Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
реклама
Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКОСТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ А.И. Евдокимова» На правах рукописи Золотухина Ирина Алексеевна Функциональная морфология эпителия ворсин плаценты в разные сроки неосложненной беременности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л.М. Ерофеева Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ А.П. Милованов Москва – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………………………………………….4 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………………………………….5 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Становление эпителия ворсин и его производных структур в течение физиологической беременности ........................................................................................ 12 1.1. Развитие ворсинчатого дерева .................................................................................... 12 1.2. Щеточная кайма синцитиотрофобласта ................................................................. 18 1.3. Щелочная фосфатаза ....................................................................................................... 20 1.4. Синцитиотрофобласт и его производные структуры ....................................... 23 1.4.1. Структурно-­‐функциональная характеристика ................................................ 23 синцитиотрофобласта ............................................................................................................. 23 1.4.2. Производные синцитиотрофобласта…………………………….…………………………..……….……………………27 1.5. Цитотрофобласт ................................................................................................................. 29 1.6. Базальная мембрана трофобластического эпителия ........................................ 30 1.7. Современные представления о различных типах питания ............................ 32 эмбриона и плода ....................................................................................................................... 32 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................... 34 2.1. Группы исследуемого материала ............................................................................... 34 2.2. Особенности взятия материала ................................................................................... 35 2.3. Гистологический и электронно-­‐микроскопический методы ........................ 35 2.4. Иммуногистохимический метод ................................................................................. 36 2.5. Морфометрический метод ............................................................................................. 37 2.6. Статистическая обработка ............................................................................................ 38 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ Структурно-­‐функциональные изменения эпителия ворсин и его производных в течение неосложненной беременности .......................................... 39 2 3.1. Ворсинчатое дерево плаценты на 4 неделе гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 39 3.2. Ворсинчатое дерево плаценты на 5 неделе гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 45 3.3. Ворсинчатое дерево плаценты на 6 неделе гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 53 3.4. Ворсинчатое дерево плаценты на 7 неделе гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 60 3.5. Ворсинчатое дерево плаценты на 8 неделе гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 67 3.6. Ворсинчатое дерево плаценты на 9 -­‐ 10 неделях гестации после оплодотворения ......................................................................................................................... 74 3.7. Ворсинчатое дерево плаценты на 18 -­‐ 24 неделях гестации после менструации ................................................................................................................................. 84 3.8. Ворсинчатое дерево плаценты на 39 -­‐ 40 неделях гестации после менструации ................................................................................................................................. 91 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ ......................................................... 100 ВЫВОДЫ ....................................................................................................................................... 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................... 115 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БМ - базальная мембрана ИГ- инвагинации М - митохондрии МК – микроворсинки МЭ – микроэндоцитозные пузырьки ПМ – плазмолемма ПЩФ - плацентарная щелочная фосфатаза β-ХГЧ - хорионический гонадотропин человека СГ- секреторные гранулы СТ – синцитиотрофобласт СКМ - синитиокапиллярная мембрана ЦТ – цитотрофобласт ЩК - щеточная кайма 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Плацента является провизорным органом, обеспечивающим развитие эмбриона, плода и рождение жизнеспособного ребенка. Ее весьма разнообразные физиологические функции направлены на поддержание полноценного материнского-плодного обмена, включающего не только доставку плоду энергетических веществ и выведения продуктов обмена, но и защиту его от вредных влияний матери и внешней среды. Плацентой осуществляются газообмен, синтез белков, продукция и транспорт гормонов, депонирование биологически активных веществ и токсинов, а также выделительная функция, наряду с коррекцией свертывающей системы крови и иммунной регуляцией в системе мать — плод. Во время физиологической беременности в системе мать-плацента-плод складывается многокомпонентная сбалансированная система гемостаза [9, 10]. Важная роль в регуляции местного гемостаза принадлежит, так называемой, щеточной кайме синцитиотрофобласта ворсин [32, 33]. В зоне микроворсинок находятся множество рецепторов к IgG, трансферрину, плазмину, тромбину, гепарину, аннексин плацентарный протеин-1), тромбомодулин, V (антикоагулянтный и другие белки, которые обладают тромболитическим свойством, предупреждая свертываемость материнской крови. Плацентарные факторы регуляции гемостаза действуют на уровне поверхности синцитиотрофобласта. Состояние физиологичной гиперкоагуляции, омывающей ворсины материнской крови, нейтрализуется многими плацентарными факторами. Одни из них предупреждают адгезию и агрегацию тромбоцитов матери (оксид азота, простациклин, простагландины), инактивируют тромбин и тем самым препятствуют тромбообразованию, другие - нейтрализуют действие коагулирующих факторов (простациклин), образуют иммуноинертный слой между кровью матери и гликокаликсом эпителия ворсин, блокируют 5 способность к реакциям коагуляции (аннексин V). Существование устойчивой системы гемостаза в системе мать – плацента - плод, в которой коагулянтное и антикоагулянтное звено уравновешивают друг друга, зависит от структурной целостности слоя гликокаликса, щеточной каймы и составляющих ее микроворсинок синцитиотрофобласта. В зоне щеточной каймы располагаются разнообразные биологически активные вещества, в том числе тромбомодулин, простациклин, простагландины PG12 и PGE, а так же специфическая термостабильная плацентарная процессам щелочная транспорта фосфатаза веществ (ПЩФ), через которая плацентарный способствует барьер [124], активирует ферменты для многих метаболических процессов [87, 158], участвует в клеточной пролиферации и дифференцировке тканей [60] регулирует систему гемостаза [15], участвует в активации факторов роста и, возможно, сама обладает такими свойствами [159], принимает участие в клеточной пролиферации [60], осуществляет транспорт IgG к плоду [122, 162]. В физиологических условиях ПЩФ, наряду с β-ХГЧ, плацентарным лактогеном, специфическим трофобластическим β-гликопротеином беременных, относят к маркёрам дифференцировки трофобластического эпителия [119, 132, 154]. В том числе ПЩФ является достоверным иммуногистохимическим маркером щеточной каймы и характеризует ее функциональную активность в целом. В большинстве исследований работ, с помощью иммуногистохимических иммунопозитивное окрашивание антител к ПЩФ было выявлено в плазмолемме апикальной части синцитиотрофобласта и в единичных работах - в плазмолемме базальной части цитотрофобласта ворсин плаценты [115]. Вместе с тем в литературе имеются отдельные публикации показывающие, что ПЩФ обнаруживается в плацентарной ткани на 7 неделе нормальной беременности, к 12-13 неделям ПЩФ 6 увеличивает концентрацию, что связывают с ее ролью в плодноматеринском метаболизме [141]. Таким образом, анализ литературы показал, что до настоящего времени остается неясным главный вопрос, на каком сроке возникают микроворсинки (щеточная кайма) синцитиотрофобласта и когда они начинают синтезировать ПЩФ, что напрямую является маркером начала интенсивного гемохориального кровотока. В многочисленных работах, посвященных изучению плаценты, эти важные моменты описываются фрагментарно по отдельным срокам беременности, часто без указания срока гестации, либо используются разные методы исследования, что не позволяет сравнить представленные данные и не дает целостного представления о динамике становления эпителия ворсин. Однако, такие данные чрезвычайно важны для понимания жизнеобеспечения эмбриона в период формирования плаценты, а также для выяснения механизмов ранних потерь беременности. В этой связи актуальной задачей является определение сроков перестройки трофобластического эпителия ворсин плаценты в течение физиологической беременности. Цель исследования Представить комплексную картину развития всех компонентов эпителия ворсин плаценты на разных сроках гестации в течение физиологической беременности. Задачи исследования 1. Изучить трофобластического динамику ветвления и структуру эпителия от стадии ветвистого хориона до завершения беременности. 7 ворсин 2. Определить площадь трофобластического эпителия ворсин и изучить иммуногистохимические особенности основных его компонентов с помощью антител против ПЩФ, β- ХГЧ и Ki 67. 3. Изучить динамику структурных преобразований и секреторную активность цито- и синцитиотрофобласта на разных сроках гестации. 4. Показать количественные и морфофункциональные особенности производных трофобластического эпителия – свободных симпластов и синтициальных почек на разных сроках гестации. Научная новизна Впервые изучена динамика морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты (цитотрофобласта и синцитиотрофобласта), а также его производных: свободных симпластов и синтициальных почек. Выделены 5 этапов в течение всего периода морфогенеза плаценты. Впервые показана динамика структурного становления щеточной каймы и составляющих ее микроворсинок на протяжении всей беременности. С помощью иммуногистохического исследования уточнены сроки появления ПЩФ, ее распределение в трофобластическом эпителии и периоды максимальной экспрессии в течение всей физиологической беременности. Впервые с помощью электронной микроскопии изучена динамика адаптационных преобразований базальной части трофобласта ворсин плаценты на разных сроках гестации, в особенности в первом триместре. Показано образование и усложнение инвагинаций плазмолеммы цитотрофобласта по типу базального лабиринта, а также образование отростков базальной части трофобластического эпителия, покрытых базальной мембраной и внедряющихся в строму ворсин плаценты. 8 Теоретическая и практическая значимость работы Полученные данные о сроках появления микроворсинок щеточной каймы, инвагинаций плазмолеммы базальной части трофобластического эпителия и динамике их развития существенно дополняют имеющиеся сведения о морфогенезе плаценты и процессах ее адаптации к меняющимся потребностям эмбриона и плода на разных этапах гестационного периода и могут быть использованы при анализе результатов научных исследований по проблемам морфофункционального состояния плаценты, а так же для понимания причин и механизмов возникновения патологий, таких как самопроизвольное прерывание беременности, «замершая» беременность, связанных с нарушением трофики плода. Результаты исследований могут послужить основой для разработки новых методов диагностики и лечения осложнений беременности. На основании иммуногистохимических и ультрамикроскопических особенностей гестационной перестройки хориальных ворсин в морфогенезе плаценты выделены 5 периодов с уточнением сроков, что может быть использовано при оценке состояния плаценты в клинической практике. Новые сведения о производных трофобластического эпителия синцитиальных почках и свободных симпластах расширяют представления о их структуре и значении. Материалы исследования могут быть использованы в научных целях, при составлении руководств, а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении занятий по гистологии и эмбриологии, патологической физиологии и анатомии, биохимии, акушерству и гинекологии в высших учебных медицинского профиля. 9 заведениях биологического и Основные положения, выносимые на защиту 1. Динамика морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты соответствует его функциональной специализации и включает преобразования цито- и синцитиотрофобласта, заключающиеся в формировании щеточной каймы и инвагинаий плазмолеммы в базальной части, а также образование синцитиальных почек и свободных симпластов. 2. Особенности ультраструктурной организации эпителия ворсин, иммуногистохимические показатели (интенсивность экспрессии щелочной фосфатазы, β-фракций хорионического гонадотропина), а также пролиферативная активность эпителия являются важными характеристиками фетоплацентарного комплекса. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии человека, в практическую работу на кафедре патологической анатомии и в научную работу кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико- стоматологический университет имени А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Апробация работы Результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на научно-методическом заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2009); научнопрактической конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях» (Витебск, 2009); Х Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); IX Всероссийской университетской научно-практической 10 конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010); III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Югра-Эмбрио-2011. Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (ХантыМансийская государственная медицинская академия, 2011); научно- методической конференции кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, кафедры нормальной анатомии, кафедры патологической анатомии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И.Евдокимова (май, 2014). Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. 11 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Становление эпителия ворсин и его производных структур в течение физиологической беременности 1.1. Развитие ворсинчатого дерева Степень развития ворсинчатого дерева плаценты определяется потребностями растущего эмбриона и впоследствии - плода. В середине имплантации вокруг погрузившейся в эндометрий бластоцисты (8 – 9-й день п.о.) образуются выросты трофобласта, которые представлены синцитиотрофобластическим комплексом, инвазирующим вглубь эндометрия с повреждением стенок материнских капилляров. Синцитиотрофобластический комплекс обладает высокой протеолитической активностью, вызывающей образование полостей эндометрия, куда проникают эритроциты матери из эррозированных сосудов [164]. Возникает контакт между инвазирующим цитотрофобластом (ЦТ) и клетками эндометрия, которые в момент имплантации имеют на своей поверхности определенные белки – интегрины [117]. Образуются контакты между клетками эпителия материнского организма и клетками, имеющими антигены отца [67], это обеспечивает успешную инвазию [24]. Такое строение соответствует преворсинчатой или лакунарной стадии развития ранней плаценты. Начало периода плацентации характеризуется возросшей пролиферацией ЦТ, который из стенки зародышевого мешка проникает в сторону лакун и образует между ними клеточные колонны или первичные ворсины (13 – 14 день гестации п.