойств композициям, которые их содержат.
Указанные производные могут, например, включать в себя полиэтиленгликолевые боковые цепи,
которые могут улучшать другие свойства белка, такие как стабильность, полупериод существования,
биодоступность, переносимость человеческим организмом, или уменьшать иммуногенность. Для достижения указанной цели FGF-18 можно связать, например, с полиэтиленгликолем (PEG-ПЭГ). ПЭГилирование можно осуществлять известными способами, как, например, теми, которые описаны в WO
92/13095. В частности, PEG-IFN можно изготовить в соответствии с предписаниями, приведенными в
WO 99/55377.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения функциональное производное FGF-18 включает в себя по меньшей мере одну часть, соединенную с одной или
более функциональных групп, которые наблюдаются в качестве одной или более боковых цепей на аминокислотных остатках. Вариант осуществления настоящего изобретения, в котором часть представляет
собой полиэтиленгликолевую (PEG) часть, является весьма предпочтительным. В соответствии с настоящим изобретением несколько PEG-частей могут быть также присоединены к FGF-18.
Другие производные включают в себя модифицированный белок FGF-18, такой как длительно действующая форма FGF-18. В частности, длительно действующий FGF-18 можно выбрать из пэгилированного FGF-18, слитых белков FGF-18-HAS и слитых белков FGF-18-Fc.
Другие производные включают в себя алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные взаимодействием с аммиаком или с первичными или вторичными аминами,
N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными
частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или О-ацильные
производные свободных гидроксильных групп (например, из остатков серина или треонина), образованные с ацильными частями.
Термины "варианты" или "мутеины", используемые в настоящем документе, относятся к аналогам
FGF-18, в которых один или более аминокислотных остатков нативного FGF-18 заменены на другие
аминокислотные остатки или опущены, или один или более аминокислотных остатков добавлены к нативной последовательности FGF-18, не снижая значительным образом активность полученных продуктов по сравнению с FGF-18 дикого типа. Указанные мутеины изготавливают с использованием известных технологий синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза, или с использованием любой другой,
подходящей для данной цели, технологии.
Термины "вариант" или "мутеин", используемые в настоящем документе, включают в себя белки,
кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизована с ДНК или РНК,
кодирующей FGF-18, как описано, например, в US 5989866, в жестких условиях. Термин "жесткие условия" относится к условиям гибридизации и последующего отмывания, которые специалисты обычно называют "жесткими". См. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., §§6.3 и
6.4 (1987, 1992). Без ограничения, примеры жестких условий включают в себя условия отмывания при
температурах на 12-20° ниже Tm исследуемого гибрида, например, в 2×SSC и 0,5% SDS в течение 5 мин,
2×SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин, 0,1 SSC и 0,5% SDS при 37°С в течение 30-60 мин, а затем 0,1 SSC
и 0,5% SDS при 68°С в течение 30-60 мин. Специалистам понятно, что жесткость условий также зависит
от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как 10-40 оснований) или сме-5-
015644
шанных олигонуклеотидных зондов. Если используются смешанные зонды, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо SSC. См. Ausubel, выше.
Идентичность отражает взаимоотношения между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемые сравнением последовательностей. Обычно идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты, аминокислоте в двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностях, соответственно, по всей длине сравниваемых последовательностей.
Для последовательностей, в которых не существует точного соответствия, можно определить "%
идентичности". Обычно две сравниваемые последовательности совмещают на одной линии, чтобы выявить максимальную корреляцию между последовательностями. Это может включать в себя инсерцию
"гэпов" в одну или в обе последовательности для повышения степени совмещения. % идентичности
можно определять по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное совмещение), что особенно подходит для последовательностей одинаковой или очень сходной
длины, или по более коротким, определенным длинам (так называемое локальное совмещение), что
больше подходит для последовательностей неравной длины.
Способы сравнения идентичности и гомологичности и/или сходства двух или более последовательностей хорошо известны специалистам. Так, например, можно использовать программы, доступные в
пакете Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 9.1 (Devereux J. et al., 1984), например, программы
BESTFIT и GAP, для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности, и
% гомологичности между двумя полипептидными последовательностями. BESTFIT использует алгоритм
"локальной гомологичности" Smith и Waterman (1981) и выявляет лучшую единственную область сходства между двумя последовательностями. Другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями также известны специалистам, например, семейство программ BLAST
(Altschul S.F. et al., 1990, Altschul S.F. et al., 1997, доступных на главной странице NCBI на
www.ncbi.nih.gov) и FASTA (Pearson W.R., 1990).
Термины "вариант" или "мутеин" в соответствии с настоящим изобретением включают в себя белки, имеющие последовательность аминокислот, достаточно дублирующую последовательность FGF-18,
таким образом, что они обладают активностью, практически сходной с активностью FGF-18.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любой указанный вариант
или мутеин является по меньшей мере на 40% идентичным или гомологичным по отношению к последовательности FGF-18. Более предпочтительно, он является по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на
60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, или, наиболее предпочтительно, по меньшей
мере на 90% идентичным или гомологичным по отношению к ней.
Мутеины FGF-18, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают в себя ограниченный ряд практически аналогичных последовательностей в качестве замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены специалистом обычными способами, без излишнего экспериментирования, на основе идеи и руководства, представленного в настоящем документе.
Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением являются изменения, которые известны как "консервативные" замещения. Консервативные аминокислотные
замещения в полипептидах FGF-18 могут включать в себя синонимические аминокислоты в пределах
группы, которая обладает физико-химическими свойствами, достаточно сходными для того, чтобы замена одних членов группы на другие сохраняла биологическую функцию молекулы (Grantham, 1974). Ясно,
что инсерции и делеции аминокислот также можно осуществлять в указанных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если инсерции или делеции включают в себя лишь немного
аминокислот, например меньше тридцати, и предпочтительно меньше десяти, и не удаляют и не смещают аминокислоты, которые являются ключевыми для функциональной комформации, например, остатки
цистеина. Белки и мутеины, образованные указанными делециями и/или инсерциями, входят в объем
настоящего изобретения.
Предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в
табл. А. Более предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в табл. В; и наиболее предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы,
представленные в табл. С.
-6-
015644
Таблица А. Предпочтительные группы синонимических аминокислот
Таблица В. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот
Таблица С. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот
-7-
015644
Примеры осуществления аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для
получения мутеинов FGF-18 для использования в настоящем изобретении, включают в себя любые известные способы, такие, которые описаны в патентах США №№ 4959314, 4588585 и 4737462, выданных
Mark et al.; 5116943, выданном Koths et al.; 4965195, выданном Namen et al.; 4879111, выданном Chong et
al.; и 5017691, выданном Lee et al.; и лизин-замещенные белки, представленные в патенте США №
4904584 (Shaw et al.).
Изготовление композиций FGF-18 и их введение
Соединения FGF-18 можно изготавливать в виде фармацевтической композиции, т.е. вместе с фармацевтически приемлемым носителем, таким как наполнители и т.п. Определение "фармацевтически
приемлемый" означает любой носитель, который не ухудшает эффективность биологической активности
активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например,
для парентерального введения активный белок (белки) можно изготавливать в виде стандартной лекарственной формы для инъекций, в носителях, таких как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. Указанные композиции соединений FGF-18, включающие в себя
по меньшей мере еще один фармацевтически приемлемый носитель, наполнители и т.п. агенты, в настоящем документе также называются "композициями FGF-18".
Соединения и композиции FGF-18 можно вводить путем непосредственной инъекции в синовиальную жидкость сустава или непосредственно в дефект, как в отдельности, так и в комбинации с подходящим носителем для длительного высвобождения белка (таким как, например, подходящие носители для
композиций с замедленным высвобождением, такие как, например, циклодекстрин) или для ограниченного локального высвобождения (такого как, например, доставка посредством биологически совместимых губок, аналогичных биологических матриксов, инкапсулированных клеток или т.п.).