о.), покрытые сначала прерывистым, а затем сплошным слоем синцитиотрофобласта. Тем самым устанавливается окончательная специализация цито- и синцитиотрофобласта: первый 12 активизирует свои инвазивные способности, а второй - становится типичным покровным эпителием. На 16 – 17 день гестации из клеточных колонн формируются вторичные ворсины путем «вторжения» в них клеток мезенхимы из стенки хориального мешка. Эти ворсины принято называть мезенхимальными по их единственному компоненту стромы [10]. В развитии ранней плаценты 20 – 21 сутки гестации представляют особое значение, так как в это время в строме мезенхимальных ворсин появляются первые капилляры, путем аутохтонного развития из мезенхимальных клеток стромы [61]. Появление капилляров в строме мезенхимальных ворсин свидетельствует об их трансформации в третичные (или васкуляризованные) ворсины. Некоторые авторы [99, 100, 101] предполагают следующую последовательность образования новых ворсин: скопление ядер синцитиотрофобласта (СТ) с центральным блоком из ЦТ → образование почки из соединительной ткани → мезенхимальная ворсина с первыми капиллярами → промежуточные незрелые ворсины (I и II триместры) → зрелые промежуточные ворсины (III триместр) → терминальные ворсины (конец III триместра). На 5–6-й ворсинчатого неделях дерева в прослеживается длину; преимущественный появляются протяженные рост ворсины эмбрионального типа, с небольшими ответвлениями возле хориальной пластинки или в дистальных концах. На серийных срезах плаценты данного срока опорные ворсины представлены 12 генерациями ветвления дихотомического типа [110]. Эпителиальный пласт в этих генерациях тоньше, чем в мезенхимальных ворсинах, но он сохраняет двухслойный характер, хотя ЦТ ворсин встречается реже; появились участки, где непосредственно к базальной мембране примыкает СТ. Он обладает высокой активностью: множество ветвистых микроворсинок, темных 13 гранул в цитоплазме, образование выростов с концентрацией в них до 1520 ядер [10]. 7–8-я недели гестации характеризуются ветвлением ворсинчатого дерева на опорные и боковые ветви. Эпителий ворсин имеет очаговый двухслойный характер, причем в мелких ветвях отмечены явные признаки пролиферативной активности ЦТ ворсин. Синцитиотрофобласт – главный по толщине элемент эпителия ворсин, на его поверхности много нежных микроворсинок, которые образуют так называемую щеточную кайму, видимую в световом микроскопе на большом увеличении [97]. В период с 9 по 10 неделю гестации появляется множество боковых ветвей, отходящих от опорных ворсин. По данным литературы [110], в 9недельной плаценте каждая опорная ворсина дает в среднем 23-24 генераций, что в 2 раза больше, чем при сроке 6 недель. Преобладающий тип этих ворсин отличается от эмбриональных рядом структурных особенностей. Они меньше по диаметру и толщине эпителиального покрова, за счет того, что слой ворсинчатого ЦТ становится прерывистым и очень тонким. СТ содержит много неравномерно расположенных ядер, темных секреторных гранул и развитую сеть микроворсинок, что в целом свидетельствует об высокой функциональной активности ворсин плаценты. На 18 - 24 неделях ворсинчатое дерево отличается интенсивным ростом ветвей в длину и дифференцировкой их на три типа: 1) опорные, 2) промежуточные незрелые, 3) промежуточные дифференцированные ворсины. Доминирующим типом становятся промежуточные незрелые ворсины, с появлением первых промежуточных дифференцированных ветвей. Эпителиальный покров тоньше, чем в предыдущий период. Истончается СТ, происходит смещение его ядер в отдельные участки цитоплазмы, происходит формирование синцитиальных почек. Уменьшается количество ЦТ ворсин в составе эпителия, наблюдаются 14 клетки промежуточного и светлого типа. Клетки темного типа исчезают, их природа и функция неизвестна [94], их цитоплазма содержит большое количество электронноплотных митохондрий и узких цистерн эндоплазматической сети, большое количество свободных рибосом и группы цитоплазматических филаментов; видны капли секрета и единичные гранулы гликогена, т.е. они не являются дегенерирующими. По данным некоторых авторов [10] темные клетки ЦТ ориентированы главным образом на синтез компонентов новообразованной базальной мембраны (ламинин, коллаген IV типа) вокруг многочисленных отростков ЦТ, внедренных в строму ворсин. Избыточная по протяженности базальная мембрана эпителия (ее толщина составляет 0,30 ± 0,022 мкм) в дальнейшем расправляется при увеличении диаметра ворсин и появлении дополнительных ветвей. Доказательством этой гипотезы может служить четкая иммунопозитивная реакция в срезах на коллаген IV типа, при которой выявляется зубчатый характер базальной мембраны. По данным некоторых авторов [8] базальная мембрана эпителия не отличается по характеру дисперсности от таковой на 4 месяце гестации, а средняя его толщина равна 0,29 ± 0,017 мкм. Для данного отрезка гестации предлагается понятие "укороченная эпителиально-капиллярная дистанция". По стереогистометрическим данным [129] в серии нормальных плацент (с 23-й по 31-ю неделю) гармоническая площадь барьера достоверно уменьшилась до 3,15-3,46 мкм2 (эпителий) и 1,9-2,27 мкм2 (строма), а общая расчетная диффузионная способность плаценты увеличилась в 2-3 раза: у плодов мужского пола до 14,9 мл/мин/кПа, женского пола до 2,5 мл/мин/кПа. Средний калибр ворсин уменьшается и равен в этом периоде 150 мкм, а общая поверхность ворсинчатого дерева, напротив, увеличивается и составляет 1,48м² и средняя эпителиально-капиллярная дистанция равна 22,4 мкм [8]. Описанные преобразования плаценты по данным литературы соответствуют второй волне цитотрофобластической инвазии, в результате 15 реализации которой происходит прирост маточно-плацентарного кровообращения, что объясняет интенсивное прибавление массы плода и основных органов. Интенсивный рост ворсин, а также их капилляров связан с изменением в кислородном напряжении, который запускает механизмы ангиогенеза и факторов роста [20, 59, 76, 104, 105, 136]. Среди этих факторов особое значение имеет сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста плаценты (PlGF). В конце II образом триместра ворсинчатое дерево представлено главным разветвленной системой опорных и промежуточных дифференцированных ворсин с первыми генерациями терминальных ветвей. Доношенная плацента имеет ярко выраженное дольчатое строение. Структурно-функциональной единицей плаценты является котиледон. Зрелая плацента состоит из 25-30 котиледонов, каждый из которых представлен древовидным ветвлением опорной ворсины I порядка, отходящими от нее опорными ворсинами II порядка, III порядка, промежуточными дифференцированными ворсинами от которых отходят терминальные ворсины [10]. Эпителиальный покров крупных опорных ворсин чаще всего истончен, он однослойный, нередко с обширными дефектами, закрытыми фибриноидом. Боковые мелкие ветви обычно отсутствуют. От них почти параллельно хориальной пластинке ветвятся длинные опорные ворсины II порядка, калибром от 500 до 1000 мкм. В их составе происходит переход плодных артерий в артериолы, вен — в венулы за счет истончения мышечной оболочки. Стволовые ворсины III порядка (диаметром 160—500 мкм) окружают центральную полость котиледона. В их строме обычно видна одна артериола и одна венула в плотном коллагеновом теле. Эпителий обычно однослойный, ядра синцитиотрофобласта распределены равномерно. Все стволовые ворсины составляют примерно 20% в микропрепаратах ткани доношенной плаценты. 16 Промежуточный уровень ветвления ворсинчатого дерева представлен многочисленными мелкими веточками калибром 70—150 мкм, которые отходят от опорных ворсин II и особенно III порядка. Главной их особенностью является наличие разветвленной капиллярной сети в строме. По общепринятой классификации [99], они называются промежуточными зрелыми ворсинами. Терминальные (или концевые, резорбтивные) ворсины — самая многочисленная разновидность в доношенной плаценте (около 45—50 % всех ворсин). Диаметр их колеблется от 30 до 80 мкм. Именно этот вид ворсин обеспечивает кислородом растущий плод в конце беременности. Рост сосудов в ворсинчатом дереве регулируется местной концентрацией кислорода, который в свою очередь стимулирует рост эндотелиальных клеток. Это происходит благодаря кислородному воздействию на васкуло-эндотелиальный фактор и на ангиопоэтин 2 [53]. Следовательно, распределение перечисленных типов ворсин далеко не случайно, оно строго соответствует их функциональной специализации. Все крупные ветви и якорные ворсины играют главным образом опорную роль, составляя каркас котиледона вокруг центральной полости. Промежуточные и многочисленные терминальные ветви формируют условную стенку котиледона и являются основным местом диффузионных процессов. Важно также подчеркнуть, что, кроме вышеописанной плацентарной части, в состав котиледона входит также материнский (маточно-плацентарные артерии и вены, децидуальные клетки базальной пластинки) и смешанные компоненты (септы, полосы фибриноида Рора и Нитабух). Для более полной расшифровки функциональной морфологии плаценты важно подробнее остановиться на строении терминальных ворсин, которые появляются на 23—24-й неделе гестации и последовательно увеличиваются в числе к 36-й неделе. Далее до момента родов, не прибавляя в количестве, они претерпевают существенную 17 трансформацию, способствующую усилению процессов диффузии газов и питательных веществ от матери к плоду. Некоторые авторы [10] их разделяют на две специализированные разновидности: ворсины. терминальные Терминальные и терминальные ворсины составляют весомую часть ворсинчатого дерева на 8 и 9 месяцах гестации. В доношенной плаценте они покрыты преимущественно синцитиотрофобластом, но более 20 % их поверхности занимают двухслойные участки с подлежащим цитотрофобластом. Их строма содержит до 5—8 капилляров, в которых встречаются синцитиокапиллярные мембраны. Происходит структурная специализация мелких ворсин, которые максимально адаптированы для диффузии. Терминальные специализированные ворсины в доношенной плаценте составляют примерно 20% всех ворсин. Их диагностика и количественная оценка, так как они являются своеобразным маркером зрелости ворсинчатого дерева, и максимум их формирования приходится на 38—40ю недели. По данным некоторых авторов [33], в конце беременности общая поверхность всех ворсин составляет — 12,5м2. Плацентарный барьер представлен микровезикулами тонкого, безъядерного синцитиотрофобласта, общей базальной мембраной и истонченным отростком эндотелиоцита плодного капилляра. Конечный этап становления плацентарного барьера — истинная синцитиокапиллярная мембрана. Таким образом, формирование плацентарного барьера идет в направлении укорочения пути транспорта, что подтверждено в исследованиях многих авторов [1, 8, 10]. 1.2. Щеточная кайма синцитиотрофобласта Впервые «щеточная кайма» СТ была описана отечественным морфологом Кащенко Н.Ф. [97]. Вся поверхность синцитиотрофобласта полностью покрыта микроворсинками, которые представляют собой 18 самую большую синтициальных зону материнско-фетального повреждений они беременности микроворсинки максимальных величин на контакта, отсутствуют изменяются 10-11-й [47]. по неделях, в В высоте, а затем местах течение достигая постепенно укорачиваются [47]. В основном они имеют цилиндрическую форму, реже булавовидную, лопатковидную форму [79]. Сканирующая электронная микроскопия показала, что беременности распределены микроворсинки на на поверхности ранних стадиях синцитиотрофобласта хаотично и придают его поверхности «зубчатый» контур [47]. Изучению микроворсинок посвящено несколько крупных работ [161, 166]. Морфологические исследования структуры микроворсинок и их функционального значения были представлены рядом авторов [23, 40, 41, 47, 71, 79, 166, 170]. Микроворсинки являются объектом многочисленных гистохимических [42, 144, 153] и морфометрических исследований [163]. Микроворсинки покрыты гликозаминогликанами, гликокаликсом, гиалуроновой представленным кислотой, а также гликосфинголипидами, олигосахаридами и остатками сиаловой кислоты [94]. Рядом авторов на поверхности микроворсинок были обнаружены: щелочная фосфатаза [96, фосфолипидосвязывающий свойствами материнской и 124], аннексин протеин, нейтрализующий крови по мере V обладающий нарастающую развития – Ca зависимый антикоагулянтными гиперкоагуляцию беременности [101], галактозилтрансфераза [135], мембранный белок, отвечающий за транспорт глюкозы (GLUT-3) [43], cc-амилаза [69]; протеинкиназа [22], Ca-ATФ-аза [125], цикло 3,5-нукулеотид фосфатаза [126], и 5-нуклеотидаза [124]. Анализ поверхностных рецепторов, вовлеченных в трансплацентарную передачу помог достичь понимания тонких механизмов транспорта через плацентарный барьер [51, 86, 93, 102, 112, 166]. Рецепторы группируются на плазматической мембране синцитиотрофобласта, поэтому одна из 19 основных функций синтициальных микроворсинок – увеличение поверхности мембраны, содержащей многочисленные рецепторы [139, 151]. 1.3. Щелочная фосфатаза Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ), источником которой в организме матери является плацента, синцитиотрофобласт, эндотелий новообразующихся сосудов [103], а также эндоцервикс и фаллопиевы трубы, относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом [3, 70, 169]. Синтез ПЩФ стимулируется эстрогенами [3, 34, 70, 143]. ПЩФ – термостабильная плацентарная щелочная фосфатаза состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 66 кД [82]. Различают 6 общих фенотипов ПЩФ (S, FS, F, I, SI и FI) согласно их изоэлектрической подвижности в крахмальном геле: S - медленная, F быстрая и I – промежуточная [68, 95]. Три общих аллеля ответственны за 97,5% плацентарных фенотипов, в связи с чем, частота редких аллелей достигает 2,5%. Это приводит к появлению редких гибридных фенотипов. Так, при исследовании 5000 плацент разных рас людей выявлено 48 фенотипов ПЩФ [3, 31, 111]. Ещё большее многообразие вариантов ПЩФ может быть выявлено с помощью моноклональных антител [130]. Исследование ДНК и энзимного полиморфизма ПЩФ используется при изучении популяционных отличий [31, 111, 130]. По вопросу о месте локализации ПЩФ в плаценте в литературе нет единого мнения. По данным одних авторов ПЩФ экспрессируется в микроворсинках синцитиотрофобласта [141] и является маркером их появления и функциональной активности. По данным [124] в доношенной плаценте ПЩФ локализуется на мембране щеточной каймы, где напрямую контактирует с материнской кровью и обладает способностью подавлять агрегацию тромбоцитов [77]. Также имеются сведения, что ПЩФ 20 локализуется в пиноцитозных пузырьках СТ и ЦТ, слабая активность ПЩФ наблюдается на базальных цитоплазматических мембранах СТ и ЦТ [115], а также эндотелии капилляров ворсин [107]. Сроки ее появления по разным данным также сильно отличаются. Так, по данным одних авторов [141] она появляется на 7-й неделе гестации, по данным других [148] - с 8-й недели. По мнению некоторых авторов ПЩФ имеет тенденцию уменьшаться к середине первого триместра и появляться снова только в середине второго триместра [124]. Высокая активность ПЩФ во II и III триместрах беременности, объясняется тем, что ПЩФ облегчает мобилизацию кальция из материнской крови в скелет плода, что как раз и приходится в этот период [30, 83]. ПЩФ регистрируется в сыворотке крови у 6,4% беременных женщин на 3-4-й неделях беременности, к моменту родов (39 - 40 недель п.м.) у 100% женщин присутствует в количестве 8-16 ЕД Боданского (до 20-32 ЕД - в отдельных случаях), при этом выявляются, как правило, обе изоформы ПЩФ - F и S. Диапазон титра ПЩФ в сыворотке крови у женщин I триместра беременности колеблется от 4 до 8 ЕД в 88% случаев. Это количество считается необходимой концентрацией для нормального протекания беременности. К моменту родов количество ПЩФ увеличивается в большинстве случаев в 2 раза (титр до 16-32 ЕД), что также, вероятно, является показателем компенсированного гомеостаза в системе «мать-плод» [3, 11, 13, 15]. Вместе с тем, активность общей и термостабильной ПЩФ в плазме крови матери не всегда коррелирует с активностью данных форм, определяемых в экстрактах ворсинчатого хориона. Определение активности и изучение изоформенного спектра ЩФ в ткани ворсинчатого хориона на разных сроках беременности может дать более достоверную дифференцировки информацию регуляторно - и метаболических 21 послужит критерием процессов уровня фето- плацентарного комплекса, а также поможет судить о формировании патологии во время внутриутробного развития [1, 7]. В течение беременности экспрессия ПЩФ регулируется таким образом, что до 10-й нед. беременности в плаценте присутствует ПЩФ, похожая по свойствам на печеночную ЩФ взрослого человека, на 10-13-й нед. обнаружен плацентарный изоэнзим, а к 14-й нед. ПЩФ высоко активна. Вероятно, печёночная ЩФ является филогенетически более древней, а ПЩФ - более поздним продуктом эволюции, т.к. встречается только у некоторых приматов и человека [13]. Промежуточное положение занимает схожая с ПЩФ по аминокислотному составу, антигенным свойствам и чувствительностью к L-фенилаланину, но менее термостабильная - тонкокишечная ЩФ человека [34, 68, 130]. Таким образом, функция ПЩФ в организме матери представляется неоднозначной. Видимо, этот энзим, участвуя в дефосфорилировании различных соединений, является активным ключевым ферментом многих метаболических процессов в быстрорастущих тканях плода, для обеспечения которых обычных гидролаз было бы недостаточно [15, 31, 87, 158]. Кроме того, ПЩФ принимает участие в активации факторов роста и, возможно, сама обладает такими свойствами [159]. Участвует в клеточной пролиферации, в том числе и в дифференцированных тканях [60]. Есть также указания на то, что ПЩФ может играть роль активатора плазминогена, что очень важно для регуляции системы гемостаза беременных и рожениц, у которых, как правило, отмечается гиперкоагуляция [15]. Также ПЩФ осуществляет транспорт IgG к плоду [31, 122, 162]. В физиологических условиях ПЩФ, наряду с β-ХГЧ, плацентарным лактогеном, специфическим трофобластический β- гликопротеином беременных, относят к маркёрам дифференцировки трофобластического эпителия [2, 119, 154]. Имеются предположения о том, что ПЩФ при неосложненной беременности принимает участие в 22 регуляции системы гемостаза, усиливает гиперкоагуляцию в момент изгнания плода, способствуя остановке послеродового кровотечения и резорбции фибрина в посткоагуляционной фазе [15]. Плацентарная щелочная фосфатаза является маркером осложнения течения беременности. Так, некоторые авторы указывают на уменьшение концентрации ПЩФ в плацентарной ткани при пузырном заносе [154]. Согласно другим данным концентрация ПЩФ увеличивается как в синцитиотрофобласте, так и в сыворотке беременных женщин при артериальной гипертензии [62, 123], но существуют и противоположные данные об уменьшении ПЩФ в плацентарной ткани при преэклампсии и эклампсии [94]. Аналогичные результаты наблюдали у беременных женщин, анамнез которых отягощен хронической плацентарной недостаточностью и инфекциями, уменьшение ПЩФ в плаценте является результатом адаптационной гиперферментемии и наблюдается при начальных признаках нарушений в фетоплацентарной системе [6, 7, 79]. Это свидетельствует о том, что метаболические изменения в плаценте сопровождаются соответственно сначала повышением активности ПЩФ в сыворотке крови и характеризуют начальные признаки нарушений в системе мать-плацента-плод, а затем снижением ее активности, вплоть до нулевой, что является неблагоприятным прогностическим признаком для плода и новорожденного. 1.4. Синцитиотрофобласт и его производные структуры 1.4.1. Структурно-­‐функциональная характеристика синцитиотрофобласта Синцитиотрофобласт окружает ворсины плаценты и омывается кровью матери, которая находится в межворсинчатом пространстве. Из-за своего положения, СТ выполняет множество плацентарных функций. СТ участвует в обменных процессах, метаболизме и синтезе пептидных и 23 стероидных гормонов, необходимых для роста и развития эмбриона [140]. Некоторые гормоны, такие как хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) [4, 134], плацентарный лактоген человека (hPL) [37] являются гормонами, связанными с беременностью. Объединение клеток в синцитиум плохо изучено. Так, одни исследователи [19] считают, что фосфолипид фосфатидилсерин участвует в облегчении межмембранных соединений. По мнению других ученых [39] важную роль в этом процессе играют эндогенные ретровирусы, некоторые исследователи эту роль отводят оксиду цинка [73] и группе коннексинов, которые участвуют в клеточном слиянии и дифференцировании [72]. Дифференцировка ЦТ в СТ стимулируется множеством факторов, такими как сосудистый фактор эндотелиального роста (VEGF), эндоваскулярный фактор EVT [35, 59, 66], эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарно-макрофагальный фактор (GM-CSF, CSF-1), а также дексаметазоном, фибронектином, коллагеном I [132], низким содержанием фактора некроза опухоли TNF-α [54, 59], низким Hash-2 [27], высоким уровнем хорионического гонадотропина [120]. Синцитиотрофобласт является симпластом, он содержит большое число интенсивно окрашивающихся основными красителями ядер овальной, иногда палочковидной формы, причем более мелких размеров, чем ядра цитотрофобласта. С середины беременности ядра формируют группы. Слияние клеток СТ происходит в результате уменьшения, на молекулярном уровне, клеточной адгезии в которой участвуют белки кадгерины [137]. Уникальная особенность ядер синцитиотрофобласта – способность перемещаться, так как между клетками отсутствуют перегородки, и участвуют в формировании «синцитиальных почек», которые отделяются от эпителиального покрова и становятся свободными симпластами. 24 Органеллы СТ представлены гранулярной эндоплазматической сетью и агранулярной эндоплазматической сетью, в которой происходит синтез стероидных гормонов и β-ХГЧ [58], митохондриями с тубулярными кристами, характерными для клеток продуцирующих стероиды [33, 165]. Некоторые авторы отмечают выраженную ультраструктурную гетерогенность различных регионов СТ и указывают на неодинаковую функциональную деятельность этих участков, отмечают также, что отдельные его энзиматическим области профилем характеризуются [98]. В СТ вполне определенным располагается множество секреторных гранул [99]. В синцитиотрофоблате секретируются различные гормоны [37]. Хорионический гонадотропин один из самых значимых, по химическому строению является гликопротеином, состоящим из двух субъединиц: альфа и бета. ХГЧ состоит из группы 4 независимых молекул, имеющих разное происхождение: ХГЧ выделяемый СТ, ЦТ и межворсинчатым ЦТ, свободная подъединица β-ХГЧ и ХГЧ гипофиза. ХГЧ выделяемый СТ стимулирует секрецию желтого тела и выделение им прогестерона [26], стимулирует ангиогенеза плаценты [36, 80], также он стимулирует слияние клеток ЦТ и их дифференцировку в СТ [160], ингибирует материнские макрофаги и их иммунный ответ на вторжение плаценты [21, 95, 127, 171], стимулирует рост органов эмбриона [18, 150], подготавливает эндометрий матки к имплантации [64, 150]. Гликозилированный ХГЧ секретируемый ЦТ, способствует росту и инвазии ЦТ [2, 156]. Гипофизарный ХГЧ стимулирует лютеогенез и фолликулогенез. Свободная подъединица β-ХГЧ блокирует апоптоз в раковых клетках и способствует росту опухолей [85, 116]. По данным некоторых авторов [114] концентрация ХГЧ в сыворотке крови беременных изменяется на протяжении гестационного периода (табл. 1). 25 Плацентарный лактоген имеет большое значение в развитии и функционировании системы мать — плацента — плод. Он обладает как соматотропными, так и лактотропными (пролактиноподобными) свойствами, поддерживает работу жёлтого тела яичников, регулирует синтез прогестерона. Этот пептидный гормон отсутствует в ранней плаценте, а в течение беременности его концентрация увеличивается [74, 133]. Отмечена четкая зависимость между уровнем этого гормона в крови матери и массой плода и плаценты, что используется в акушерских клиниках для оценки фетоплацентарной недостаточности в III триместре. Таблица 1 Концентрация β-ХГЧ в сыворотке крови беременных женщин (по (по данным Laurence A Cole, [114]). Гестационный срок 3 нед. – 3нед.+6дней 4 нед. – 4нед.+6дней 5 нед. – 5нед.+6дней 6 нед. – 6нед.+6дней 7 нед. – 7нед.+6дней 8 нед. – 8нед.+6дней 9 нед. – 9нед.+6дней 10 нед. – 10нед.+6дней 11нед. – 11нед.+6дней 14 нед. – 17нед.+6дней 18 нед. – 26нед.+6дней 27 нед. – 40нед.+6дней Кол-во исследуемого материала 42 42 67 29 30 33 24 20 41 57 62 49 1 мЕд/л = 1 нг/мл х 21,28 26 ХГЧ нг/мл (нанограмм/миллилитр) 0,26 3,4 65 252 3,27 4,33 5,83 10,35 5,95 2,93 1,93 1,91 1.4.2. Производные синцитиотрофобласта Производными синцитиотрофобласта являются - синцитиальные почки, они представлены скоплением ядер СТ [50, 28], присутствуют всю беременность и их количество увеличивается к ее окончанию [88]. О роли синтициальных почек нет единого мнения. Так, некоторые ученые считают их продуктом дегенерации синцитиотрофобласта, стареющими изменениями синцитиотрофобласта в ответ на гипоксию [63, 84] или дегенеративными образованиями, формирующимися в ответ на ишемическую рану [44]. Количество синцитиальных почек по данным ряда авторов увеличивается при патологии беременных, таких как преэклампсия [149, 155]. Морфометрические исследования синтициальных почек свидетельствуют о увеличении их диаметра в плацентах женщин, страдающих преэкламсией (23,12±8,55 мкм) в отличие от синцитиальных почек в плацентах при неосложненном течение беременности (18,29±5,91) [155]. Известно, что отшнуровавшиеся синтициальные почки становятся свободными симпластами и попадают в межворсинчатое пространство, заполненное эритроцитами матери, а затем уходят в венозную систему матки [10]. Изолированные, или свободные, симпласты впервые описаны в 1893 г. G.Schmorl [157], который обнаружил и идентифицировал их в капиллярах легких у женщин, умерших от эклампсии. Образование изолированных симпластов длительное время считали результатом механического отрыва их от эпителиального покрова ворсин, а эмболию ими капилляров легких — непосредственной причиной смерти беременных или рожениц [57, 92]. По современным взглядам образование свободных симпластов — процесс естественный и физиологический, встречающийся в течение всей нормальной беременности [10, 45, 46]. Они постоянно выявляются в крови, в течение суток в легкие беременной попадает около 27 100 000 - 150 000 свободных симпластов [10]. Там они разрушаются, высвобождая эмбриональную ядерную ДНК, которая поступает в материнское кровообращение. Предполагают, что свободные симпласты подвергаются лизису в легочных капиллярах [29, 65]. В их разрушении принимают участие эндотелиоциты легочных капилляров [52, 54, 55, 56]. Поверхность симпласта напоминает рельеф ворсин, но часто не имеет микроворсинок. Диаметр свободных симпластов достигает 50—200 мкм. Внутренняя структура свободного симпласта полностью соответствует строению синцитиотрофобласта. В центре обычно расположены ядра синцитиотрофобласта, чаще всего в количестве 5-8, но иногда их число достигает 20, содержащие эухроматин. Свободные симпласты имеют иммуноположительную реакцию с антителом против β-ХГЧ [78]. Существует несколько гипотез о функциональной роли свободных симпластов. Одни авторы считают, что свободные симпласты являются продуктом трофобластической дегенерации, и избавляют плаценту от излишков трофобластического материала [45]. Другие высказывают предположение о возможной роли свободных симпластов в развитии иммунологической толерантности матери к антигенам плода. Интенсивная "бомбардировка" свободными симпластами (антигены плода) с высокими концентрациями β-ХГЧ является мощным физиологическим и постоянно действующим фактором, поддерживающим материнскую иммунную систему в толерантности по отношению к антигенам плода, осуществляющим обратную связь между плацентой и материнским организмом в период становления функциональной системы мать — плацента — плод [52]. Имеется предположение о том, что высокая концентрация β-ХГЧ в свободных симпластах не случайна, а закономерна, поскольку накопление этого гормона и, возможно, других плацентарных белков в них представляет собой особый способ "упакованного транспорта" [10]. 28 Таким образом, проблема интерпретации свободных симпластов и синцитиальных почек остается дискуссионной. 1.5. Цитотрофобласт Цитотрофобласт – это слой клеточного трофобласта, который в зависимости от сроков гестации дифференцируется в разных направлениях. Так, ЦТ может дифференцироваться в: ворсинчатый ЦТ, образующий эпителий ворсин, инвазивный ЦТ, экстравиллезный ЦТ [81]. ЦТ эпителия ворсин (ворсинчатый ЦТ) - этот вид ЦТ является гормонально-активным, дает начало клеткам СТ и дифференцируется в них в течение всей беременности [38, 106]. В ранние сроки беременности ворсинчатый ЦТ секретирует β-ХГЧ, что необходимо для поддержания лютеогенеза в яичниках, а к концу первого триместра СТ принимает эту функцию на себя. В составе эпителия ЦТ в течение беременности изменяется в количественном соотношении. ЦТ ворсин обеспечивает постоянство синцитиотрофобласта, восстанавливает повреждения трофобластического эпителия, а также помогает адаптироваться эпителию при патологии беременности [128]. Так, на 5-6-й нед. он принимает участие в формировании базального слоя трофобластического эпителия, затем к 9-10-й нед. его количество уменьшается и несет прерывистый характер, на 16 нед. ЦТ имеет темные ядра и постепенно редуцируется [10]. В III триместре беременности остаются лишь единичные ядра ЦТ ворсин [33], так же существуют данные о том, что количество ЦТ в течение всей беременности постоянно [131]. Экстравиллезный ЦТ образует якорные колоны, которые связывают бластоцисту с эндометрием матки. Образование экстравилезного ЦТ осуществляется дифференцировкой ЦТ, окружающего бластоцисту и стимулируется рядом факторов, таких эндотелиального фактора роста (VEGF) как высокий уровень [75]. Ген TGF-β ингибирует эндоглин, это повышает дифференцировку ЦТ [48], а ингибирует процесс 29 дифференцировки в этом направлении - трансформирующий ростовой фактор (TGF-β1, TGF-β3), глюкокортикоиды и гипоксия [132]. Инвазивный ЦТ или агрессивный - это вид ЦТ обеспечивающий внедрение бластоцисты, плацентацию и раннее эмбриональное развитие, которое происходит в относительно низком кислородном окружении. Гипоксия является фактором, стимулирующим инвазию цитотрофобласта. Также ядерный белок Hif-1 в ответ на гипоксию накапливается в клетках и в комплексе с HIF-ip воздействует на гипоксия-реакционные элементы, содержащиеся в генах, их продукты опосредуют ангиогенез, метаболизм глюкозы, клеточную пролиферацию, выживаемость, миграцию и инвазию клеток [121]. Гипоксию обеспечивают образовавшиеся трофобластические пробки, они замещают эндотелий спиральных артерии, проникая в среднюю оболочку сосуда, результатом чего является деструкция эластической и мышечной ткани и нервных волокон средней оболочки [90]. Низкое напряжение кислорода регистрируется до 10-й недели беременности [113, 152], затем к 12-й недели устанавливается межворсинчатый кровоток и высокое кислородное напряжение [167]. Также успешная инвазия ЦТ обеспечивается коллагеназой IV типа [118], белками интегринами [117]. Инвазия чрезвычайно важна для плацентарного и эмбрионального развития. 