Композиции для внутрисуставного (в/с) введения будут соответствовать большинству требований,
которые также предъявляют к другим композициям для инъекций, т.е. они должны быть стерильными и
совместимыми с физиологическими условиями в месте введения (например, коленный сустав, СЖ). Стерильность композиций в виде растворов может достигаться автоклавированием (если все компоненты
композиции являются достаточно термоустойчивыми) или стерильным фильтрованием, в то время как
для других композиций процессы производства, требующиеся для гарантирования стерильности продукта, могут быть более сложными. Например, стерильное фильтрование не подходит для композиций, содержащих частицы (суспензий) полутвердых или твердых композиций. Для совместимости композиции с
физиологическими условиями в месте инъекции следует принять во внимание характеристики СЖ. Таким образом, композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются изотоническими. рН
композиций является близкой к рН СЖ (т.е. рН 7,4) или несколько ниже, но предпочтительно не ниже рН
~5,5, для достижения оптимальной стабильности активного ингредиента, при минимуме возможных побочных эффектов, связанных с нефизиологическими величинами рН, таких как активация протеолитических ферментов, например катепсинов. Наполнители, используемые для в/с инъекции, также могут присутствовать в других композициях для инъекций, например, для внутримышечного или подкожного введения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ введения соединения FGF-18,
описанного в настоящем документе, выбран из группы, состоящей из интрааурикулярного введения, периаурикулярного введения, интраназального введения, периназального введения, эндосинусного введения, интракостального введения, перикостального введения, интраторакального введения, периторакального введения, эпидурального введения, перивертебрального введения, перисиновиального введения,
интрасиновиального введения, эндосинусного введения, периартикулярного введения и интраартикулярного введения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение FGF18, описанное в настоящем документе, вводят периартикулярно (введение вокруг сустава) или интраартикулярно (введение внутрь сустава). В одном варианте осуществления настоящего изобретения периартикулярное или интраартикулярное введение осуществляют вокруг или внутрь сустава, выбранного из
тазобедренного сустава, колена, локтя, запястья, голеностопа, позвоночника, стопы, пальца руки, пальца
ноги, кисти руки, плеча, ребер, лопаток, бедер, голеней, пяток и вдоль костных точек позвоночника. В
еще одном варианте осуществления настоящего изобретения периартикулярное или интраартикулярное
введение осуществляют вокруг или внутрь бедренного или коленного сустава.
Заболевания хряща
Настоящее изобретение относится к способам лечения, профилактики или облегчения симптомов
заболевания хряща у млекопитающего. Предпочтительно, указанное заболевание хряща возникает в результате травматического повреждения или хондропатии. Понятно, что предпочтительно пациентами,
подлежащими лечению по настоящему изобретению, являются люди; однако понятно, что других млекопитающих, включая, без ограничения, собак, лошадей и т.п., можно лечить способами по настоящему
изобретению.
Примеры заболеваний хряща, которые можно лечить, предотвращать или облегчать лечением, описанным в настоящем документе, включают, без ограничения: артрит, остеохондрит, реберный хондрит
(болезнь Титце), остеомиелит, полихондрит, рецидивирующий полихондрит и рассекающий остеохонд-8-
015644
рит.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой артрит. Предпочтительно, указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из анкилозирующего спондилоартрита, диффузного идиопатического скелетного гиперостоза (DISH), подагры, псевдоподагры, инфекционного артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, реактивного артрита, склеродермии, синдрома Шегрена и болезни Стилла. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща,
которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой ревматоидный артрит или остеоартрит. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща,
которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой остеоартрит.
Артрит относится к повреждению суставных структур (суставов) в организме и связанным с ним
воспалительным процессам. Артрит, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артритические суставы
в результате повреждения и т.п., представляют собой распространенные воспалительные состояния, на
которые должно благоприятно действовать терапевтическое применение FGF-18 по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой анкилозирующий спондилит. Анкилозирующий спондилит (AS) представляет собой артрит с вовлечением позвоночника. Он вызывает боль и тугоподвижность
спины, а также согнутое положение. Это является результатом постоянного набухания и раздражения
суставов позвоночника (позвонков). В тяжелых случаях воспаление позвонков может в конечном итоге
вызывать их срастание, что приводит к тяжелому ограничению подвижности. Воспаление сухожилий и
связок, которые соединяют и поддерживают суставы, может вызывать боль и болезненность ребер, лопаток, тазобедренных суставов, бедер, голеней, пяток и вдоль костных точек позвоночника.
Анкилозирующий спондилит представляет собой хроническую воспалительную форму артрита, которая поражает суставы позвоночника. Отличительным признаком AS является вовлечение суставов,
лежащих в основе позвоночника, там, где позвоночник соединяется с тазом - крестцово-подвздошных
суставов (SI).
Течение заболевания весьма изменчиво, и в то время как у некоторых лиц наблюдаются лишь эпизоды преходящей боли в спине, другие лица испытывают более постоянные тяжелые боли в спине, которые приводят с течением времени к тугоподвижности позвоночника различной степени тяжести. Почти
во всех случаях заболевание характеризуется острыми болезненными эпизодами и ремиссиями (периодами, когда проблема не беспокоит).
В течение многих лет AS был известен под множеством различных названий, включая болезнь Бехтерева, ревматоидный спондилит и спондилит Мари-Штрюмпеля. С начала 70-х годов по мере накопления знаний о заболевании почти повсеместно используется термин анкилозирующий спондилит. AS является членом семейства заболеваний, которые поражают позвоночник.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой диффузный идиопатический скелетный гиперостоз.
Диффузный идиопатический скелетный гиперостоз (DISH) характеризуется избыточным ростом кости
по бокам позвонков в позвоночнике. Он также включает в себя воспаление и рост кости в местах прикрепления сухожилий и связок к кости, например, в локте, колене и пятке. Костное шпоры распространены у людей, страдающих DISH.
DISH (иногда называемый болезнью Форестье) считается формой дегенеративного артрита и характеризуется избыточным ростом кости по бокам позвонков в позвоночнике. Он также связан с воспалением и кальцификацией (ростом кости) в других областях тела, где сухожилия и связки прикрепляются к
кости, например, в локте, колене и пятке. Это может приводить в образованию костных шпор. Пяточные
шпоры, например, часто встречаются у людей, страдающих DISH.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой подагру. Подагра представляет собой тип артрита, при
котором количество мочевой кислоты, естественного продукта обмена, превышает нормальные уровни.
Вместо того, чтобы удаляться почками с мочой, как это происходит в норме, она образует кристаллы и
откладывается в суставах. Указанные отложения приводят к воспалению суставов, вызывая боль, распухание, красноту и болезненность пораженной области. Наиболее типичным является поражение сустава
большого пальца стопы, но подагра также может поражать голеностоп, колено, стопу, кисть, запястье и
локоть. Кристаллы мочевой кислоты также могут формировать отложения в других областях, таких как
области под кожей или в других мягких тканях, а также в почках или мочевыводящих путях.
Подагра обычно поражает сустав в основании большого пальца стопы. Более чем в половине случаев первичных приступов он является первым суставом, который поражается. Может поражаться почти
любой другой сустав, но суставы нижних конечностей поражаются чаще, чем суставы верхних конечностей.
В большинстве случаев первичных приступов подагры вовлекается только один сустав, и, при
должном лечении, приступ проходит за три-десять дней. Более чем у 50% лиц, переживших острый при-9-
015644
ступ подагры, в течение года будет рецидив. Со временем приступы могут происходить чаще, длиться
дольше и часто вовлекать большее количество суставов.
У некоторых лиц приступы полностью не разрешаются, и болезнь переходит в хроническую форму.
Кристаллы мочевой кислоты, отложившиеся внутри сустава и в окружающих мягких тканях, приводят к
деструктивным изменениям в суставе и вызывают постоянное воспаление.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой псевдоподагру. Псевдоподагра представляет собой тип
артрита, который вызывается накоплением кальция в организме. Псевдоподагра является результатом
накопления кристаллов кальция (дигидрата пирофосфата кальция) в суставе. Кальций образует кристаллы, которые откладываются в суставах между костями. Это вызывает распухание и боль в пораженной
области. Отложения кальция и хроническое воспаление могут вызывать ослабление и разрушение частей
структуры сустава. При псевдоподагре хрящ может начать трескаться, в нем могут образовываться дыры,
и это может вызывать еще большую боль и распухание сустава. Со временем хрящ может полностью
износиться, и кости трутся друг о друга.
Боль при псевдоподагре, в основном, является результатом того, что мышцы и другие ткани, которые помогают суставам двигаться (такие как сухожилия и связки), вынуждены работать такими способами, к которым они не приспособлены, в силу повреждения хряща. Хрящ сам по себе не имеет нервных
клеток, и, следовательно, не может ощущать боль, но мышцы, сухожилия и связки могут. После многолетней эрозии хряща кости действительно могут тереться друг о друга. Это трение костей друг о друга
еще более усиливает боль. Кости также могут утолщаться и давать патологический рост, называемый
шпорами или остеофитами, которые трутся друг о друга.