1.6. Базальная мембрана трофобластического эпителия Базальная мембрана образуется при слиянии трех пластинок: темной, светлой и ретикулярной. Ретикулярная пластинка соединена с базальной пластинкой с помощью якорных фибрилл (коллаген типа VII) и микрофибрилл. Обе пластинки вместе называются базальной мембраной [145]. Светлая пластинка — толщина 20-30 нм, светлый мелко-зернистый слой, прилежит к плазмолемме базальной поверхности эпителиоцитов. От 30 полудесмосом эпителиоцитов вглубь этой пластинки, пересекая ее, направляются тонкие якорные филаменты. Темная пластинка — толщина 50-60 нм, представляет собой мелкозернистый или фибриллярный слой, который расположен под светлой пластинкой и обращен в сторону соединительной ткани. В пластинку вплетаются якорные фибриллы, имеющие вид петель (образованы коллагеном VII типа). Темная пластинка состоит из коллагена IV, энтактина, а также гепарансульфата. Коллаген IV типа обеспечивает механическую прочность мембраны. Энтактин связывает между собой ламинины, они представляют собой гликопротеиды состоящие из α1, α2, α3, α5, β1, β2, γ1 цепей, и находятся на протяжении всей беременности в базальной мембране, за исключением периода формирования новых ворсин [25, 108]. Также ламинины базальной мембраны трофобласта обеспечивают связь с экстравиллезным ЦТ [109]. Гепарансульфат участвует в клеточной адгезии и обладает ангигенными свойствами. Ретикулярная пластинка — состоит из ретикулярных волокон соединительной ткани, которые связанны с якорными фибриллами. В гестационном сроке 3-4-и недели базальная мембрана представлена коллагеном IV типа, в виде тонкой, прерывистой нити неравномерной толщины, которая в среднем составила 0,17±0,007 мкм [8]. На 5-6-й неделях ее толщина составляет 0,21 ±0,013 мкм., в 7 - 9 недель гестации - это волокнистая линия, состоящая из коллагена IV типа, толщиной составляет 0,23±0,21 мкм. [8]. К концу второго триместра беременности базальная мембрана эпителия составляет 0,30±0,022 мкм.. В доношенной плаценте происходит слияние базальных мембран трофобластического эпителия и базальной мембраны эндотелия капилляра. В зоне синцитио-капиллярных мембран толщина базальной мембраны составляет 0,21 ±0,017, а вне зоны синцитио-капиллярных мембран 0,46±0,024 мкм. [8]. 31 - 1.7. Современные представления о различных типах питания эмбриона и плода У всех млекопитающих питание бластоцисты вначале осуществляется гистиотрофно, когда трофобласт фагоцитирует секрет, продуцируемый маточными железами примерно до 8-й недели [44]. После имплантации и становления хориоаллантоисной плаценты налаживается транзит гемохориального питания, который устанавливается между матерью и плодом. У человека этот процесс инвазивной природы реализуется только в конце I триместра. Во время ранней беременности материнские белки избирательно аккумулируются в жидкость экстраэмбрионального целома, которая в дальнейшем транспортируется плоду через вторичный желточный мешок. Гистиотрофный тип питания обеспечивает плод во время I триместра, причем этот обмен происходит при низкой концентрации кислорода. Показано, что в сроке до 10-12 недель гестации напряженность кислорода в материнской плазме, окружающей хориальные ворсинки, менее 20 mm Hg, что уменьшает риск ранних оксидантных повреждений во время ответственного периода органогенеза. Затем напряженность кислорода повышается до 40-80 mm Hg и остается таковой в течение следующих двух триместров [91, 105, 167]. Эти данные согласуются с более ранними работами, авторы которых с помощью кислородного электрода измерили парциальное давление в плацентарной ткани I триместра беременности и установили, что в сроке 8-10 недель гестации уровень кислорода в плаценте низкий, к 12-13 неделям увеличивается, что, по-видимому, связано с началом непрерывного маточно-плацентарного кровотока [152]. Гемохориальный тип питания становится главным во II триместре беременности, когда маточно-плацентарная циркуляция стабилизируется [44]. Несмотря на достоверность приведенных фактов, 32 они не сопоставлены с динамикой развития ворсинчатого дерева плаценты и строением эпителия ворсин. Анализ литературных данных показал, что изучению плаценты посвящено множество работ как отечественных, так и зарубежных ученых. Но все эти исследования имеют фрагментарный характер: изучаются отдельные компоненты плаценты, чаще всего без ссылок на гестационный возраст, либо указывается постменструальный срок беременности даже для плацент I триместра, что требует его перевода в постовуляционный срок, часто используют ограниченное количество методик, что не дает полного представления о морфологической дифференцировке эпителия ворсин плаценты в связи с меняющимися потребностями эмбриона, а впоследствии и плода. Это в значительной мере затрудняет создание целостного представления об особенностях морфологической структуры эпителия ворсин плаценты в разные периоды физиологической беременности, и не позволяет точно оценить патологию плацент при различных акушерских осложнениях. Все вышеперечисленные аспекты обусловили наш интерес к данной проблеме. 33 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Группы исследуемого материала Для решения поставленных задач были собраны материалы медицинских абортов у здоровых женщин, пожелавших прервать беременность на разных сроках. Особое внимание обращали на уточнение гестационного срока. Подбор женщин осуществляли в соответствии с клиническими показаниями и противопоказаниями. Для уточнения гестационного срока перед медицинским абортом у женщин с помощью УЗИ определяли темя-копчиковые размеры эмбриона (КТР) и рассчитывали менструальный срок минус 2 недели. 1 группа – 10 наблюдений раннего лекарственного аборта с помощью введения женщинам препарата «Мифегин» в 4 недели (нед.) после оплодотворения (п.о.); выкидыш происходил через 1-2 суток обычно в виде целого хориального мешка. 2 группа – 10 наблюдений раннего лекарственного аборта с помощью введения женщинам препарата «Мифегин» в 5 нед. п.о. после предварительного УЗИ эмбриона. 3 группа – 9 наблюдений медицинских абортов путем вакуум экстракции и соскоба из полости матки у здоровых женщин на 6 нед. п.о. Уточнение срока проводили по выявлению эритробластов (ядерных эритроцитов) в узких капиллярах [10]. 4 группа – 8 наблюдений аналогичных медицинских абортов на 7 нед. п.о. Уточнение сроков по выявлению первых безъядерных эритроцитов в капиллярах [10]. 5 группа – 9 наблюдений аналогичных медицинских абортов на 8 нед. п.о. Срок уточняли по преобладанию безъядерных эритроцитов в капиллярной сети ворсин. 6 группа – 10 наблюдений на 9-10 нед. п.о. Срок уточняли по УЗИ размеров эмбриона. 34 7 группа – 11 наблюдений поздних медицинских абортов на 18-24 неделях беременности (постменструальный срок, п.м.) у здоровых женщин по медицинским показаниям с помощью введения препарата «Энзапрост» в околоплодные воды. 8 группа – 9 наблюдений самостоятельных родов в сроке 39-40 недель, протекавших без осложнений. 2.2. Особенности взятия материала Каждая из 8 представленных групп характеризовалась некоторыми особенностями взятия материала. В частности, в 1-ой и 2-ой группах целые хориальные мешки помещали в физиологический раствор в чашках Петри, где визуально выявляли гладкий хорион с небольшим количеством генераций отходящих ворсин и ветвистый хорион – противоположный сегмент мешка с более разветвленной сетью ворсин. Из двух указанных сегментов вырезали небольшие кусочки ворсин с соответствующей маркировкой. С 3 по 7-ую группы материал соскоба предварительно отмывали от крови и выборочно забирали фрагменты, напоминающие «икру», т.е. ворсины плаценты. В 7- 8-ой группе выделяли целые плаценты, из которых забирали ткань из разных участков не менее 7-8 кусочков. Забор кусочков ткани плаценты, размером 1,0х 0,5х 0,5 см, осуществляли из центральной, парацентральной и краевой частей. Кроме того, один кусочек брали с хориальной пластинкой, другой – с материнской поверхности. 2.3. Гистологический и электронно-­‐микроскопический методы Взятые образцы фиксировали 10% нейтральным формалином, проводили по спиртам восходящих концентраций и ксилолу, заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. 35 Для электронно-микроскопического исследования отбирали по 5 случаев из каждой группы плацент. Вырезали кусочки 1мм³, префиксировали их в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, промывали и дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, контрастировали в кусочках уранилацетатом и после обезвоживания заливали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по методу Рейнольдса и просматривали в электронном микроскопе «Jem – 100B» при различных увеличениях. 2.4. Иммуногистохимический метод Иммуногистохимическое исследование выполняли на депарафинизированных срезах непрямым иммунопероксидазным методом. Для характеристики отдельных компонентов эпителия ворсин использовали следующие антитела и технологические детали: 1. Антитело против плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) для выявления щеточной каймы (Novocastra, клон RTU - PLAP-8А9). 2. Антитело против β субъединиц хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) в синцитиотрофобласте ворсин (Novocastra NCL- HCGp) (после воздействия трипсина);. 3. Маркер (Ki67) для выявления пролиферации цитотрофобласта (Novocastra, клон ММ1). Для демаскирования антигена стекла со срезами нагревали в микроволновой печи с 0,01М (pH 6,0) цитратным буферным раствором в течение 10 минут при мощности 450Вт (ПЩФ), затем после доливки буфера еще 10 мин при мощности 300Вт (Ki – 67, β-ХГЧ). Для подавления активности эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 10 мин. с 0,5% раствором перекиси водорода, а для предотвращения неспецифической адсорбции первичных антител, срезы инкубировали с 5% лошадиной сывороткой в течение 10 мин. Инкубация с первичными моноклональными антителами проводилась при комнатной температуре в течение 10 мин. 36 (ПЩФ, Ki – 67) и 30 мин. (β-ХГЧ). После каждой процедуры обработки срезы промывали в TBS (Трис-буфере) pH 7,6 в течение 2-5 мин. Инкубация с вторичными биотинилированными антителами при комнатной температуре в течение 10 мин. Для визуализации иммунной реакции использовали 3,3 – диаминобензидиновую систему детекции (Субстратная система DAB Плюс / DAB Plus Substrate System). Затем докрашивали срезы гематоксилином Майера. Степень окрашивания оценивали в баллах (Рис. 2), как отрицательную (негативную) (0), слабую (1), умеренную (2) и выраженную (3). «-» «+» «++» «+++» Рис.1. Шкала для оценки иммуноэкспрессии в баллах. 2.5. Морфометрический метод С помощью микроскопа Leica DM 2500 с цифровой фотокамерой изображение ворсин при увеличении х100 передавалось на экран компьютера. По программе Adobe Photoshop Cs3 Extended проводили морфометрическую оценку новых генераций ворсин в поперечном сечении, а именно ворсин небольшого диаметра, округлой или овальной формы, определяли: 1) по внешнему контуру эпителиального покрова – площадь ворсин (мкм²); 2) по внутреннему его контуру – площадь стромы (мкм²); 3) по их разнице – площадь эпителия (мкм²). 37 1 - площадь ворсин; 2- площадь стромы; 1 3- 3 2 площадь трофобластического эпителия. Рис. 2. Схема. Ворсина плаценты в поперечном срезе. 2.6. Статистическая обработка Полученные данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова в программе Statistica 6,0 из расчета около 100 ворсин на каждый гестационный срок. Количественные показатели площади ворсин, площади стромы и площади трофобластического эпителия, были обработаны параметрическими методами вариационной статистики, сравнение групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. В сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку (m), при нормальном распределении статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а при распределении, отличающемся от нормального, применяли критерий Манна-Уитни. Различия считали значимыми при пороговом уровне значимости р ≤ 0,05. Расчет количества свободных симпластов, производили путем подсчета их количества на 100 ворсин в поле зрения. Учитывали только симпласты, находившиеся в межворсинчатом пространстве, с четкой щеточной каймой и конгломератом ядер, без каких-либо признаков стромы и капилляров, чтобы избежать включения тангенциальных срезов концевых отделов мелких ворсин. Индекс пролиферации расчитывался, путем подсчета Ki – 67 иммунопозитивных ядер на 100 ядер в 10 полях зрения. 38 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ Структурно-­‐функциональные изменения эпителия ворсин и его производных в течение неосложненной беременности 3.1. Ворсинчатое дерево плаценты на 4 неделе гестации после оплодотворения На данном центральную сроке хориальные свободную полость мешки со представляли стенкой, собой состоящей из экстраэмбриональной мезенхимы в виде рыхлорасположенных клеток с длинными отростками, соединявшими эти клетки друг с другом. Изнутри к мезенхиме прилегала амниотическая мембрана, а также отдельные фрагменты желточного мешка и эмбриона. Снаружи стенка хориального мешка покрыты представлена отходящими двухслойным выростами трофобластическим мезенхимы, эпителием, которые то есть вторичными или мезенхимальными ворсинами (рис. 3А). При изучении хориона выявлена четкая разница в количестве генераций вторичных ворсин в гладком и ветвистом отделе мешка. Если в гладком хорионе ворсины были представлены лишь 2-3 генерациями, то в ветвистом хорионе насчитывалось 4-5 генераций вторичных ворсин с признаками васкулогенеза в строме (рис. 3Б). Особое внимание было обращено на структуру трофобластического эпителия ворсин в данном сроке, средняя площадь которого составила 4863±248 (р>0,05) (табл. 2). В структурном отношении трофобласт ворсин имел двухслойное строение (Рис. 4А) синцитиотрофобласта со (СТ) сплошным и тесно поверхностным расположенными слоем клетками цитотрофобласта (ЦТ). Важно отметить, что на 4-ой неделе гестации в СТ выявляются локальные скопления ядер, так называемые синтициальные почки. Также нами обнаружены симпласты различной формы с большим количеством 39 А Б Рис.3. Ворсинчатое дерево плаценты на 4 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х200:, А - стенка хориального мешка (→) с 2-3-я генерациями мелких ворсин в составе гладкого хориона; Б - группа более крупных ворсин у стенки хориального мешка (→), составляющая ветвистый хорион. 200 200 40 ядер: некоторые из них выглядели виде длинных отростков, сохраняющих связи с СТ, другие, более крупные округлой формы были связаны с эпителием лишь тонкой перемычкой. Наряду с этим были видны и свободные формы симпластов в межворсинчатом пространстве (Рис. 4Б). Количественное их содержание по отношению к общему числу ворсин достигало 57,14% (табл. 3). Таблица 2 Морфометрия трофобластического эпителия ворсин в течение I триместра беременности M±m (мкм²) Средняя площадь ворсин 4 неделя 5 неделя 6 неделя 7 неделя 8 неделя n=98 n=90 n=100 n=73 n=65 9-10 недели n=96 7411,6 19705,5 1 828, 32729 8 0273,2 ±1305,5 ±1844,9 ±2464,8 ±3458,4 ±2705,0 15504,6 ±909,0 Р > 0,05 Р>0,05 Р >0,05 Р >0,05 Р <0,05 Средняя 10641,6 12667,3 14918,7 13368,2 25756,7 23902,4 площадь ±688,7 ±1074,3 ±1551,0 ±1964,1 Р <0,05 2926,0 ±2325,7 Р > 0,05 стромы Р > 0,05 Р <0,05 Средняя 4863,2 4744,3 4786,7 4460,0 973,1 6370,7 площадь ±2 8,9 ±282,8 ±324,6 ±528,3 ± 07,0 ±433,0 эпителия Р >0,05 Р >0,05 Р>0,05 41 Р <0,05 Р < 0,05 Таблица 3 Количество свободных симпластов в течение неосложненной беременности Недели гестации Количество Количество Отношение свободных исследованных выявленных симпластов к количеству ворсин (n) симпластов (n) ворсин % 4 неделя (п.о.) 98 56 57,14 5 неделя (п.о.) 90 67 74,44 6 неделя (п.о.) 100 104 104,0 7 неделя (п.о.) 73 174 238,35 8 неделя (п.о.) 95 115 121,05 9-10 недели (п.о.) 96 68 70,83 18-24 недели (п.м.) 85 16 18,82 39-40 недели (п.м.) 100 5 5 При иммуногистохимическом исследовании в эпителии ворсин реакция с антителом против ПЩФ негативна (-). Реакция с антителом Ki67 имеет позитивную окраску. В стенке хориального мешка и в зоне ворсинчатого хориона количество иммунопозитивных ядер составило 34%. В ЦТ ворсин выявлено в среднем 29% Ki-67 позитивных клеток, а в инвазирующем ЦТ их число составило около 96%. В свободных симпластах и синтициальных почках эта реакция была негативна (-). Антитело против β фракций ХГЧ выявляет слабую (+) степень иммуноокрашивания инвазирующем ЦТ и трофобластическом эпителии и отрицательное окрашивание в свободных симпластах (рис. 5 А) и в стенке хориального мешка (рис. 5 Б). Таким образом, на 4–ой неделе гестации хориальные мешки и окружающие их ворсины характеризуются начальной дифференцировкой на гладкий и ворсинчатый хорион, который представляет собой конечные 42 А Б Рис. 4. Ворсины хориона на 4 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х200: А - эпителий ворсин состоит из синцитиотрофобласта и тесно расположенных клеток цитотрофобласта; Б- свободные симпласты в межворсинчатом пространстве (→). 43 А Б Рис. 5. Иммуногистохимическая реакция с антителом против β-ХГЧ в ворсинах хориона и его производных на 4 неделе после оплодотворения, х200: А – слабая (+) иммуногистохимическая реакция в инвазирующем цитотрофобласте, эпителии ворсин и отрицательная реакция в свободных симпластах; Б - отрицательная иммуногистохимическая реакция в стенке хориального мешка, х200. 44 или якорные ворсины, уходящие в окружающий цитотрофобластический щит. Эпителиальный межворсинчатом покров пространстве ворсин представлен появляются СТ первые и ЦТ, в многоядерные свободные симпласты. В эпителии ворсин в области щеточной каймы выявлена отрицательная реакция с антителом против ПЩФ. 3.2. Ворсинчатое дерево плаценты на 5 неделе гестации после оплодотворения В отличие от предыдущей недели ворсины вокруг хориального мешка подвергаются структурной поляризации: отмечается выраженный рост ворсин в нижнем полюсе хориального мешка и, напротив, сохраняется прежняя картина редкого расположения ворсин в зоне гладкого хориона (рис. 6). Рис. 6. Стенка гладкого хориона, состоящая из мезенхимальных клеток и первичных капилляров на 5-ой неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х50. 45 В зоне ранней плаценты на гистологических срезах видны ворсины, идущие в продольном направлении и дающие многочисленные боковые ветви; в дистальных отделах этих ворсин выявляются веерообразнорасходящиеся мелкие ворсины (рис 8). Важно отметить, что уже на столь раннем сроке формирования плаценты можно дифференцировать отдельные ворсины более крупного диаметра, которые в дальнейшем станут стволовыми или опорными. Основной объект нашего внимания – трофобласт ворсин сохранил примерно те же значения площади (табл. 2) и структурные особенности, свойственные трофобласту в предыдущем сроке гестации. Важно подчеркнуть, что на 5-ой неделе гестации впервые появляется четко контурируемая щеточная кайма в виде зубчатой, эозинофильной линии в апикальной части синцитиотрофобласта (рис. 7). Ядра СТ ориентированы преимущественно параллельно щеточной кайме. Рис. 7. Ворсины с оксифильноокрашенной щеточной каймой на 5-ой неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х400. 46 ХМ Рис. 8. Ветвистый хорион на 5 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином х50. Монтаж ветвления ворсин в зоне ворсинчатого хориона плаценты. Видны многочисленные боковые ветви, в том числе в дистальном отделе. ХМ – хориальный мешок. 47 Иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ негативна (-) как в эпителии ворсин, так и в синтициальных почках и свободных симпластах (рис. 9 А). В тех случаях, когда выявлялись якорные ворсины, в них четко виден переход пролиферирующих клеток трофобластического ЦТ в аналогичные клетки в составе цитотрофобластического щита. Иммуноокрашивание с антителом против β-ХГЧ выявляет умеренную реакцию (++) в эпителии ворсин, синтициальных почках и более выраженное окрашивание (+++) в свободных симпластах (рис. 9 Б). Интенсивные темпы роста ворсин (рис. 8) ранней плаценты обуславливает высокая пролиферативная активность их эпителия, выстилающего хориальный мешок снаружи (рис. 10 А). Пролиферация ЦТ сохранилась в ворсинах гладкого хориона, что составило около 32%. Однако максимальное количество Ki-67 иммуноположительных ядер выявляется в мелких дистальных ворсинах (рис. 10 Б), которые подвергались наиболее интенсивному росту, здесь число позитивных ядер составило 78%. Особенно ярко выражена эта реакция в цитотрофобластическом щите, где она составила 99% (рис. 11 А). В синтициальных почках и в свободных симпластах эта реакция была отрицательной (рис. 11 Б). При изучении с помощью электронной микроскопии на 5-ой неделе обнаружено, что трофобласт состоит из синцитиотрофобласта и подлежащего цитотрофобласта с четкой границей между ними. В клетках ЦТ видны более крупные ядра по сравнению с СТ. В СТ хорошо развит гладкий эндоплазматический ретикулум, в ядрах выявляется краевое расположение гетерохроматина. На 5-ой неделе п.о. регистрируются первые, мелкие микроворсинки в апикальной зоне СТ (рис. 12). 48 А Б Рис. 9. Иммуногистохимическая реакция в трофобласте ворсин на 5 неделе после оплодотворения, х100: А – отрицательная иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ в эпителии ворсин и свободных симпластах; Б – умеренная иммуноположительная реакция с антителом против β-ХГЧ в эпителии ворсин и выраженная иммуноположительная реакция в свободных симпластах. 49 А Б Рис. 10. Иммугистохимическая реакция с антителом Ki-67 на 5 неделе после оплодотворения: А – иммунопозитивное окрашивание в цитотрофобласте гладкого хориона, х200. Б – множественные пролиферирующие клетки цитотрофобласта ворсин в мелких дистальных ветвях, а так же отдельные пролиферирующие клетки в строме, х 400. 50 А Б Рис. 11. Иммуногистохимическая реакция с антителом против Ki-67 на 5 неделе после оплодотворения, х200: А – выраженная пролиферативная активность цитотрофобласта в якорной ворсине с переходом этих клеток во фрагменты цитотрофобластического щита; Б - отрицательная реакция в свободных симпластах и выраженная в цитотрофобласте ворсин. 51 МК СТ ЦТ Рис. 12. Электронно-микроскопическая фотография эпителия ворсин плаценты на 5 неделе после оплодотворения. Виден синцитиотрофобласт (СТ) с микроворсинками (МК), образующими щеточную кайму и цитотрофобласт (ЦТ) с крупным ядром, х10 000. 52 Таким образом, 5-ая неделя гестации характеризуется поляризацией ворсин, окружающих хориальный мешок. Особый интерес вызывают те ворсины, которые составляют основу будущей плаценты. Для них в этот период свойственны интенсивный рост в длину и наличие боковых ветвей; это обеспечивается максимальным количеством клеток ЦТ с высокой пролиферативной активностью, преимущественно в дистальных ветвях. Уже на этом этапе гестации различимы более крупные ворсины, отходящие от стенки ветвистого хориона, которые в дальнейшем станут опорными или стволовыми ворсинами. Эти данные соответствуют максимальным показателям наружной границы ворсин. Базальная мембрана эпителия выявляется лишь в виде тонкой полоски между ЦТ и клетками стромы ворсин. Иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ, была негативна как в эпителии ворсин, так и в свободных симпластах, в отличие от реакции с антителом против β-ХГЧ, которая выявляет в этих структурах иммуноположительную реакцию. 3.3. Ворсинчатое дерево плаценты на 6 неделе гестации после оплодотворения Этот гестационный срок отличается тенденцией к росту площади ворсин, площади стромы, а дальнейшему средняя площадь трофобластического эпителия остается той же, что и в предыдущем сроке (табл. 2). В микропрепаратах доминировал рост мелких боковых ветвей (рис. 13 А) при сохранении в них двухслойного характера трофобласта в большинстве его участков. В сравнении с предыдущей неделей в отдельных фрагментах эпителия ворсин непрерывность слоя ЦТ нарушалась, появлялись небольшие зоны, где ЦТ отсутствовал и непосредственно со стромой контактировал слой СТ (рис. 13 Б). В микропрепаратах на СТ видна тонкая, прерывистая, не имеющая четкой структуры оксифильная линия – это формирующаяся щеточная кайма. В межворсинчатом пространстве выявлялось большее, в сравнении с 53 предыдущей неделей, количество свободных симпластов (табл. 3). Их образованию предшествовало появление синтициальных почек разных форм и размеров. В эпителии ворсин, в свободных симпластах, в синтициальных почках иммуноэкспреcсия ПЩФ не визуализировалась (-), несмотря на формирующуюся щеточную кайму на поверхности СТ. Иммуноокрашивание с антителом против β-ХГЧ выявлялось в выраженной степени (+++) как в эпителии ворсин (рис. 14 А), так и в свободных симпластах и синтициальных почках. Маркер пролиферации Ki-67 выявлял выраженную степень иммуноокрашивания в инвазирующем ЦТ (рис. 14 Б), где количество Ki-67 позитивных клеток составило около 96%; в эпителии стволовых ворсин – 65% (рис. 15 А), и в отходящих боковых генерациях – 78% (рис. 15 Б). В эпителии мелких ворсин регистрировали умеренную иммунопозитивую реакцию, что выразилось в 36% позитивных ядер и негативную (-) в синтициальных почках и свободных симпластах (рис. 15 А). При изучении с помощью электронной микроскопии было установлено, что базальная мембрана ЦТ в этом гестационном сроке имеет рыхлую, неоформленную структуру. В базальной части цитотрофобласта выявляются инвагинации плазмолеммы, которые по-видимому увеличивают транспортную поверхность ЦТ (рис. 17). Таким образом, 6-ая неделя п.о. характеризовалась дальнейшим ростом боковых генераций ворсин развивающейся плаценты, этот процесс обеспечивался высокой пролиферативной активностью клеток ЦТ ворсин. Иммуноэкспрессия ПЩФ не выявлена, в отличие от иммуноположительной реакции с антителом против β-ХГЧ. Важным фактом, свидетельствующим о подготовке к активному транспорту, является появление инвагинаций базальной части плазмолеммы ЦТ. 54 А Б Рис. 13. Поперечный срез ворсин хориона на 6 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином: А – видны ворсины хориона в поперечном разрезе в межворсинчатом пространстве свободные симпласты (→), х100; Б - трофобластический эпителий, состоящий из цитотрофобласта и синцитиотрофобласта, появляющиеся первые участки без цитотрофобласта (→), х400. 55 А Б Рис. 14. Иммуногистохимическая реакция в эпителии ворсин на 6 неделе после оплдодотворения: А - выраженнная степень иммуноокрашивания в эпителии ворсин с антителом против βХГЧ, х200; Б - иммуноокрашивание антителом против Ki-67 в инвазирующем цитотрофобласте, х400. 56 А Б Рис. 15. Иммуногстохимическая реакция с антителом против Ki-67 на 6 неделе после оплодотворения: А – визуализировано иммуноокрашивание в цитотрофобласте эпителия стволовых ворсин, х200; Б - иммуноэкспрессия маркера Ki67 в цитотрофобласте эпителия боковой ветви, х400. 57 Рис. 16. Отрицательная иммуногистохимическая реакция с антителом против Ki-67 в свободных симпластах и выраженная степень окрашивания в цитотрофобласте эпителия ворсин на 6 неделе после оплодотворения, х400. 58 ЦТ ИГ ПМ БМ Строма ворсины Рис. 17. Инвагинации плазмолеммы цитотрофобласта (ЦТ) в области базальной мембраны (БМ) на 6 неделе после оплодотворения. Электронномикроскопическая фотография, х15000. ЦТ – Цитотрофобласт, БМ - Базальная мембрана, ИГ – Инвагинации, ПМ – Плазмолемма. 59 3.4. Ворсинчатое дерево плаценты на 7 неделе гестации после оплодотворения В данном гестационном сроке было установлено, что ворсинчатое дерево не отличается по своим морфометрическим критериям от показателей на предыдущей неделе (табл. 2). Ворсинчатое дерево характеризовалось интенсивным ростом, на что указывало большое количество боковых генераций ворсин, попавших в срез (рис. 18 А), их трофобластический эпителий был представлен двумя слоями цито- и синцитиотрофобластом (рис. 18 Б). В соответствии с данными, представленными в табл. 3, в этом гестационном сроке отмечено максимальное количество свободных симпластов, в количестве почти двух таких образований на одну ворсину (рис. 19 А). Их высвобождению в межворсинчатое пространство предшествует выпячивание в виде синтициальных почек на поверхности эпителия ворсины (рис. 18 А). В этом сроке они так же, как и симпласты наблюдаются на всех ворсинах и в большом количестве. Свободные симпласты были разнообразной формы в зависимости от направления среза: удлиненно-овальной или округлой формы с широкой, зубчатой, оксифильной на полоской апикальной части СТ, вероятно, соответствующей щеточной кайме, некоторые из них по калибру были почти равны ворсинам (рис. 19 Б). Иммуноэкспрессия ПЩФ имела негативную (-) реакцию в трофобласте ворсин, синтициальных почках и свободных симпластах. Иммуногистохимическая реакция с антителом против Ki-67 имела не одинаковый характер: в эпителии опорных ворсин она составляла 25%, в промежуточных ворсинах – 34%, а в более мелких генерациях выявлено 21% (рис. 20 А) Ki-67 позитивных клеток. Реакция с этим антителом в 60 А Б Рис. 18. Трофобластический эпителий в боковых генерациях и основных ворсинах на 7 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х200: А - боковые ветви ворсинчатого дерева с синтициальными почками (→); Б - трофобластический эпителий представлен двумя слоями: цито- и синцитиотрофобластом. 61 А ХМ М Б Рис. 19. Ворсинчатое дерево плаценты и межворсинчатое пространство на 7 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х100: А - большое количество свободных симпластов (→) среди материнской крови в межворсинчатом пространстве; Б – стенка хориального мешка (ХМ) с окружающими свободными симпластами, в том числе крупных размеров с четкой оксифильной каемкой. 62 А Б Рис. 20. Иммуногистохимическая реакция в эпителии ворсин на 7 неделе после оплодотворения, х200: А – отдельные Ki-67 позитивные клетки цитотрофобласта ворсин и стромы; Б – выраженное (+++) иммуноокрашивание антителом против β-ХГЧ эпителия ворсин и свободных симпластов. 63 синтициальных почках и свободных симпластах Иммуноокрашивание антителом против β-ХГЧ была негативна. эпителия ворсин, синтициальных почек и свободных симпластов имело выраженную (+++) реакцию (рис. 20 Б). При электронно-микроскопическом изучении ворсин данного гестационного срока отмечалось увеличение высоты микроворсинок СТ (рис. 21), они имели вид трубочек с утолщением в апикальной части. В цитоплазме СТ выявлены секреторные гранулы различного диаметра, покрытые тонкой мембраной, с полосой просветления под ней и более осмиофильным веществом в центре гранул (рис. 22). Таким образом, несмотря на отсутствие весомых различий в морфометрических параметрах ворсин, в том числе площади трофобластического эпителия, была выявлена структкрная перестройка трофобласта: усложнение структуры микроворсинок, накопление секреторных гранул в цитоплазме СТ. В совокупности все изменения, происходящие в трофобласте, свидетельствуют о новом этапе становления эпителиального покрова и его направленности на секреторную и трофическую активность. 64 МК СТ Ядро СТ Рис. 21. Электронно-микроскопическая фотография трофобласта ворсин на 7 неделе после оплодотворения. Видны колбообразные микроворсинки (МК) на поверхности синцитиотрофобласта (СТ), х 20000. 65 СГ Ядро Рис. 22. Электронно-микроскопическая фотография синцитиотрофобласта ворсин на 7 неделе после оплодотворения. Видны разнокалиберные секреторные гранулы (СГ) в околоядерной зоне синцитиотрофобласта, х15000. 