Подобно подагре, псевдоподагра может проявляться в виде внезапных, повторяющихся приступов
боли и распухания в единственном суставе.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой инфекционный артрит. Инфекционный артрит вызывает
боль и распухание суставов. Воспаление вызывается микроорганизмом. Микроорганизм может представлять собой бактерию, вирус или гриб. Обычно поражается только один сустав, хотя иногда могут
инфицироваться два или три сустава. При своевременном лечении обычно заболевание не продолжается
длительное время.
В большинстве случае инфекционный артрит поражает большие суставы (плечевые, бедренные, коленнью), но более мелкие суставы (пальцев, лодыжки) также могут вовлекаться в процесс.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой остеоартрит. Остеоартрит представляет собой наиболее
распространенную форму артрита. Его может вызывать повреждение хряща. Кусочки хряща могут отламываться и вызывать боль и разбухание в суставе между костями. Со временем хрящ может полностью
износиться, и кости будут тереться друг о друга.
Остеоартрит может поражать любой сустав, но обычно поражает кисти и суставы, несущие вес тела, такие как бедренные, коленные, суставы стопы и позвоночника.
Заболевание остеоартрит (ОА) представляет собой комплексное, многофакторное прогрессирующее
заболевание, которое по своей природе является невоспалительным и которое характеризуется общей,
связанной с возрастом деградацией суставного хряща в суставах. ОА также характеризуется активацией
хондроцитов, ведущей к пролиферации и апоптозу клеток, экспрессии протеиназ и патологическому образованию матрикса, плохому восстановлению хряща, ведущему к утрате внеклеточного матрикса, кальцификации матрикса и образованию остеофитов. Деградация хряща и внеклеточных матриксных структур приводит к усилению трения между костями и нервами пораженных суставов. ОА вызывает различные уровни боли и прогрессирующую инвалидность у лиц, страдающих данным заболеванием. В настоящее время лечение ОА является паллиативным или хирургическим.
В здоровых суставах хрящ действует как амортизатор, когда к суставу прикладывается вес. Скользкая поверхность хряща позволяет костям двигаться беспрепятственно. Когда в суставе развивается остеоартрит, хрящ постепенно становится шероховатым и тонким, а подлежащая кость утолщается.
Хотя на ранней стадии заболевания распухание обычно не наблюдается, по мере прогрессирования
артрита может возникать воспаление. Кусочки хряща могут отламываться и плавать внутри сустава. Это
раздражает другие мягкие ткани внутри сустава и может вызывать боль и распухание между костями.
Со временем, по мере стирания хряща, кости могут образовывать наросты на концах. Указанные
наросты называются шпорами. Или хрящ может стереться полностью, и тогда кости могут приходить в
непосредственный контакт друг с другом.
ОА может создавать другие проблемы, такие как: мышцы, которые поддерживают сустав на месте,
слабеют, поскольку не работают, с течением времени суставы утрачивают свою форму и вовсе перестают
работать.
ОА обычно поражает несущие вес тела суставы, такие как бедренные, коленные, суставы стопы и
позвоночника. Однако суставы, не несущие вес тела, такие как суставы пальцев и сустав в основании
большого пальца руки, также могут поражаться. Он обычно не поражает другие суставы, за исключени- 10 -
015644
ем тех, которые были повреждены, или испытывают необычные нагрузки.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой ревматоидный артрит. Ревматоидный артрит (RA) представляет собой хроническое системное аутоиммунное воспалительное заболевание, которое, главным
образом, поражает синовиальную оболочку множества суставов с последующим повреждением суставного хряща. Патогенез является зависимым от Т-лимфоцитов и связан с выработкой ревматоидных факторов, аутоантител, направленных против собственного IgG, с последующим образованием иммунных
комплексов, которые достигают высоких уровней в суставной жидкости и крови. Указанные комплексы
в суставе могут индуцировать выраженный инфильтрат из лимфоцитов и моноцитов в синовии, с последующими выраженными синовиальными изменениями; суставное пространство/жидкость инфильтрируется теми же клетками с добавлением многочисленных нейтрофилов. Пораженными тканями являются,
прежде всего, суставы, часто симметричные. Клетки воспаления высвобождают ферменты, которые могут разрушать кость и хрящ. В результате ревматоидного артрита воспаленная выстилка сустава, синовий, может инвазировать и повреждать кость и хрящ, что приводит к разрушению сустава и, помимо
прочих физиологических эффектов, к тяжелым болям. Пораженный сустав может утрачивать форму и
выстилку, что приводит к боли и ограничению движений. Таким образом, RA может приводить к тяжелой инвалидности и повышенной смертности.
Повреждение суставов может наблюдаться даже в тех случаях, когда боль не является сильной. Это
может случиться даже на ранних стадиях заболевания. У многих лиц, страдающих RA, повреждение выявляется на рентгеновских снимках кистей и стоп с течение двух лет от начала заболевания. Однако ко
времени рентгеновского выявления проблемы лечить заболевание может быть слишком поздно.
Тяжелое поражение может вызывать постоянную деформацию суставов и инвалидность. Боль и
распухание могут затруднять ходьбу.
В ревматоидных суставах местно вырабатывается ряд цитокинов. Многочисленные исследования
показали, что IL-1 и TNF-альфа, два прототипических провоспалительных цитокина играют важную роль
в механизмах, участвующих в синовиальном воспалении и прогрессирующем разрушении суставов. Действительно, введение ингибиторов TNF-альфа и IL-1 пациентам с RA вызывает резкое улучшение клинических и биологических признаков воспаления и уменьшение рентгеновских признаков эрозии кости и
деструкции хряща. Однако, несмотря на указанные обнадеживающие результаты, значительная процентная доля пациентов не реагирует на указанные агенты, что наводит на мысль о том, что другие медиаторы также принимают участие в патофизиологии артрита. Один важный способ дифференциального диагноза RA от других форм артрита заключается в образце вовлечения в процесс суставов. Например, RA
поражает запястье и многие другие суставы кисти, но обычно не поражает наиболее дистально расположенные суставы.
При RA суставы имеют тенденцию к симметричному поражению. Так, если суставы пальцев кисти
на правой руке воспалены, то суставы пальцев кисти на левой руке, возможно, также воспалятся. Другие
суставы, обычно поражаемые при RA, включают локти, плечи, шею, челюсть, стопы, лодыжки, колени и
бедра. В отличие от шеи, позвоночник обычно напрямую при RA не поражается.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой псориатический артрит. Псориатический артрит представляет собой состояние, которое вызывает распухание и боль внутри и вокруг суставов. Он также вызывает чешуйчатые высыпания на коже.
Он может поражать ряд суставов, включая пальцы, запястья, пальцы стоп, колени, лодыжки, локти
и плечевые суставы, позвоночник и суставы нижней части спины (называемые крестцово-подвздошными
суставами).
Псориатический артрит также поражает ткани, окружающие суставы, включая сухожилия и связки.
Он может вызывать распухание всего пальца, называемого "болтающимся" пальцем кисти или стопы.
Имеет место также воспаление кожи, особенно на локтях, коленях и волосистой части головы. Псориатический артрит связан с псориазом, заболеванием, при котором участки кожи воспаляются и покрываются серебристыми или серыми чешуйками.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой реактивный артрит. Реактивный артрит относится к боли, тугоподвижности, красноте или распуханию в суставе в результате имевшее место ранее инфекции.
Чаще всего он наблюдается в суставах нижних конечностей (колени, лодыжки, пальцы), но также может
наблюдаться и в верхних конечностях. Проблемы могут возникать только в суставах или вовлекать и
другие системы организма, такие как глаза, мышцы кожи или сухожилия. В случае, когда он поражает
области вне суставов, реактивный артрит называют синдромом Рейтера.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой склеродермию. Склеродермия представляет собой состояние, при котором кожа утолщается и уплотняется. Существует два основных типа склеродермии.
Один тип представляет собой локализованную склеродермию, которая поражает, главным образом, кожу. Она может также поражать мышцы и суставы. Другой тип, генерализованная склеродермия, поража- 11 -
015644
ет кожу, а также внутренние органы, такие как сердце, легкие и почки.