66 3.5. Ворсинчатое дерево плаценты на 8 неделе гестации после оплодотворения Этот гестационный срок характеризуется дальнейшим увеличением числа боковых ветвей, ростом и увеличением диаметра большинства ворсин (рис. 23 А); это подтверждается морфометрическими данными. Так, увеличение наружной границы эпителия ворсин произошло в 1,8 раза по сравнению с показателями в предыдущем сроке, его внутренней границы – в 1,9 раза, а увеличение средней площади эпителия в 1,6 раза (табл. 2). Строение эпителия существенно не отличается от такового в предыдущем гестационном сроке, также наблюдается оксифильная линия в апикальной части СТ, которая имеет зубчатый контур, местами эта линия прерывается. В эпителии крупных - опорных ворсин в большинстве его участков отсутствует ЦТ (рис. 23 Б). В более мелких генерациях ворсин – промежуточных, появляются более протяженные участки эпителия, где присутствует только СТ, а в тех местах, где сохранился ЦТ ворсин, он увеличивается в размерах и внедряется в строму (рис. 24 А). Такое выбухание ЦТ обеспечивает неровный, фестончатый контур базального слоя, как следствие этого, увеличение средней площади эпителия. На эпителии ворсин регистрировались синтициальные почки (рис. 24 Б), которые представляли собой скопление ядер СТ от 10 до 25 и более штук. В межворсинчатом пространстве выявлено большое количество свободных симпластов, на их поверхности видна тонкая, зубчатая линия, но в количественной оценке их становится меньше, чем в предыдущем сроке (табл. 3). 67 А Б Рис. 23. Строение ворсинчатого дерева плаценты и его эпителия на 8 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином: А – ворсины плаценты с увеличенным диаметром, в межворсинчатом пространстве видны свободные симпласты (→), х100; Б - участки трофобластического эпителия опорных ворсин, где цитотрофобласт отсутствует, х400. 68 А Б Рис.24. Строение эпителия на 8 неделе после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином, х100: А – выбухания крупных клеток цитотрофобласта в сторону стромы ворсин (→); Б – в межворсинчатом пространстве располагаются свободные симпласты. На поверхности ворсин видны синтициальные почки (→). 69 Иммуноэкспрессия с антителом против ПЩФ имела отрицательную (-) реакцию в эпителии ворсин, синтициальных почках и свободных симпластах (рис. 25 А). Маркер пролиферации Ki-67 выявил около 12% иммунопозитивных ядер в эпителии опорных ворсин, 8% - в эпителии промежуточных ворсин и 5% - в эпителии мелких ворсин. Как и в предыдущем сроке, этот маркер обнаруживал негативную реакцию в синтициальных почках и свободных симпластах. Иммуногистохимическая реакция с антителом против β-ХГЧ выявляет выраженную (+++) экспрессию в эпителии ворсин, синтициальных почках и свободных симпластах (рис. 25 Б). При электронно-микроскопическом исследовании в цитоплазме СТ были обнаружены секреторные гранулы в большом количестве, которые по калибру почти равнялись ядру СТ и концентрировались ближе к апикальной его части, что свидетельствовало об интенсивности процессов секреции и транспорта веществ. Так же произошло усложнение в строении щеточной каймы, которая представлена микроворсинками, образующими ветвистые структуры на поверхности СТ (рис. 26). Плазмолемма базальной поверхности СТ образовывала более глубокие и широкие участки инвагинаций. В составе цитоплазмы инвагинаций видны микроэндоцитозные пузырьки, наличие которых, свидетельствует об участии инвагинаций в транспортной функции эпителия (рис. 27). 70 А Б Рис. 25. Иммуногистохимическая реакция в эпителии ворсин на 8 неделе после оплодотворения, х200: А – отрицательная экспрессия с антителом против ПЩФ в эпителии ворсин и свободных симпластах; Б – выраженная иммуноэкспрессия β-ХГЧ в эпителии ворсин и свободных симпластах, х200. 71 МК СГ Рис. 26. Электронно-микроскопическая фотография эпителия ворсины на 8 неделе после оплодотворения. На поверхности синцитиотрофобласта видны ветвящиеся микроворсинки (МК), в цитоплазме синцитиотрофобласта - крупные, плотные секреторные гранулы (СГ), х3000. 72 ЦТ МЭ ИГ БМ Рис. 27. Электронно-микроскопическая фотография цитотрофобласта, лежащего на базальной мембране на 8 неделе после оплодотворения. Видны пальцевидные отростки базальной части цитотрофобласта в строму ворсин. В цитоплазме видны микроэндоцитозные пузырьки, х20000. ЦТ – Цитотрофобласт, БМ - Базальная мембрана, ИГ – Инвагинации, МЭ – Микроэндоцитозные пузырьки. 73 Таким образом, на 8-ой неделе п.о. эпителий ворсин характеризуется признаками, свидетельствующими о более интенсивной транспортной функции; это подтверждается электронно-микроскопически, наличием крупных секреторных гранул, появлением микроворсинок в виде сложных кустистых форм, а также усложнением ультраструктуры инвагинаций базальной части плазмолеммы ЦТ, которая вместе с базальной мембраной внедряется в строму ворсин. Вышеобозначенные особенности свидетельствуют о структурной готовности плаценты к интенсивному притоку материнской крови в межворсинчатое пространство. 3.6. Ворсинчатое дерево плаценты на 9 -­‐ 10 неделях гестации после оплодотворения По строению ворсинчатого дерева плацента этой группы существенно не отличалась от плаценты предыдущего срока гестации. В ней преобладали достаточно крупные стволовые, промежуточные ворсины с фестончатыми очертаниями эпителиального покрова (рис. 28 А). Диаметр ворсин на поперечных срезах, характеризовался меньшими значениями, чем морфометрическими в предыдущем параметрами сроке, наружной что и подтверждалось внутренней границ эпителия (табл. 2). Это объяснялось тем, что в срезы попадало все большее количество мелких ворсин. Эпителиальный покров крупных, стволовых ворсин представлял собой СТ, ядра которого приближались к поверхности. Эпителиальный покров стволовых и промежуточных ворсин чаще состоял из двух слоев (СТ и ЦТ), но местами ворсинчатый ЦТ отсутствовал, в тех местах, где ЦТ эпителия ворсин сохранялся, он так же выбухал в сторону стромы (рис. 28 Б). На поверхности СТ прослеживалась нечеткая, изогнутая линия, что соответствовало щеточной кайме (рис. 29 А). Этим объясняется увеличение площади эпителия, которая достигала максимума в течение I триместра беременности. 74 А Б Рис. 28. Строение ворсинчатого дерева плаценты на 9 – 10 неделях после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином: А – крупная ворсина с начальной дифференцировкой в сторону опорной ветви, х100; Б – эпителиальный покров крупной опорной ворсины, представленный цито- и синцитиотрофобластом. Видны участки без цитотрофобласта (→), х400. 75 А Б Рис. 29. Строение ворсинчатого дерева плаценты на 9 – 10 неделях после оплодотворения. Окраска гематоксилином и эозином: А - оксифильная щеточная кайм (→) на апикальной части синцитиотрофобласта, х400; Б - крупная опорная ворсина с отходящими от нее промежуточными ворсинами и синтициальной почкой (→), в межворсинчатом пространстве виден свободный симпласт (→), х200. 76 В отношении свободных симпластов, этот гестационный срок характеризовался их резким количественным уменьшением в два раза (табл. 3) в сравнении с 8-ой неделей (рис. 29 Б). Впервые выявлена иммуноположительная реакция с антителом против ПЩФ в эпителии стволовых, промежуточных ворсин и в свободных симпластах, которая имела умеренную (++) степень на 9 нед. (рис. 30 А) и выраженную (+++) на 10 нед. п.о. (рис. 30 Б). Помимо четких прямых или слегка изогнутых иммуноположительных линий, в зоне щеточной каймы, видны мелкие поверхностные зубчики, которые повторяют неровные контуры апикальной части щеточной каймы. Примерно такое же распределение ПЩФ отмечается в немногочисленных свободных симпластах (рис. 31). Явная редукция ворсинчатого ЦТ подтверждается редкостью выявления пролиферирующих клеток, их количество составило около 3% в эпителии крупных опорных ворсин (рис. 32 А), в эпителии промежуточных и терминальных ворсин их число составило всего 2%, а в синтициальных почках и в свободных симпластах пролиферирующие клетки не выявлялись (рис. 32 Б). В данном гестационном сроке сохранялась выраженная степень (+++) иммуноэкспрессии β-ХГЧ в СТ и синцитиальных почках, что свидетельствует о высокой гормонопродуцирующей функции эпителия ворсин. 77 А Б Рис. 30. Иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ в эпителии ворсин и свободных симпластах на 9 – 10 неделях после оплодотворения, х200: А - 9 неделя после оплодотворения. Умеренная (++) иммуноэкспрессия ПЩФ в эпителии ворсин и по контуру свободных симпластов; Б - 10 неделя после оплодотворения. Выраженная (+++) иммуноэкспрессия ПЩФ в цитоплазме СТ, свободных симпластах и синцитиальных почках. 78 Рис. 31. Иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ в цитоплазме эпителия ворсин, на его апикальной части и синтициальных почках на 9 – 10 неделях после оплодотворения, х 400. 79 А Рис. 32. Иммуногистохимическая реакция в цитотрофобласте ворсин и свободных симпластах с помощью маркера Ki-67 на 9 – 10 неделях после оплодотворения: А –отдельные иммунопозитивные клетки цитотрофобласта в эпителии опорных ворсин (→), х400; Б – единичные Ki-67 позитивные клетки в строме (→), х200. 80 Электронная микроскопия ворсин подтвердила дальнейшие преобразования структуры микроворсинок СТ. Они имели форму вытянутых высоких цилиндров в продольном срезе и, округлых образований на поперечных срезах. В целом они составляли достаточно толстую и дифференцированную щеточную кайму. Непосредственно в апикальной части СТ видны крупные плотные секреторные гранулы, большое количество везикул, что подтверждает активные процессы транспорта веществ (рис. 33). В отношении инвагинаций плазмолеммы базальной части трофобласта отмечается четкая динамика ее усложнения по сравнению с предыдущими неделями. Инвагинации углубляются и приобретают неправильную форму (рис. 34). Таким образом, эпителий ворсин на 9 - 10 неделях по морфометрическим параметрам аналогичен показателям на 8 неделе, его морфологическая перестройка происходит за счет расширения щеточной каймы и приближения ядер к апикальной части СТ. Продолжается редукция ворсинчатого ЦТ с минимальной его пролиферативной активностью. Впервые была выявлена иммуноэкспрессия ПЩФ, которая повторяла контуры щеточной каймы. Электронная микроскопия эпителия подтверждала возросшие транспортные функции СТ, что отражало уже существующий стабильный приток материнской крови в межворсинчатое пространство. 81 МК СГ Рис. 33. Электронно-микроскопическая фотография синцитиотрофобласта на 9 – 10 неделях после оплодотворения. Широкий слой цилиндрических микроворсинок (МК), составляющий щеточную кайму, большое количество везикул и секреторных гранул (СГ), х20000. 82 ИГ БМ Строма ворсин Рис. 34. Электронно-микроскопическая фотография базальной части трофобласта на 9 – 10 неделях после оплодотворения. Инвагинации плазмолеммы синцииотрофобласта в области базальной поверхности, х20000. 83 3.7. Ворсинчатое дерево плаценты на 18 -­‐ 24 неделях гестации после менструации Данный гестационный срок относится к началу и середине фетального периода; он характеризуется интенсивным ростом плода, масса которого к 16 неделе достигает массы плаценты, и во все последующие сроки быстро превышает ее. Ворсинчатое дерево уже четко дифференцировано на опорные, промежуточные и терминальные ветви. Так, на рисунке 35 А видны опорные ворсины второго порядка с небольшой боковой ветвью. В составе ее стромы видна более узкая артериола и превышающая ее по калибру венула, вокруг видны опорные ворсины третьего порядка, где определить артериолы и венулы уже затруднительно (рис. 35 А). Общая закономерность значительного увеличения промежуточных и терминальных ворсин, выразилась в их морфометрической характеристике: в сравнении с 9 – 10 неделями наружная граница эпителия уменьшилась в 0,5 раза, внутренняя граница – в 0,6 и главный показатель – площадь эпителия уменьшилась в 0,5 раз (табл. 4). Уменьшение площади эпителия связано с тем, что практически на всем его протяжении эпителиальный покров представлен только СТ (рис. 35 Б), но на больших увеличениях видны отдельные крупные клетки ЦТ уплощенной формы, без значительного выбухания в сторону стромы, как на 9 - промежуточными 10 неделях. незрелыми Большинство ветвями, с ворсин крупными представлено стромальными каналами (рис. 36 А). В микропрепаратах в межворсинчатом пространстве встречались редкие свободные симпласты (рис. 35 А). Этому предшествовало перемещение ядер СТ, и образование синтициальных почек (рис. 36 Б). Количество свободных симпластов составило 19% к количеству ворсин (табл. 3). 84 Таблица 4 Морфометрия эпителия ворсин в течение II и III триместров беременности M±m (мкм²) 18 - 24 неделя n=85 17017,7 ±2030,8 Средняя площадь ворсин 3476,4 ±220,7 P <0,001 13731,8 ±1753,1 Средняя площадь стромы 2690,2 ±189,3 P <0,001 3285,9 ±291,5 Средняя площадь эпителия ПЩФ 38 – 40 недели n=100 786,2 ±35,3 P <0,001 в данном гестационном сроке экспрессировалась в апикальной части СТ в виде четкой, плотной линии, которая повторяла неровный контур щеточной каймы. Степень ее окрашивания была выраженная (+++). Так же ПЩФ экспрессировалась в базальной части ЦТ в виде тонкой изогнутой линии (рис. 37 А), степень окрашивания умеренная (++). Такая локализация ПЩФ впервые обнаружена в этом сроке. Ворсинчатое дерево выявляло не одинаковую степень иммуноокрашивания всех видов ворсин. Так, в опорных ворсинах она была умеренная (++), а в промежуточных и терминальных - более выраженная (+++). Иммуноэкспрессия ПЩФ в свободных симпластах имела выраженную (+++) степень. Маркер пролиферации Ki-67 выявлял отрицательную реакцию в ЦТ опорных и промежуточных ворсин, а в 85 А Б Рис. 35. Особенности ветвления ворсинчатого дерева на 18 - 24 неделях после менструации. Окраска гематоксилином и эозином: А – опорные ворсины второго и третьего порядка, в межворсинчатом пространстве единичные свободные симпласты (→), х100; Б – участки однослойного эпителия ворсин, представленныго синцитиотрофобластом, х400. 86 А Б Рис. 36. Строение ворсинчатого дерева плаценты на 18 - 24 неделях после менструации. Окраска гематоксилином и эозином: А – промежуточные незрелые ветви с отходящими мелкими терминальными ворсинами, х100; Б - на поверхности эпителия сформировавшиеся синтициальные почки (→), х200. 87 терминальных ворсинах его индекс составил около 0,5% иммунопозитивных клеток. Этот маркер имел негативную реакцию в синтициальных почках и в свободных симпластах. Иммуноэкспрессия антитела против β-ХГЧ становится менее интенсивна в промежуточных и терминальных ворсинах (рис. 37 Б), и особенно в стволовых ворсинах, где степень экспрессии можно оценить как умеренную (++). При электронно-микроскопическом исследовании плазмолеммы базальной части СТ было выявлено усложнение ее строения, это проявлялось в формировании более многочисленных и глубоких инвагинаций, чем в предыдущем сроке (рис. 38). Таким образом, перестройка ворсинчатого дерева, а точнее его более активная ветвистость, дальнейшая специализация ворсин на опорные, промежуточные и терминальные ветви, выраженная иммуноэкспрессия ПЩФ в апикальной части СТ, то есть на границе с циркулирующей материнской кровью, и в области базальной части эпителия, усложнение инвагинаций плазмолеммы трофобласта, увеличивающие поверхность контакта со стромой ворсины и транспортную поверхность, соответствуют изменившимся пространстве гемодинамическим и являются условиям доказательством постоянного характера гемохориального обмена. 88 в межворсинчатом сформировавшегося А Б Рис. 37. Иммуногистохимическая реакция в ворсинчатом дереве плаценты на 18 - 24 неделях после менструации с маркерами ПЩФ и β-ХГЧ, х200: А - Иммуногистохимическая визуализация ПЩФ в апикальной и базальной частях эпителия ворсин; Б - слабая иммуноэкспрессия β- ХГЧ в цитоплазме синцитиотрофобласта. 89 ИГ БМ Строма ворсины Рис. 38. Электронно-микроскопическая фотография инвагинаций (ИГ) плазмолеммы в базальной части трофобласта на 18 – 24 неделях после менструации, х15000. ИГ – Инвагинации, БМ – Базальная мембрана. 90 3.8. Ворсинчатое дерево плаценты на 39 -­‐ 40 неделях гестации после менструации Ворсинчатое дерево плаценты на 39 – 40 неделях гестации характеризовалось структурными признаками зрелой плаценты. По характеру ветвления ворсины представляли собой все компоненты ворсинчатой части котиледонов, в частности три уровня стволовых ворсин, отходящих от них промежуточных ветвей и преобладающее количество самых мелких терминальных ворсин. Среди терминальных ворсин выделяли два морфофункциональных типа: 1) терминальные ворсины с характерными относительно узкими капиллярами в центре стромы (рис. 38 А); 2) терминальные специализированные ворсины с несколькими капиллярами – синусоидами, тесно контактирующими с истонченными, безъядерными участками СТ (рис. 38 А, Б). Последний тип терминальных ворсин распределялся неравномерно в микропрепаратах плацент, поскольку в одних участках их относительно немного (рис. 38 А), в других же, они составляли большинство представленных ворсин (рис. 38 Б). В соответствии с вышеуказанным строением ворсинчатого дерева средние морфометрические параметры ворсин оказались наименьшими среди всех ранее проанализированных гестационных групп. Так, наружная граница эпителия уменьшилась, и составила 3476,4 мкм² (р < 0,001), что объясняется преобладанием мелких терминальных ворсин; внутренняя граница эпителия составила 2690,2 мкм² (р < 0,001), а площадь его была рана 786,2 мкм² (р < 0,001) (табл. 4). Эпителий ворсин был представлен исключительно СТ, (рис. 39 А) только при тщательных, целенаправленных поисках можно было найти единичные сохранившиеся ядра ЦТ, которые приобрели уплощенную форму. В основном компоненте эпителия – СТ происходит перегруппировка ядер, которые отсутствуют над 91 I T /"$. 38. S'&)69,+,#"& %&'P"#,9:#<- ()'$"# #, 39 – 40 #&+&9.- ?)$9& P&#$%'5,3"". A1',$1, >&P,%)1$"9"#)P " V)*"#)P, -100: I – P&91"& ()'$"#< $ 3&#%',9:#<P ',$?)9)8&#"&P 1,?"99.')( ( $%')P& " &+"#";#<& %&'P"#,9:#<& $?&3",9"*"')(,##<& ()'$"#< (^); T – 5;,$%)1 ?9,3&#%,'#)0 %1,#" $ P#)8&$%()P %&'P"#,9:#<$?&3",9"*"')(,##<- ()'$"#. )!" " капиллярами – синусоидами, и скапливаются в соседних участках, где отсутствуют кровеносные капилляры (рис. 39 Б). Данная особенность перераспределения ядер СТ объясняет небольшое количество синцитиальных почек и свободных симпластов в доношенном сроке беременности (табл. 3). Иммуноэкспрессия ПЩФ определяется в выраженной степени (+++) в эпителии всех типов ворсин в частности опорных, промежуточных и многочисленных терминальных ворсин. На больших увеличениях четко прослеживалось двухслойное распределение ПЩФ, в виде непрерывной, толстой линии в зоне щеточной каймы и тонкого непрерывного слоя в зоне базальной мембраны (рис. 40 А). Следует подчеркнуть, что двухслойное распределение ПЩФ наблюдалось так же и в зоне синцитиокапиллярных мембран, где оно представлено двумя тонкими параллельными линиями. Умеренное распределение (++) этого энзима сохраняется и в цитоплазме СТ. Остальные компоненты ворсин (стенка капилляров, клетки стромы) иммунонегативны. Реакция с антителом против Ki-67 отрицательна в ядрах ЦТ эпителия ворсин всех типов, синтициальных почках и в свободных симпластах. Иммунокспрессия β-ХГЧ стала слабой (+) во всех типах ворсин. В максимальной степени структурная зрелость ворсин прослеживалась при их электронно-микроскопическом изучении. В участках СТ вне синцитиокапиллярных мембран выявлялась щеточная кайма, представленная укороченными, реже расположенными цилиндрическими микроворсинками; некоторые из них имели концевые колбообразные расширения. В цитоплазме СТ видны расширенные полости агранулярного ретикулума и единичные секреторные гранулы, которые в количественном отношении и по размерам намного меньше, чем в предыдущих группах плацент. Ядра СТ имели большое количество деспирализованого хроматина, а по краям участки неактивного хроматина. 93 А Б Рис. 39. Ворсины плаценты на 39 – 40 неделях после менструации. Окраска гематоксилином и эозином: А - эпителий ворсин, состоящий только из синцитиотрофобласта, в крупных опорных ворсинах и промежуточных (→), х200; Б – терминальные специализированные ворсины с синцитиокапиллярными мембранами (→), х400. 94 Рис. 40. Иммуноэкспрессия ПЩФ в зоне щеточной каймы и в зоне базального мембраны эпителия ворсин на 39 – 40 неделях после менструации, х100. В той части цитоплазмы, которая граничит с базальной мембраной, видны множественные инвагинации плазмолеммы. Базальная мембрана эпителия состояла из трех компонентов, включающих полоску из более плотного мелкозернистого материала непосредственно под слоем инвагинаций, прозрачную пластину и сетчатый слой из тонких фибрилл, переходящих в экстрацелюлярный матрикс стромы (рис. 41). Особый интерес вызывает ультраструктура синцитиокапиллярных мембран, как неотъемлемого компонента специализированных терминальных ворсин. Так, на рисунке 42 видно, что от материнского эритроцита, тромбоцитов и плазмы, эпителий подобных ворсин отделен щеточной каймой, состоящей из цилиндрических микроворсинок, в том числе и с концевыми колбообразными расширениями. В щеточной кайме видны участки, где микроворсинки удалены друг от друга на некоторое 95 расстояние. В зоне синцитиокапиллярных мембран СТ представлен безъядерным участком, который содержит мелкие везикулы и узкую прослойку инвагинаций (рис. 42). Базальная мембрана СТ и эндотелия капилляра плода сливаются, что обеспечивает укороченную дистанцию для диффузии между материнскими эритроцитами, находящимся в межворсинчатом пространстве, и эритроцитами плода в просвете капилляра – синусоида. Таким образом, для зрелой плаценты характерно большое количество терминальных ворсин с минимальной площадью их стромы и эпителия. Среди мелких ворсин формируются терминальные специализированные формы с характерными синцитиокапиллярными мембранами, плацентарного которые представляют барьера. собой Характерно самые тонкие наличие участки выраженной иммуноэкспрессии ПЩФ во всех типах ворсин, с ее двухслойным распределением в щеточной кайме и в плазмолемме базальной части эпителия. В межворсинчатом пространстве редко обнаруживаются свободные симпласты. Вышеперечисленные структурные особенности эпителия свидетельствуют о финальной стадии перестройки эпителия ворсин, когда для облегчения процессов диффузии, в частности транспорта кислорода и углекислого газа, ядра СТ мигрируют из области синцитиокапиллярных мембран в соседние участки цитоплазмы, в результате чего цитоплазма становится тоньше, а инвагинации в этой зоне усложняют свой ход, и приближаются к эндотелиоцитам капилляра (рис. 43). 96 МК А ЭПС ИГ СГ БМ Рис. 41. Электронно-микроскопическая фотография синцитиотрофобласта на 39 – 40 неделях после менструации. Видны редкие микроворсинки (МК), секреторные гранулы (СГ), агранулярный ретикулум (А ЭПС), широкая полоса инвагинаций (ИГ) плазмолеммы и типичная базальная мембрана (БМ), х 10000. 97 МК БМ Рис. 42. Ультраструктура синцитиокапиллярной мембраны в терминальной специализированной ворсине на 39 – 40 неделях после менструации. Видны микроворсинки (МК) на поверхности синцитиотрофобласта и истонченная базальная мембрана (БМ), х7000. 98 ЩК СКМ Рис. 43. Электронно-микроскопическая фотография самых истонченных участков плацентарного барьера на 39 – 40 неделях после менструации. Область синитиокапиллярных мембран (СКМ), на поверхности синцитиотрофобласта видны редкие микроворсинки (МК), х20000. 99 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ Плацента является уникальным объектом для изучения морфогенеза экстраэмбриональных структур. Уникальность плаценты заключается в том, что в ее развитии тесно сопряжены процессы морфологической и функциональной дифференцировки трофобластического эпителия: его преобразование в зависимости от сроков гестации ворсин от первичных, представленных клетками трофобласта, к вторичным, а затем и третичным ворсинам, к формированию котиледонов, с одновременным изменением стромы ворсин и переходом от гистиотрофного типа питания к гематотрофному. Все морфологические изменения направлены на обеспечение меняющихся потребностей эмбриона и плода. Однако эти важнейшие механизмы изучались фрагментарно, без их взаимосвязи и обобщающей концепции, часто без указания гестационного возраста, либо на малой выборке и с использованием только одного метода исследования. В связи с этим проблема морфогенеза эпителия ворсин плаценты остается актуальной. Одним из важнейших этапов в функциональной морфологии эпителия является дифференцировка синцитиотрофобласта и его функциональное становление, в частности специализация на выполнение трофической и гормонопродуцирующей функций. Этот важный процесс включает в себя образование на поверхности синцитиотрофобласта щеточной каймы, без которой эти функции не могут в полной мере соответствовать возрастающим потребностям развивающегося плода. Маркером микроворсинок щеточной каймы, является плацентарная щелочная фосфатаза, которая свидетельствует о их наличии и функциональной активности. Плацентарная щелочная фосфатаза и β фракциb хорионического гонадотропина являются маркерами дифференцировки трофобластического эпителия. Исследование ПЩФ и ее динамики в течение беременности проводилось главным образом в 100 сыворотке крови [7, 66, 70, 71, 82, 83, 142, 143, 169]. Работы, в которых проводилось иммуногистохимическое исследование плацентарной ткани, и в частности эпителия ворсин, не дают представления о сроках появления ПЩФ, так как не согласуются между собой [124, 125, 141, 148] и имеют фрагментарный характер, поскольку исследуется лишь одна гестационная группа [115, 146]. Большинство работ посвящено исследованию ПЩФ в последнем триместре беременности [107, 158], при различных акушерских и других патологиях [11, 13, 14, 15, 16, 30, 34, 60, 82, 83, 119, 123, 138,154, 172]. Представляется важным изучение сроков появления ПЩФ, ее максимальной экспрессии и динамики на всем протяжении гестационного периода в плацентарной ткани при неосложненном течении беременности. В исследованиях плацент часто используют один маркер, а для полной характеристики эпителия необходимо провести корреляцию с уровнем βХГЧ в эпителии ворсин, пролиферативной активностью цитотрофобласта и его морфологической перестройкой, направленной на выполнение им сложных транспортных процессов. Многими авторами проводилась морфометрическая оценка ворсин плаценты. Однако часто изучался только один тип ворсин или исследовались плаценты при акушерских патологиях [5, 17]. Изучению свободных симпластов посвящено большое количество исследований, но ни в одном из них не определена динамика их количества в течение гестационного периода, позволяющая судить о их значении и возможных критических периодах в развитии плода [3, 10, 45, 46, 57, 65, 78, 137]. В данном исследовании представлена полная картина развития всех компонентов эпителия ворсин в течение беременности. Акцент был сделан на описании морфологической характеристики эпителия в первом триместре понедельно с уточнением сроков гестации. В работе использованы методы 101 световой микроскопии, морфометрии, иммуногистохимии, электронной микроскопии и статистической обработки данных. С учетом морфометрических показателей эпителия ворсин и их морфологических преобразований выделили 5 этапов в становлении ворсинчатого дерева: Первый этап (4 - 5-ая нед. п.о.). Характеризуется тем, что из равномерно рассеянных ворсин по окружности хориального мешка формируются два полюса гладкий хорион и ранняя плацента – ветвистый хорион, который на 4-ой нед. гестации состоит из 4-5 генераций мезенхимальных пролиферации ворсинах ворсин. В стенке цитотрофобласта эпителиальный хориального составил покров имеет 34%. В мешка индекс мезенхимальных двухслойное строение с непрерывными ядрами ЦТ и сплошным слоем СТ, его площадь составляла 4863± 248 мкм² (p > 0,05). Цитотрофобласт ворсин активно пролиферирует, что подтверждается количеством Ki-67 позитивных клеток равным 29%. В дистальных отделах видны остатки клеточных колонн в виде сплошных участков цитотрофобласта без синцититрофобласта, явную активность инвазирующего цитотрофобласта подтверждал маркер Ki-67, выявивший 96% - позитивных клеток. По данным последних лет [49, 89, 90, 152, 167], низкокислородное окружение вокруг хориального мешка < 20 мм Hg до 10-12 нед. гестации, стимулирует образование цитотрофобластического щита, рост ворсин плаценты, а также инвазию цитотрофобласта в спиральные артерии стенки матки. Научные данные [49] говорят о том, что пролиферацию экстравилезного ЦТ стимулирует TGFβ3 фактор, при высоком содержании Hif-1α, это препятствует дифференцировке цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, и стимулирует внедрение ЦТ в спиральные артерии матки, что способствует нормальному течению беременности. Эти исследования подтверждаются нашими данными о высокой пролиферативной активности ЦТ. 102 В межворсинчатом пространстве были выявлены многоядерные симпласты имевшие отрицательную реакциию с маркерами Ki-67, β-ХГЧ и ПЩФ. На этом этапе в эпителии ворсин иммуногистохимическая реакция с антителом против ПЩФ имел отрицательную реакцию. Однако на электронно-микроскопических снимках были выявлены формирующиеся микроворсинки. Возможно, отрицательная реакция свидетельствует о том, что формирование микроворсинок уже идет, но столь активных метаболических и транспортных процессов не происходит. Вместе с тем наблюдалась слабая реакция с антителом против β-ХГЧ в инвазирующем ЦТ и трофобластическом эпителии, а также отрицательная реакция в стенке хориального вышепредставленные мешка данные и свободных свидетельствуют симпластах. о Все начинающейся морфологической специализации трофобластического эпителия. На 4 – 5 нед. п.о. по данным ультразвукового исследования копчико-теменной (КТР) размер эмбриона равен 5-9 мм. Второй этап (6 и 7-ая нед.). В этот период происходит рост плаценты за счет увеличения числа боковых генераций, при этом площадь стромы и трофобластического эпителия отличается слабой тенденцией к росту (4744 ±282 мкм²; p > 0,05). Об активности роста можно судить по выявлению иммунопозитивных клеток ЦТ с помощью маркера Ki-67. Так, в ЦТ эпителия промежуточных ворсин выявлено 78% иммуноокрашеных Ki-67 положительных клеток на 6-ой неделе и 34% - на 7-ой неделе гестации. В цитотрофобласте мелких генераций ворсин также выявлена иммунопозитивная реакция с маркером Ki-67 на 6-ой неделе - 36%, а на 7ой неделе - 21% клеток. Количество свободных симпластов на этом этапе достигало максимума, но с иммуногистохимическим маркером пролиферации Ki-67 и с антителом против ПЩФ, реакция 103 была отрицательной. В противоположность тому с антителом против β-ХГЧ выявлялась выраженная степень окрашивания, что подтверждает данные о их иммуногистохимической активности [52]. На электронно-микроскопических снимках в эпителии видны крупные секреторные гранулы, что свидетельствует о его высокой секреторной активности. Усложнение эпителия ворсин находит свое отражение в появлении инвагинаций плазмолеммы в базальной части цитотрофобласта по типу базального лабиринта. На апикальной поверхности СТ микроворсинки становятся более выраженными. Эти морфологические изменения эпителия направлены на выполнение им меатаболической и транспортных функций. По данным литературы, на 6– ой нед. гестации масса плаценты равна 6г., а масса плода - 1 г., [10] при КТР – 14 мм., на 7-ой неделе соответственно масса плаценты достигает 8 г., при массе эмбриона 2г. [10], а его КТР – 20 мм. Третий этап (8, 9 и 10-ая нед.). В этом гестационном периоде у плода происходит активный органогенез, который представляется возможным только при полноценном гемохориальном обмене, устанавливающемся в конце 8-ой недели. С помощью современных эхо-сканеров и цветового Допплера кровоток внутри ворсин был обнаружен на 8-ой неделе преимущественно в периферических зонах плаценты [89, 147]. В связи с этим происходит морфологическая перестройка ворсинчатого дерева. Начиная с 8-ой нед. увеличилась общая площадь ворсин в 1,8 раза, это происходит за счет синцитиальных почек. В 1,6 раза стал толще трофобластический эпителий, это происходит вследствии образования отростков клетками ЦТ в сторону стромы ворсин и приводит к неровным очертаниям базального слоя эпителия, а также за счет увеличения высоты микроворсинок. В эпителии ворсин плаценты, синтициальных почках и свободных симпластах в этом периоде мы наблюдали выраженную степень 104 иммуноэкспрессии β-ХГЧ. Это позволило нам, вне зависимости от собранного анамнеза, убедиться в том, что