Наиболее характерным признаком склеродермии является образование плотной рубцовоподобной
фиброзной ткани в коже. Менее видимые изменения включают в себя повреждение клеток, выстилающих стенки мелких кровеносных сосудов. Это может, в свою очередь, повреждать основные органы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой синдром Шегрена. Синдром Шегрена представляет собой хроническое заболевание, которое вызывает поражение слюнных желез, приводящее к сухости ротовой полости, и слезных желез, приводящее к сухости глаз. Он может поражать также другие части тела,
включая суставы, мышцы и нервы, органы, такие как легкие, почки, печень, поджелудочная железа, желудок и головной мозг, или железы, такие как щитовидная железа. Синдром Шегрена может приводить к
полному разрушению любой из указанных областей. Поскольку синдром Шегрена может поражать печень и поджелудочную железу, существует более высокая вероятность развития рака лимфатической
ткани. Однако это является необычным и редким исходом заболевания. Синдром Шегрена может наблюдаться в двух видах. Существует "вторичный" синдром Шегрена, который наблюдается у лиц, имеющих
ревматическое состояние или заболевание соединительной ткани, такое как волчанки, склеродермия или
полимиозит. "Первичным" синдром Шегрена называют тогда, когда сухость глаз и ротовой полости не
связана с ревматическим состоянием.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой болезнь Стилла. Болезнь Стилла представляет собой
форму артрита, которая характеризуется лихорадкой с высокими подъемами температуры, розовой сыпью и воспалением суставов. Заболевание наиболее распространено среди детей, у которых его обычно
называют системным ювенильным идиопатическим артритом. Болезнь Стилла может также наблюдаться
у взрослых, хотя реже, чем у детей. В указанном случае ее называют поздней болезнью Стилла или
AOSD.
Как указано выше, заболевания хряща, которые можно лечить, предотвращать или облегчать лечением, описанным в настоящем документе, включают в себя рассекающий остеохондрит, реберный хондрит (такой как болезнь Титце), остеомиелит и рецидивирующий полихондрит.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой рассекающий остеохондрит. Рассекающий остеохондрит
(OCD) представляет собой термин для костно-хрящевого перелома. Костно-хрящевой фрагмент может
присутствовать in situ, не полностью отсоединенный или полностью отсоединенный. OCD представляет
собой форму остеохондроза, ограниченную эпифизом сустава. Эпифиз сустава разрушается в результате
компрессии. В патологии участвует, вероятно, как травма, так и ишемия. Травма, наиболее вероятно,
является первичным повреждением, а ишемия - вторичным.
Травма может являться результатом прямой травмы, такой как перелом в результате удара, или повторяющейся микротравмы, такой как избыточное нормальное сжимающее напряжение.
Наиболее часто поражается коленный сустав. Однако локтевой сустав, голеностопный сустав, тарзально-ладьевидный сустав, бедренный сустав, плечевой сустав, гленоидальный, запястный сустав также
могут поражаться.
OCD имеет тенденцию поражать лиц молодого возраста. Возраст пациентов с OCD локтевого сустава составляет в среднем 23 года, в пределах от 4 до 47 лет. Возраст пациентов с поражением голеностопного сустава составляет в среднем 20 лет, в пределах от 8 до 50 лет. Возраст пациентов с поражением бедренного сустава составляет в среднем 24 года, в пределах от 14 до 39 лет.
Пациенты обычно сообщают о боли при достижении пределов движения в суставе. Часто имеет место периартикулярный отек при ощущаемом при прикосновении легком тепле. При вовлечении нижней
конечности пациенты часто хромают. Симптомы обычно улучшают после защищенной иммобилизации
сустава.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой реберный хондрит. Реберный хондрит представляет собой воспаление в местах сочленений верхних ребер с хрящом, который удерживает их на грудной кости
или грудине. Причина обычно не известна. В случаях, когда боль при реберном хондрите сопровождается распуханием, его обычно называют синдромом Титце.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой остеомиелит. Остеомиелит представляет собой острый
или хронический воспалительный процесс в кости, и он возникает вторично по отношению к инфекции
пиогенными организмами.
Инфекция, связанная с остеомиелитом, может быть локализованной, или она может распространяться через надкостницу, корковый слой, костный мозг и губчатую ткань. Бактериальный патоген варьирует в зависимости от возраста пациента и механизма инфицирования.
Гематогенный остеомиелит представляет собой инфекцию, вызванную бактериальным отсевом из
крови. Острый гематогенный остеомиелит характеризуется острой инфекцией кости, вызванной отсевом
бактерий в кость из отдаленного источника. Указанное состояние наблюдается, главным образом, у де- 12 -
015644
тей. Наиболее распространенным участком является быстро растущий и богатый кровеносными сосудами метафиз растущих костей. Очевидное замедление или сладжирование кровотока по мере образования
сосудами острых углов в дистальном метафизе предрасполагает сосуды к тромбозу, а саму кость - к локализованному некрозу и бактериальному обсеменению. Острый гематогенный остеомиелит, несмотря
на свое название, может иметь медленное клиническое развитие и бессимптомное начало.
Прямой или контактный остеомиелит вызывается непосредственным контактом ткани и бактерий
во время травмы или хирургического вмешательства. Остеомиелит прямой инокуляции (контактный)
представляет собой инфекцию кости, вторичную по отношению к инокуляции организмов вследствие
прямой травмы, распространения из соседнего очага инфекции или сепсиса после хирургического вмешательства. Клинические проявления остеомиелита прямой инокуляции являются более локальными,
чем проявления гематогенного остеомиелита, и имеют тенденцию вовлекать множество организмов.
Дополнительные категории включают в себя хронический остеомиелит и остеомиелит, вторичный
по отношению к заболеванию периферических сосудов. Хронический остеомиелит персистирует или
рецидивирует вне зависимости от его первоначальной причины и/или механизма и несмотря на агрессивное вмешательство. Несмотря на упоминание в качестве этиологии заболевание периферических сосудов является скорее предрасполагающим фактором, нежели истинной причиной инфекции.
Болезненные состояния, которые, как известно, являются для пациентов предрасполагающими к остеомиелиту, включают в себя сахарный диабет, серповидноклеточную анемию, синдром приобретенного
иммунодефицита (СПИД), употребление наркотиков, алкоголизм, постоянное использование стероидов,
иммуносупрессию и хроническое заболевание суставов. Кроме того, наличие протезирующего ортопедического устройства является независимым фактором риска, как и недавние ортопедические операции или
открытый перелом.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой рецидивирующий полихондрит. Рецидивирующий полихондрит (RP) представляет собой редкое и тяжелое эпизодическое воспалительное состояние, вовлекающее хрящевые структуры, преимущественно, уха, носа и ларинготрахеобронхиального дерева. Другие поражаемые структуры могут включать глаз, сердечно-сосудистую систему, периферические суставы, среднее ухо и внутреннее ухо.
Этиология заболевания не известна; однако патогенез, наиболее вероятно, по своей природе является аутоиммунным. Данные за аутоиммунную этиологию включают в себя его клиническую связь с другими аутоиммунными расстройствами, его связь с гаплотипом HLA-DR4, патологические находки инфильтрации Т-клетками CD4 и комплексов антиген-антитело в пораженном хряще, клеточный и гуморальный ответы против коллагена типа II и других коллагеновых антигенов, и то наблюдение, что иммунодепрессантные схемы наиболее часто подавляют заболевание.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой повреждение хряща в результате травмы. Повреждения
хряща могут наблюдаться в результате травматического механического разрушения. Прямой удар или
другая травма может повреждать хрящ. Хрящ не имеет прямого кровоснабжения, и, следовательно, у
него имеются небольшие возможности к самовосстановлению. Способы по настоящему изобретению
улучшают восстановление хряща. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения повреждение хряща вследствие травмы происходит в результате несчастного случая или хирургического вмешательства. В особом варианте осуществления настоящего изобретения повреждение хряща
вследствие травмы происходит в результате хирургического вмешательства, в частности, ортопедической операции или пластической операции. Также в объем настоящего изобретения входит лечение
спортивной травмы или связанного со спортом изнашивания тканей сустава.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения заболевание хряща, которое лечат, предотвращают или облегчают, представляет собой неэстетичный дефект внешности. В указанном варианте
осуществления способ и применение по настоящему изобретению можно использовать для целей пластической хирургии.
Благодаря полному описанию настоящего изобретения специалисту будет понятно, что его можно
осуществлять с использованием широкого ряда параметров, концентраций и условий, без отступления от
идеи и объема настоящего изобретения и без ненужного экспериментирования.
Несмотря на то что изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, следует понимать, что дальнейшие его модификации являются возможными. Указанная заявка
предназначена для покрытия любых вариаций, применений или адаптаций изобретения в соответствии, в
целом, с принципами изобретения, и включая такие отступления от настоящего описания, которые соответствуют известной или обычной практике в той области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применены к главным признакам, перечисленным в настоящем документе в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Все ссылки, упоминаемые в настоящем документе, включая журнальные статьи или резюме, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США или иностранные заявки, выданные патенты
США или иностранные патенты или любые другие источники, целиком включены в настоящий документ
- 13 -
015644
в качестве ссылок, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в указанных ссылках.
Кроме того, полное содержание процитированных ссылок в ссылках, содержащихся в настоящем документе, также целиком включены в настоящий документ в качестве ссылок.
Ссылка на известные стадии способов, обычные стадии способов, известные способы или обычные
способы никоим образом не допускает, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описаны, представлены или предложены в релевантной области.
Следующее описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения настолько
полно выявит общий характер изобретения, что специалисты, руководствуясь знаниями в данной области (включая содержание ссылок, процитированных в настоящем документе), могут легко модифицировать и/или адаптировать для различных целей указанные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, без ненужного экспериментирования, без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, указанные адаптации и модификации входят в объем эквивалентов описанных вариантов осуществления на основе идеи и руководства, представленных в настоящем документе. Следует понимать, что фразеология или терминология используется в настоящем документе для целей описания, а не ограничения, таким образом, что указанная терминология или фразеология по настоящему описанию должна интерпретироваться специалистом в свете идеи и руководства, представленных в настоящем документе, в комбинации с теми знаниями, которые имеются у специалиста.
Пример 1. Модели заболеваний у животных и расширенная фармакология.
In vivo, FGF-18(170АА) изучали на различных моделях ОА и поврежденного хряща у животных, со
значительной терапевтической эффективностью при внутрисуставном (в/с) введении. Суммарная терапевтически эффективная доза 3-40 мкг в/с на животное в неделю была показана для различных видов
(крыса, собака). Результаты по указанным моделям заболевания (ОА, а также повреждения хряща) у животных суммированы ниже.
Таблица 1. Краткое изложение фармакологических исследований FGF-18(170АА)
- 14 -
015644
Таблица 2. Краткое изложение фармакологических исследований FGF-18(170АА) (продолжение)
а
Более подробно обсуждается ниже.
Пример 1.1. Модель ОА с использованием разрыва мениска у крыс.
Способ.
Самцам крыс Lewis (5-10 животных в группе) производили хирургическое вмешательство, чтобы
осуществить разрыв медиального мениска в правом коленном суставе. Введение в/с путем начинали через 19-21 день после операции в дозах 0,3, 1, 3 или 10 мкг (в физиологическом растворе), чтобы определить фармакодинамические эффекты, связанные со схемой введения. Указанные суммарные дозы вводили (i) однократной дозой, (ii) один раз в неделю (1/3 суммарной дозы на инъекцию) в течение 3 недель
или (iii) 3 раза в неделю в течение 3 недель (1/9 суммарной дозы на инъекцию).
По окончании лечения или спустя 3 недели после лечения правые коленные суставы собирали для
гистологической оценки потенциальных эффектов. Оценку повреждений осуществляли в 3 различных
зонах: региональные различия вдоль медиальной верхней суставной поверхности большеберцовой кости
определяли путем деления каждой секции на 3 зоны (1 - внешняя, 2 - средняя, 3 - внутренняя). На хирургической модели ОА внешняя (z1) и средняя (z2) трети обычно поражаются сильнее всего, а во внутренней трети (z3) имеют место более легкие изменения.
Схема лечения
Описание эксперимента.
Животным (5-10 в группе), содержавшимся по 2-3 в клетке, давали наркоз изофлюраном, и область
правого коленного сустава подготавливали для операции. Разрез кожи производили по медиальной стороне колена и тупым способом обнажали медиальную коллатеральную связку, а затем пересекали ее.
Медиальный мениск рассекали на всю толщину для имитации полного разрыва. Кожу и подкожную
клетчатку ушивали викрилом 4-0 с использованием подкожной техники. Введение внутрисуставным путем начинали на 19-21 день после операции и прекращали после введения однократной дозы или продолжали в течение 3 недель с внутрисуставными инъекциями один раз в неделю или 3 раза в неделю.
Крыс затем умерщвляли (группы 1-16) или оставляли для выздоровления в течение дополнительных 3
недель, а затем также умерщвляли (группы 17-32). За четыре часа до вскрытия всем крысам давали 50
мг/кг BRDU для мечения активно пролиферирующих клеток. Кровь собирали для получения сыворотки
непосредственно перед вскрытием и производили синовиальный лаваж правого коленного сустава. При
вскрытии правый (оперированный) коленный сустав очищали от мышц и соединительной ткани и помещали в 10% формалин с нейтральным буфером. Надколенник удаляли для лучшей фиксации суставов.
Образцы трахеи, грудины и уха также помещали в формалин.
Результаты оценки через 6 недель после операции.
- 15 -
015644
Нелеченные контроли (оценка через 6 недель после операции).
У нелеченных животных с разрывом медиального мениска, которых умерщвляли через 6 недель после операции, имела место дегенерация большеберцового хряща, которая была наиболее тяжелой на
внешних 2/3 суставной поверхности большеберцовой кости и менее тяжелой - на внутренней 1/3. Наблюдались большие остеофиты (в среднем 468 мкм). Дегенерация бедренного хряща была менее тяжелой
и более вариабельной по сравнению с дегенерацией большеберцового хряща. У животных, которые получали физиологический раствор один раз в неделю, были значимо ниже общие суммы баллов дегенерации большеберцового хряща по 3 зоне (16%), значимо ниже соотношение глубины (16%) и значимо
больше площадь жизнеспособного хряща в латеральной большеберцовой кости по сравнению с нелеченными животными (13%). У животных, которые получали физиологический раствор три раза в неделю,
были значимо ниже общие суммы баллов дегенерации хряща большеберцовой кости по 2 зоне (24%),
значимо ниже соотношение глубины (13%) и значимо больше площадь жизнеспособного хряща как в
медиальной, так и в латеральной большеберцовой кости (15 и 14%). Указанные различия между контрольными группами, вероятно, являются результатом повторных анестезий, влиявших на общую активность животных, хотя нельзя исключить и возможность того, что повторные инъекции физиологического
раствора влияли на тяжесть повреждений, облегчая удаление медиаторов и детрита.
Лечение однократной дозой (оценка через 6 недель после операции).
У животных, получавших однократную дозу 10 мкг FGF-18(170АА), имела место значимо большая
ширина общей дегенерации хряща (16%) благодаря увеличению потери протеогликанов в зоне 3. Сумма
баллов и измерения по остеофитам были достоверно увеличены (19 и 25%, соответственно) у животных,
получавших однократную дозу 10 мкг FGF-18(170AA). Площадь матрикса жизнеспособного хряща в
медиальной большеберцовой кости значимо увеличилась на 27% у животных, получавших 10 мкг. Иммунологическое окрашивание выявило иммунную положительность по бромдезоксиуридину (BRDU) в
фиброзном мозговом веществе, прилегающем к повреждениям хряща, и в клетках костного мозга, фибробластах и остеофитном хряще, при сходном характере окрашивания в суставах, в которые вводили
физиологический раствор и FGF-18(170AA). Данные результаты показывают, что однократная инъекция
10 мкг FGF-18(170AA) оказывала определенное анаболическое действие, о чем свидетельствует увеличение размеров остеофитов и площади медиального большеберцового хряща. Указанные изменения были, однако, недостаточными для того, чтобы улучшить общие суммы баллов дегенерации хряща. Возможно, что увеличение площади медиального большеберцового хряща является результатом увеличения
толщины хряща на несущей нагрузку поверхности, прилегающей к остеофиту.
Лечение один раз в неделю в течение 3 недель (оценка через 6 недель после операции).
У животных, получавших 3 мкг FGF-18(170AA) один раз в неделю, имели место значимо более
низкие суммы баллов дегенерации хряща по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор один раз в неделю, в зоне 2 медиальной большеберцовой кости. У животных, получавших 10 мкг FGF-18(170AA), имела место значимо меньшая ширина дегенерации (37%), и у животных, получавших 3 мкг (28%) или 1 мкг (15%), также наблюдалось некоторое ингибирование. Сумма
баллов и измерения по остеофитам были дозозависимыми и были достоверно увеличены при использовании 10 (32 и 53%) или 3 (21 и 32%) мкг FGF-18(170АА). Площадь матрикса жизнеспособного хряща в
медиальной большеберцовой кости значимо увеличилась при лечении с использованием 10 мкг FGF18(170AA) (27%). Хронический активный синовит с фиброзом от легкого до выраженного наблюдался у
животных, получавших 10 или 3 мкг, а у животных, получавших 1 мкг, синовит был минимальным. Резорбция субхондральной кости была минимально увеличена в нескольких суставах, леченных 10 мкг. У
животных, получавших 3 или 10 мкг FGF-18(170AA), наблюдалось увеличенное мечение BRDU в фиброзном мозговом веществе, синовии и в областях хондрогенеза или остеофитах по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор. Данные результаты показывают дозозависимое благоприятное действие лечения с использованием схемы введения один раз в неделю на значимую ширину дегенерации хряща. Указанный параметр является наиболее показательным в отношении
наличия жизнеспособного матрикса некоторого типа в области дефекта и вместе с площадями медиального большеберцового хряща, демонстрирует анаболический ответ. Результаты мечения с использованием BRDU указывают на продолжающиеся пролиферативные реакции после прекращения лечения.
Лечение три раза в неделю в течение 3 недель (оценка через 6 недель после операции).
Лечение с использованием 1, 3 или 10 мкг FGF-18(170AA), вводившегося в виде 3 инъекций в неделю, приводило к значимому уменьшению сумм баллов дегенерации большеберцового хряща по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор 3 раза в неделю в зоне 1 (животные, получавшие 10 мкг), зоне 2 (1 или 3 мкг) и зоне 3 в целом (1 или 3 мкг). Лечение с использованием 10 мкг значимо увеличивало общую ширину дегенерации большеберцового хряща на 24%. Лечение с
использованием 1 или 3 мкг незначимо уменьшало ширину дегенерации хряща на 24 и 21%, соответственно, что указывало на наличие некоторого благоприятного эффекта. Животные, получавшие 1 или 3
мкг FGF-18(170AA), также имели значимо более низкие соотношения глубины (17 и 18%, соответственно), чем контрольные животные, получавшие физиологический раствор. Сумма баллов по остеофитам
медиальной большеберцовой кости увеличивалась после лечения с использованием 0,3, 1, 3 или 10 мкг
- 16 -
015644
FGF-18 (170AA) (13, 7, 13 и 15%, соответственно), в то время как все 4 дозы (0,3, 1, 3 или 10 мкг FGF-18
(170AA)) значимо увеличивали измерения остеофитов (12, 18, 60 и 62%, соответственно). Лечение с использованием 10 мкг значимо увеличивало сумму баллов дегенерации бедренного хряща на 114%. Суммы баллов по костям значимо увеличивались после лечения 3 (60%) или 10 (88%) мкг FGF-18 (170AA).
Общая сумма баллов по суставам без бедренного значимо уменьшалась после лечения с использованием
3 мкг FGF-18(170AA) (13%), но добавление бедренного сустава к общей сумме баллов по суставам аннулировало указанное изменение. Лечение с использованием 1, 3 или 10 мкг FGF-18(170AA) значимо увеличивало площадь жизнеспособного хряща в медиальной большеберцовой кости (13, 29 и 29%), а лечение с использованием 3 или 10 мкг значимо увеличивало площадь в латеральной большеберцовой кости
(22 и 13%). В суставах, в которые инъецировали 3 или 10 мкг, наблюдался синовит от выраженного до
тяжелого, с увеличением резорбции субхондральной кости, и сходные, но от легких до умеренных, изменения наблюдались в суставах, в которые инъецировали 1 мкг. У животных, получавших 1, 3 или 10 мкг
FGF-18 (170AA), наблюдалось мечение BRDU в многочисленных областях, включая мозговое вещество,
остеофиты, мениски, синовий и области хондрогенеза. Данные результаты показывают наиболее выраженные анаболические эффекты при любой схеме лечения, но они сопровождались тяжелым синовиальным воспалением и увеличением резорбции субхондральной кости.
Результаты оценки через 9 недель после операции.
Нелеченные контроли (оценка через 9 недель после операции).
У нелеченных животных с разрывом медиального мениска, которых умерщвляли через 9 недель после операции, имела место дегенерация большеберцового хряща, которая была наиболее тяжелой на
внешних 2/3 суставной поверхности большеберцовой кости и менее тяжелой - на внутренней 1/3. Дегенерация бедренного хряща была менее тяжелой и более вариабельной. Суммы баллов в целом были
больше, чем у нелеченных животных, которых умерщвляли через 6 недель после операции. У животных,
которые получали физиологический раствор один раз в неделю, были значимо ниже суммы баллов дегенерации хряща по 2 зоне большеберцовой кости (12%), чем у контрольных животных, которые получали
физиологический раствор один раз в неделю (18%). У контрольных животных, которые получали физиологический раствор один раз в неделю, также наблюдалась значимо большая ширина умеренной дегенерации коллагена (92%). У животных, которые получали физиологический раствор один раз в неделю,
наблюдалась значимо более низкая сумма тяжелой, выраженной, умеренной и легкой дегенерации коллагена (15%); то же относится и к контрольным животным, которые получали физиологический раствор 3
раза в неделю (22%). Указанные различия были относительно незначительными, поскольку в каждой из
данных групп было только по 5 крыс, и являлись результатом вариации в прогрессировании заболевания
между индивидуумами.
Лечение однократной дозой (оценка через 9 недель после операции, включая 3 недели после лечения).
Не наблюдалось достоверного эффекта лечения у всех животных, которые получали однократную
дозу FGF-18(170АА) и были умерщвлены через 9 недель после операции, хотя в нескольких суставах, в
которые инъецировали 10 мкг, имелись признаки анаболического ответа на латеральной большеберцовой
кости.
Лечение один раз в неделю в течение 3 недель (оценка через 9 недель после операции, включая 3
недели после лечения).
У животных после лечения 10 мкг FGF-18(170AA) один раз в неделю имели место значимо более
низкие суммы баллов дегенерации хряща по зоне 1 и зоне 3 медиальной большеберцовой кости на 38 и
31%. Лечение с использованием 0,3 мкг FGF-18 (170АА) значимо уменьшало суммы баллов по зоне 2 по
сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор один раз в неделю. У
животных, получавших 10 мкг FGF-18(170AA), имела место значимо меньшая значимая ширина дегенерации хряща (38%). Соотношения глубины значимо уменьшались при лечении с использованием 10 мкг
FGF-18(170AA) (22%). Лечение с использованием 3 или 10 мкг FGF-18(170AA) значимо и идентичным
образом увеличивало суммы баллов по остеофитам (25%), но только у животных, получавших 10 мкг,
измерения остеофитов значимо увеличивались (53%). Имело место 23% значимое уменьшение общей
суммы баллов по суставам с бедренным суставом у животных, получавших 10 мкг FGF-18(170AA).
Площадь жизнеспособного хряща значимо увеличивалась у животных, получавших 10 мкг FGF-18
(170AA), как в медиальной (40%), так и в латеральной (81%) большеберцовой кости. Лечение с использованием 10 мкг FGF-18 (170AA) значимо уменьшало ширину тяжелой и минимальной дегенерации коллагена, а также объединенную ширину тяжелой, выраженной и умеренной дегенерации, и объединенную
ширину тяжелой и выраженной дегенерации. Синовиальное воспаление было минимальным в суставах, в
которые инъецировали 3 или 10 мкг, и отсутствовало при более низких дозах. Анаболические реакции
были очевидными в некоторых или во всех суставах, в которые инъецировали любую дозу. Мечение
BRDU наблюдалось, главным образом, в костном мозге и фибробластах у контрольных животных, получавших физиологический раствор, и увеличенное мечение (хрящ и остеофиты) наблюдалось в суставах, в
которые инъецировали 10 мкг. Данные результаты показывают, что восстановление хряща/анаболические реакции продолжались и после периода лечения и что синовит исчезал, хотя измерения остеофитов
- 17 -
015644
были сравнимыми на 6 и 9 неделе в суставах, леченных указанной дозой. Дозозависимый благоприятный
эффект наблюдался при использовании значимого параметра дегенерации хряща, и тяжелая потеря матрикса, по измерению дегенерацией коллагена, улучшалась.
Лечение три раза в неделю в течение 3 недель (оценка через 9 недель после операции, включая 3
недели после лечения).
Общая сумма баллов дегенерации хряща по зоне 3 большеберцовой кости значимо уменьшалась на
38% у животных, которые получали 10 мкг FGF-18(170AA) в виде трех инъекций в неделю, по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор 3 раза в неделю. Лечение с
использованием 10 мкг FGF-18(170AA) также значимо уменьшало значимую ширину дегенерации хряща
(48%). Соотношение глубины значимо уменьшалось на 27% у животных, которые получали 10 мкг FGF18(170AA). Измерения остеофитов значимо увеличивались у животных, которые получали 3 (57%) или
10 (103%) мкг FGF-18 (170AA). Лечение с использованием 1, 3 или 10 мкг FGF-18 (170AA) значимо увеличивало площадь жизнеспособного хряща в медиальной большеберцовой кости (34, 37 и 71%, соответственно), в то время как лечение с использованием 0,3 или 10 мкг FGF-18(170AA) значимо увеличивало
площади в латеральной большеберцовой кости (46 и 67%). Ширина легкой дегенерации коллагена значимо увеличивалась у животных, получавших 3 или 10 мкг FGF-18(170AA), как и ширина легкой и минимальной дегенерации, объединенная у животных, получавших 10 мкг. Легкий синовит имел место во
всех суставах, в которые инъецировали 10 мкг (разделенные дозы), и синовит от минимального до легкого имел место в суставах, в которые инъецировали 1 или 3 мкг. Анаболические реакции были очевидными при использовании 1 мкг и выше. Мечение BRDU наблюдалось, главным образом, в костном мозге и
фибробластах у контрольных животных, получавших физиологический раствор, и увеличенное мечение
(хрящ и остеофиты) наблюдалось в суставах, в которые инъецировали 10 мкг. Данные результаты показывают, что восстановление хряща/анаболические реакции продолжались и после периода лечения и что
синовит стихал по сравнению с временной точкой в 6 недель. Благоприятное действие на утрату коллагена было менее очевидным, хотя имелась определенная тенденция к меньшим измерениям для площадей с утратой от выраженной до тяжелой.
Пример 1.2. Модель ОА с использованием менискэктомии у собак.
Самок собак породы бигль (n=3 на группу), которые были подвергнуты односторонней частичной
медиальной менискэктомии на левом колене на месяц до начала лечения, лечили физиологическим раствором или 3, 10 или 30 мкг FGF-18 (170АА) однократно, один раз в неделю или три раза в неделю (разделенными по 1/3 дозами) в течение 3 недель, чтобы определить благоприятные эффекты при развившемся ОА.
Через 3 недели лечения левые коленные суставы оценивали на предмет влияния на макроскопические (n=3 на группу) и микроскопические (n=3 на группу) изменения, индуцированные менискэктомией
и на предмет анаболических эффектов. У всех собак, за исключением одной, был нормальный аппетит и
активность в течение всего эксперимента. Одна собака (YLI-8) из группы 12 погибла до умерщвления
(день 17) из-за аспирационной пневмонии, связанной с повторной анестезией для суставных инъекций.
Типичные дегенеративные изменения, характеризующиеся наличием очаговых, хорошо очерченных повреждений дегенерации хряща, имели место на медиальных большеберцовых костях у всех оперированных собак во всех группах. Бедренные повреждения наблюдались спорадически. У всех собак имело место минимальное утолщение медиальной капсулы сустава. Повреждения менисков (приблизительно 1/2
отсутствовали, обычно с восстановлением в степени от полного его отсутствия до умеренной) были
сходными во всех группах.
Микроскопическая оценка выявила, что в нелеченных или леченных носителем коленных суставах
часто имела место гипертрофия хряща с клонированием в зоне 1 уровней 1 и 2. Определенные анаболические эффекты (увеличенное клонирование, насыщенность клетками и окрашивание протеогликанов в
областях повреждения) наблюдались в коленных суставах, леченных 30 мкг (10 мкг три раза в неделю)
FGF-18(170AA), и указанные изменения были наиболее выражены на бедренных мыщелках. Менее выраженные, но все же убедительные, анаболические эффекты в некоторых коленных суставах, которые
лечили 3 раза в неделю более низкими дозами FGF-18(170АА), или в коленных суставах, которые лечили
дозами 30 или 10 мкг один раз в неделю. В случае, если указанные индуцированные FGF-18(170AA) изменения имели место, они обычно располагались в верхней от 1/3 до 1/2 хряща или в матриксе, прилегающем к более глубоким трещинам. Результаты указанного исследования продемонстрировали определенные анаболические эффекты в/с лечения с использованием 10 мкг FGF-18 (170AA) 3 раза в неделю
(всего 30 мкг в неделю) во всех коленных суставах и менее выраженные эффекты в некоторых коленных
суставах, которые лечили более низкими дозами 3 раза в неделю или дозами 30 или 10 мкг один раз в
неделю. Изменения заключались в клонировании, увеличенном синтезе протеогликанов в верхней от 1/3
до 1/2 хряща или в матриксе, прилегающем к трещинам. Легкие пролиферативные изменения в краевых
зонах наблюдались в некоторых суставах, но там не было чрезмерных изменений, подобных тем, которые наблюдались у крыс. Анаболические изменения в суставном хряще были более выраженными, чем
анаболические изменения в краевых зонах, во всех случаях. Измерения повреждения коллагена также
предполагали некоторую защиту целостности матрикса.
- 18 -
015644
Пример 1.3. Модель с передней крестообразной связкой (ACL) у собак.
Для исследований, касающихся тяжелого прогрессирующего остеоартрита, использовали модель с
передней крестообразной связкой (ACL) у собак для доклинических фармакологических исследований,
включая оценку с использованием МРТ к концу лечения и в период наблюдения. Данная модель обеспечивает данные по эффективности (гистопатологические и МРТ со временем и в период наблюдения), а
также данные по функции посредством анализа походки.
С использованием вывода считываемых данных неинвазивного МРТ уже в конце лечения было показано уменьшение повреждений хряща по сравнению с исходными данными здоровых животных (-13,3,
-7,5, -9,3 и -8,8 для носителя, 3 мкг на сустав, 10 мкг на сустав и 30 мкг на сустав, соответственно). Также
к концу терапии было показано функциональное улучшение с использованием анализа походки на платформу с измерением силы.
Анализ походки осуществляли с использованием платформы, измеряющей давление и силу
(Matscan® System, Tecscan Inc., Boston, MA, США).
Процедуры получения данных по походке.
Matscan® System включает в себя 4 дорожки-индикатора, каждая из которых имеет 2 288 считывающих элементов, заключенных в считывающую площадь 432 мм × 368 мм, обеспечивающую пространственное разрешение 1,4 sensel/см2. Указанное устройство калибровали по заранее определенному
весу в начале исследования и ту же калибровку использовали для всех собак в течение всего исследования.
Для задней конечности с индуцированным остеоартритом пиковую вертикальную скорость и площадь контакта получали при скорости рыси от 1,9 до 2,2 м/с. Скорость обеспечивали с помощью хронометра. Окно считывания походки составляло 3 с с частотой выборки 44 Гц, с получением всего 132 кадров. Первые 5 зачетных попыток получали для каждой собаки, а затем усредняли для того, чтобы охарактеризовать профиль каждой собаки в данный момент времени. Пиковую вертикальную скорость выражали как процент от веса тела (%ВТ), а площадь контакта выражали в квадратных сантиметрах (см2).
Что касается пиковой вертикальной скорости задней конечности с индуцированным остеоартритом,
полученной на рыси, модель остеоартрита у собак давала аномальную походку (неделя 4), отличную от
исходных величин (до операции). Пиковая вертикальная скорость и площадь контакта уменьшались на 4
и 8 неделе после операции, и отрицательные изменения наблюдались во всех группах (табл. 3 и 4). Однако у собак из группы IV на 8 неделе после операции имелась тенденция к менее выраженному уменьшению по сравнению с исходными величинами в сравнении с другими группами.
Таблица 3. Пиковая вертикальная скорость, полученная на рыси (в движении),
для задней конечности с индуцированным остеоартритом
a. Величины представлены как средняя ± SEM. Величины представляют собой изменения по сравнению с исходными.
b. Величины выражены как процент от веса тела (%ВТ).
- 19 -
015644
Таблица 4. Площадь контакта, полученная на рыси (в движении),
для задней конечности с индуцированным остеоартритом
a. Величины представлены как средняя ± SEM. Величины представляют собой изменения по сравнению с исходными.
b. Величины выражены в квадратных сантиметрах (см2).
Фармакологические результаты in vitro продемонстрировали специфическую активность в отношении хондроцитов (пролиферация и регенерация хряща/синтез коллагена) и отсутствие неблагоприятных
эффектов, подобных пролиферации лейкоцитов или высвобождению цитокинов различными типами клеток после воздействия FGF-18(170АА).
Пример 1.4. Исследования с использованием FGF-18, меченного радиоактивным изотопом,
[3H]FGF-18.
Уровни радиоактивности, обнаруженные в коленном суставе после внутрисуставного введения
[3Н]FGF-18, представлены в табл. 5 (в виде концентраций общей радиоактивности, выраженные в нг эквивалентах/г) и в табл. 6 (выраженные в процентах от введенной дозы); в таблицах представлены уровни
радиоактивности, определенные в леченных суставах, как в интактном коленном суставе, так и после
отбора синовиальной жидкости. Соответствующие фармакокинетические параметры в коленном суставе,
с синовиальной жидкостью или без нее, представлены в табл. 7.
Таблица 5. Концентрации общей радиоактивности в коленном суставе после однократного внутрисуставного введения [3Н]-AS902330 при заданном уровне дозы 0,24 мг/кг самцам крыс.
Результаты представлены в нг эквивалентах/г.
- 20 -
015644
Таблица 6. Восстановление общей радиоактивности из коленного сустава после однократного внутрисуставного введения [3Н]-AS902330 при заданном уровне дозы 0,24 мг/кг самцам крыс.
Результаты представлены в % от введенной дозы
Таблица 7. Параметры системного воздействия общей радиоактивности в коленном суставе после однократного внутрисуставного введения [3Н]-AS902330 при заданном уровне дозы 0,24 мг/кг самцам крыс.
Уровни общей радиоактивности в леченном суставе падали двухфазно (с конечным периодом полураспада 20 ч). Сравнимую величину получали, принимая во внимание сустав целиком без синовиальной
жидкости (16 ч). В целом, результаты показали, что общая радиоактивность распределяется из синовиальной жидкости в ткани коленного сустава. Результаты, полученные после ауторадиолюминографического анализа леченных коленных суставов, показали, что наибольшая часть радиоактивности была локализована в непосредственной близости от сустава.
Результаты ауторадиолюминографического анализа всего тела после внутривенного введения и
внутрисуставного введения [3Н]-FGF-18 представлены в табл. 8 и 9, соответственно. Концентрации общей радиоактивности в тканях и органах выражали в нг эквивалентах/г (среднее ± СО).
- 21 -
015644
Таблица 8. Концентрации общей радиоактивности после однократного внутривенного введения [3Н]AS902330 при заданном уровне дозы 0,24 мг/кг самцам крыс (группа 1).
Результаты представлены в нг эквивалентах/г (среднее + СО).
*NQ: не поддающийся количественному определению (ниже границ количественного определения)
Таблица 9. Концентрации общей радиоактивности после однократного внутрисуставного введения [3Н]AS902330 при заданном уровне дозы 0,24 мг/кг самцам крыс (группа 2).
Результаты представлены в нг эквивалентах/г (среднее ± СО).
*NQ: не поддающийся количественному определению (ниже границ количественного определения).
После внутривенного введения общая радиоактивность в крови и сыворотке достигала наивысшего
значения через 4 и 24 ч после введения, в сыворотке и крови, соответственно. Измеренный период полураспада в сыворотке составлял приблизительно 55 ч. После внутрисуставного введения средние величины общей радиоактивности медленно возрастали, достигая наивысших концентраций через 24 и 48 ч после введения, в сыворотке и крови, соответственно. Системное воздействие составляло приблизительно
- 22 -
015644
20% от установленного после внутривенного введения.
Общая радиоактивность в сыворотке была в среднем выше, чем в крови, что наводит на мысль о
том, что исходное соединение и/или его метаболиты имеют низкое сродство к кровяным клеткам, и циркулирующая радиоактивность распределяется, главным образом, в сыворотке.
Уровни общей радиоактивности в леченном суставе падали двухфазно, с конечным периодом полураспада 20 ч. В целом, результаты показали, что общая радиоактивность распределяется из синовиальной
жидкости в коленный сустав.
В целом, на основе неклинических фармакологических моделей на крысах и собаках было установлено, что особенно подходящей схемой лечения является введение лекарственного средства один раз в
неделю в течение трех недель. Эффективная доза составляла 3-30 мкг на сустав.
Пример 2. Примеры соединений FGF-18 по настоящему изобретению.
Последовательности предпочтительных соединений FGF-18 по настоящему изобретению представлены в перечне последовательностей ниже.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
- 23 -
015644
- 24 -
015644
- 25 -
015644
- 26 -
015644
- 27 -
015644
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения пациента, страдающего заболеванием хряща, включающий введение соединения
FGF-18, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в течение по меньшей мере 3 недель подряд на
цикл лечения, при этом указанные введения разделяют интервалами приблизительно по меньшей мере в
6, 7 или 8 дней.
2. Способ по п.1, в котором указанные введения разделяют интервалом приблизительно в 7 дней.
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в
течение 3 недель подряд или 4 недель подряд на цикл лечения.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором циклы лечения повторяют через 2, 4, 6 или
8 месяцев.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, который включает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов лечения
в год.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором соединение FGF-18 должно вводиться
внутрь сустава.
7. Способ по п.6, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в дозе 1-100 мкг, предпочтительно 5-40 мкг, предпочтительно 10-30 мкг на одно внутрисуставное введение.
8. Способ по п.7, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в дозе приблизительно 3, 5, 10,
15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 мкг на одно внутрисуставное введение.
9. Способ по любому из пп.1-5, в котором соединение FGF-18 должно вводиться внутривенно в дозе 50-200 мкг/кг, предпочтительно 80-120 мкг/кг на одно внутривенное введение.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором заболевание хряща представляет собой
остеоартрит.
11. Способ по п.10, в котором остеоартрит классифицирован как остеоартрит от легкого до умеренного, стадия II или стадия III OARSI, тяжелый прогрессирующий остеоартрит или и/или стадия IV
OARSI.
12. Способ по п.10 или 11, в котором остеоартрит представляет собой остеоартрит коленного сустава или остеоартрит бедренного сустава, такой как вторичный остеоартрит бедренного сустава.
13. Способ по любому из пп.1-9, в котором заболевание хряща представляет собой повреждение
хряща.
- 28 -
015644
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором соединение FGF-18 выбрано из зрелой
формы человеческого FGF-18, содержащей остатки 28-207 SEQ ID NO: 2, или FGF-18 (170AA).
15. Применение соединения FGF-18 для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, страдающего заболеванием хряща, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в течение по
меньшей мере 3 недель подряд на цикл лечения, при этом указанные введения разделяют интервалами,
приблизительно по меньшей мере в 6, 7 или 8 дней.
16. Применение по п.15, в котором указанные введения разделяют интервалом приблизительно в 7
дней.
17. Применение по п.15 или 16, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в течение 3 недель
подряд или 4 недель подряд на цикл лечения.
18. Применение по любому из пп.15-17, в котором циклы лечения повторяются через 2, 4, 6 или 8
месяцев.
19. Применение по любому из пп.15-18, которое включает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов лечения в год.
20. Применение по любому из пп.15-19, в котором соединение FGF-18 должно вводиться внутрь
сустава.
21. Применение по п.20, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в дозе 1-100 мкг, предпочтительно 5-40 мкг, предпочтительно 10-30 мкг на одно внутрисуставное введение.
22. Применение по п.21, в котором соединение FGF-18 должно вводиться в дозе приблизительно 3,
5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 мкг на одно внутрисуставное введение.
23. Применение по любому из пп.15-19, в котором соединение FGF-18 должно вводиться внутривенно в дозе 50-200 мкг/кг, предпочтительно 80-120 мкг/кг на одно внутривенное введение.
24. Применение по любому из пп.15-23, в котором заболевание хряща представляет собой остеоартрит.
25. Применение по п.24, в котором остеоартрит классифицирован как остеоартрит от легкого до
умеренного, стадия II или стадия III OARSI, тяжелый прогрессирующий остеоартрит или и/или стадия IV
OARSI.
26. Применение по п.24 или 25, в котором остеоартрит представляет собой остеоартрит коленного
сустава или остеоартрит бедренного сустава, такой как вторичный остеоартрит бедренного сустава.
27. Применение по любому из пп.15-23, в котором заболевание хряща представляет собой повреждение хряща.
28. Способ по любому из пп.15-27, в котором соединение FGF-18 выбрано из зрелой формы человеческого FGF-18, содержащей остатки 28-207 SEQ ID NO: 2, или FGF-18 (170AA).
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 29 -