плацентарная ткань взята при неосложненной беременности, так как по данным литературы в этот и предыдущий гестационный срок содержание β-ХГЧ в сыворотке крови увеличивается и достигает своего максимума [114]. Начиная с 9 недели впервые регистрируется умеренная, а к 10-неделе выраженная иммуноэкспрессия ПЩФ. Иммуноэкспрессия наблюдалась в цитоплазме СТ эпителия стволовых и ПЩФ промежуточных ворсин, а также в зоне щеточной каймы, свободных симпластах и синцитиальных почках. Сведения о сроках появления ПЩФ противоречивы. Так, по данным одних авторов, она появляется в сроке 7 недель [141], по другим сведениям, с 8-ми недель [148], и с 16-ти недель гестации [15]. Возможно, такое разногласие обусловлено не точностью определения срока гестации, в связи с тем, что в литературе не указано, как рассчитывался срок беременности. Согласно полученным нами данным, развитие нормально протекающей беременности сопровождается увеличением иммуноэкспрессии ПЩФ в эпителии ворсин плаценты. Возможно, что синтез ПЩФ по времени приурочен к началу маточноплацентарного кровотока, который до срока 9-и нед. гестации был заблокирован цитотрофобластическими пробками, которые препятствовали попаданию материнских эритроцитов в межворсинчатое пространство [89]. Необходимость появления ПЩФ имеет отношение к складывающимся реологическим условиям. Вероятнее всего ПЩФ действует в тесном контакте с аннексином V и оксидом азота, предотвращая мембранозависимую активацию коагуляции материнской крови [9, 15], предупреждая свертываемость материнской крови. Также в этот период становится необходимым увеличение интенсивности белкового и углеводного синтеза и активации остеогенеза плода, в чем принимает участие ПЩФ. 105 Пролиферативная активность ЦТ ворсин резко идет на спад. Так, на 9 - 10 неделях обнаружено всего 2% Ki-67 иммуноположительных клеток в цитотрофобласте мелких ворсин. Электронно-микроскопическое исследование позволило проследить усложнение в морфологии микроворсинок, более извитые инвагинации плазмолеммы в базальной части ЦТ и формирующуюся базальную мембрану. Все изменения подтверждают подготовку морфологической структуры эпителия ворсин к началу кровотока в межворсинчатом пространстве. Свободные традиционно симпласты, считаются уходящие продуктом в материнский патологии плаценты, кровоток, так как выявлялись у женщин с преэклампсией [45]. Возможно, они отражают постоянство количественных соотношений между ЦТ и СТ [45], либо являются регуляторами гемостаза, а также, будучи мигрантами в легочную ткань матери, индуцируют ее иммунную толерантность к плоду [52, 168]. По нашим данным, количество свободных симпластов в течение I триместра кардинально изменяется, достигнув пика в сроке 7 недель гестации, начинает постепенно снижаться, что является новым фактом в плацентологии, хотя смысл подобных количественных эволюций пока не ясен. Иммуногистохимическая характеристика свободных симпластов соответствует таковой пролиферативной свободные в эпителии активности. симпласты Это являются ворсин, позволяет за исключением предположить, что высоко-специализированными структурами. Таким образом, по нашим данным, морфогенез плаценты в I-ом триместре физиологической беременности не является изолированным процессом, напротив, сопряженные процессы развития стромы, сосудов и трофобластического эпителия в развивающихся ворсинах тесно связаны и определялись меняющимися условиями микроокружения эмбриона: от 106 низкокислородной среды и анаэробного типа питания к высокоэффективному гемохориальному обмену и высокоому напряжению кислорода, равному 40 mmHg, в межворсинчатом пространстве [167]. Этому способствует ряд морфологических и функциональных особенностей: сохраняется высокая секреторная активность СТ, которая подтверждается иммуноэкспрессией ПЩФ и β-ХГЧ. Благодаря тому, что иммуноэкспрессия ПЩФ имеет выраженный характер, можно судить об активности транспортных процессов. Выраженность экспрессии ПЩФ в СТ эпителия ворсин коррелирует с ее количеством в сыворотке крови беременных женщин и может служить диагностическим и прогностическим маркером в развитии беременности и нарушения фето-плацентарного комплекса [158]. Примечательно, что ПЩФ в крови беременной женщины регистрируется с 3 – 4 недели у 6,8%, но ее появление в столь ранние сроки нельзя объяснить продукцией ПЩФ плацентарной тканью, так как она ещё практически отсутствует. Вопрос об источнике сывороточной ПЩФ остаётся открытым. С 4-го месяца беременности, после завершения периода формирования плаценты, частота обнаружения и титр ПЩФ в кровотоке матери начинают возрастать с 13,3 до 68,7% и 1-1/8 титра (1-8 ЕД Боданского, соответственно) к 8-му месяцу. Значительное увеличение частоты обнаружения ПЩФ в сыворотке крови наблюдается с 5-го месяца беременности. К концу беременности количество ПЩФ в сыворотки крови соответствует 8-32 ЕД Боданского, а частота ее обнаружения составляет 100% [15]. В свою очередь известным фактом является то, что синтез ПЩФ стимулируется эстрогенами, применение которых поможет избежать развития патологий фето-плацентарного комплекса [2]. Дифференцировка и морфологическая перестройка эпителия направлена в сторону редукции ЦТ ворсин, за счет этого капилляры приближаются к эпителию, также происходит усложнение в строении 107 плазмолеммы ЦТ в базальной части эпителия за счет увеличения числа инвагинаций. Все изменения направлены на укорочение дистанции между лакунами с кровью матери и сосудами плода, что в дальнейшем будет способствовать гемохориальному обмену. Таким образом, наблюдается адаптация плаценты к изменяющимся условиям жизнеобеспечения плода. Середина II триместра характеризуется быстрым ростом плода, который к 20 неделе п.м. достигает 276-380 грамм, с дальнейшей прибавкой к 24 неделям п.м. до 560-600г., в то время как прибавка массы плаценты за этот же временной промежуток составляет 150-185 г. [10]. В результате активного роста плода изменяются и его потребности в питании, газообмене и обеспечении других жизненно важных функций. Чтобы соответствовать требованиям плода, плацента морфологически перестраивается. Четвертый этап (18 -24-ая нед. п.м.). В этот период ворсинчатое дерево плаценты характеризуется интенсивным ростом ветвей в длину и дифференцировкой ворсин на три типа: 1) опорные, 2) промежуточные незрелые, 3) промежуточные дифференцированные ворсины. В промежуточных дифференцированных ворсинах наблюдается укорочение эпителиально-капиллярной дистанции, что подтверждается нашими данными об отсутствии второго слоя эпителия – ЦТ ворсин и морфометрическими характеристиками: площадь эпителия уменьшилась в 1,9 раза по сравнению с 9-10 неделями. Увеличение промежуточных ворсин и терминальных ворсин, более мелких в своем диаметре, отражается и в морфометрической характеристике, диаметр ворсин в сравнении с 9 – 10 неделями уменьшился в 1,9 раз. Плазмолемма трофобластического эпителия в базальной части имела множественные инвагинации, которые обеспечивают увеличение транспортной поверхности и усложнившиеся обменные процессы. Важнейшей функцией плаценты является синтез и секреция широкого спектра биологически 108 активных веществ белковой природы. Многочисленные плацентарные белки (более 60) выполняют роль гормонов, рецепторов, факторов роста, ингибиторов, иммунорегуляторных агентов, транспортных и связывающих белков. О возросшем синтезе ПЩФ свидетельствует выраженная степень ее иммуноэкспрессии в области щеточной каймы, в плазмолемме базальной части трофобласта, где ПЩФ выявляется в виде неровной линии. Возможно, такое распределение ПЩФ свидетельствует об осуществлении транспортных процессов направленных в сторону плода. Иммуноэкспрессия ПЩФ в свободных симпластах также имеет выраженную степень. Все выше представленные данные свидетельствуют о том, что морфогенез плаценты во II триместре всецело направлен на обеспечение возрастающих потребностей плода, это находит свое отражение в активном росте и ветвлении ворсинчатого дерева, в котором преобладают терминальные ворсины, в изменении эпителиального покрова, что проявляется в редукции ворсинчатого цитотрофобласта, усложнении плазмолеммы трофобласта в базальной части эпителия, все изменения в результате приводят к истончению эпителиально-капиллярной дистанции, и началу эффективного гемохориального кровоснабжения, что способствует быстрому темпу роста плода. Пятый этап (39 – 40 нед. п.м.). В конце беременности ворсинчатое дерево представлено преимущественно терминальными и терминальными специализированными ворсинами, что подтверждается минимальными значениями их площади. Средняя площадь наружной границы ворсин составила 3476 ±220 мкм² (р<0,001), что меньше в 4,9 раза, чем во II триместре беременности. дифференцировки В эпителия этом сроке ворсин в наблюдалось завершение сторону образования синцитиокапиллярных мембран, средняя площадь эпителия составила 786 ± 35 мкм² (р<0,001), что меньше в 4,2 раза, чем в предыдущем триместре. 109 Отсутствие роста ворсинчатого дерева подтверждалось негативной реакцией с антителом против Ki-67 в эпителии всех типов ворсин. Истончение эпителиального покрова и наличие синцитиокапиллярных мембран обеспечивает реализацию возрастающих потребностей плода и его значительную прибавку в весе [10, 12]. Синцитиокапиллярная мембрана представляет собой тонкий, безъядерный участок цитоплазымы синцитиотрофобласта, общую базальную мембрану с эндотелием и истонченный участок эндотелиоцита плодного капилляра. По стереогистохимическим данным [129], в сроке 37 - 40 нед. средняя площадь барьера складывается из толщины эпителия (1,9-2,1 мкм²) и капилляра (1,14-1,25 мкм²). В результате трансформация ворсин направлена для облегчения диффузионных процессов, что подтверждается выраженной имуноэкспрессией ПЩФ в виде толстой сплошной зоны в щеточной кайме и более тонкой линии в базальном полюсе эпителия. Возможно, выраженная экспрессия ПЩФ на поверхности микроворсинок реализует также тромболитический эффект. Иммуногистохимическая реакция с антителом против β-ХГЧ выявлена в слабой степени, это коррелирует с минимальным содержанием β-ХГЧ в сыворотке крови [114]. Редукция цитотрофобласта ворсин, изменение эпителиального покрова ворсин, появление синцитиокапиллярных мембран, а также количественная редукция свободных симпластов в межворсинчатом пространстве свидетельствуют о заключительном этапе в формировании ворсинчатого дерева плаценты. В результате исследования была прослежена динамика структуры эпителия ворсин, которая тесно связана с развитием ворсинчатого дерева от ворсинчатого хориона, до финального этапа развития плаценты в конце беременности. Морфологическое становление эпителия ворсин включает в себя структурные и функциональные преобразования, обеспечивающие меняющийся характер и тип питания эмбриона, а затем плода. 110 1. На основании ВЫВОДЫ морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты, включающей в себя динамику изменения цитотрофобласта, синцитиотрофобласта, свободных симпластов и синтициальных почек, выделены 5 этапов в течение всего периода морфогенеза плаценты. 2. Первый этап (4 – 5 недель п.о.) заключается в дифференцировке ворсин, окружающих хориальный мешок, с выделением зоны ветвистого хориона. В увеличивающихся генерациях ворсин эпителий представлен цитотрофобластом активностью 78% (маркер с Ki-67) высокой и пролиферативной синцитиотрофобластом с поверхностными микроворсинками. Слабая степень иммуноэкспрессии β-ХГЧ в инвазирующем цитотрофобласте и цитотрофобластическом эпителии. Площадь эпителия составляет 4863,2 ±248,9 мкм² (р>0,05). Двухслойный трофобластический эпителий расположен на тонкой, рыхлой базальной мембране. 3. Второй этап (6 – 7 неделя п.о.) развития плаценты характеризуется дальнейшим ростом боковых генераций ворсин, среднее значение площади которых составляет 19705,5 ±1844,9 мкм² (р>0,05), что обеспечивается высокой пролиферативной активностью клеток цитотрофобласта ворсин. В эпителии стволовых ворсин – 65% Ki-67 позитивных ядер, в отходящих боковых генерациях – 78%, в эпителии мелких ворсин - 36%. Иммуноэкспрессия плацентарной щелочной фосфатазы не выявлена. Обнаружены инвагинации плазмолеммы цитотрофобласта в его базальной части. 4. Третий этап (8 – 10 недели п.о.) характеризуется максимальной площадью эпителия (6370,7 ±433,0 мкм², р<0,05), началом иммуноэкспрессии плацентарной щелочной фосфатазы в зоне щеточной каймы, протяженными участками ворсин без цитотрофобласта и понижением его пролиферативной активности: в эпителии опорных 111 ворсин - 12% Ki-67 иммунопозитивных ядер, в эпителии промежуточных ворсин - 8% Ki-67 иммунопозитивных ядер и 5% - в трофобластическом эпителии терминальных ворсин. Происходит дальнейшее увеличение протяженности и ветвления инвагинаций плазмолеммы цитотрофобласта в базальной части. 5. Четвертый этап (18 – 24 недели п.м.) отличается дифференцировкой ворсин на опорные, активной промежуточные и терминальные ветви с уменьшением наружной (17017,7 ±2030,8 мкм²; р<0,001) и внутренней границ трофобластического эпителия (13731,8 ±1753,1 мкм²; р<0,001) и значительной редукцией его площади (3285,9 ±291,5; р<0,001). Маркер пролиферации имеет негативную реакцию в эпителии всех типов ворсин, кроме терминальных, там его количество составляет 0,5 %. Инвагинации плазмолеммы цитотрофобласта имеют более сложное строение. Плацентарная щелочная фосфатаза локализуется в области микроворсинок и в плазмолемме базальной части цитотрофобласта, то есть имеет двухслойное распределение. 6. Пятый этап (39 – 40 недели п.м.) завершается дальнейшим усложнением ворсинчатого дерева за счет доминирования терминальных ворсин с минимальными значениями площади трофобластического эпителия, которая равна 786,2±35,3 мкм² (р<0,001). Появляются синцитиокапиллярные мембраны (истончение плацентарного барьера). Сохраняется выраженная двухслойность иммуноэкспрессии плацентарной щелочной фосфатазы в эпителии всех типов ворсин. 7. Среди производных трофобластического эпителия ворсин наиболее значимые изменения выявлены в количестве свободных симпластов, отшнуровавшихся от синцитиотрофобласта и представляющих собой многоядерные структуры, окруженные микроворсинками с иммуноэкспрессией ПЩФ, β-ХГЧ. Количество свободных симпластов достигает максимума на 7 неделе п.о. и составляет 174 образования на 112 100 ворсин, затем происходит их количественная редукция на 8 нед. п.о. до 115; на 9 -10 нед.п.о. – до 68; на 18 – 24 нед.п.м. их количество составило 16; а на 39 – 40 нед.п.м. - 5. 8. Морфология микроворсинок прослежена на протяжении всего периода гестации. Первые формирующиеся микроворсинки выявлены на 5 нед.п.о., на 7 нед.п.о. они были выше и имели колбообразную форму, на 8 нед.п.о. имели ветвящуюся структуру, на 9 нед.п.о. были крупные, цилиндрической формы, к концу беременности (39-40 нед. п.м.) - редкие, а в области синцитио-капиллярных мембран микроворсинки отсутствовали. 9. Инвагинации плазмолеммы базальной части цитотрофобласта и синцитиотрофобласта были прослежены в течение всего периода морфогенеза плаценты. На 6 нед.п.о. отмечены первые редко расположенные инвагинации претерпевающие в плазмолеммы дальнейшем усложнение, цитотрофобласта, образуя длинные переплетающиеся пальцевидные впячивания к 8 – 9 нед.п.о. с формированием широкого слоя инвагинаций по типу базального лабиринта в цито и синцитиотрофобласте к 18-24 нед.п.м.. Наряду с этим наблюдается образование отростков базальной части трофобласта, внедряющихся в строму ворсин. Практические рекомендации 1. Сведения о морфологической структуре и активности функциональной эпителия ворсин на разных этапах гестационного периода рекомендуется использовать в акушерской практике, в работе патолого-анатомических служб для понимания причин и механизмов возникновения осложнений беременности. 2. При морфофункциональной оценке фето-плацентарного комплекса необходимо учитывать особенности строения ворсинчатого дерева, 113 уровень иммуноэкспрессии ПЩФ, β-ХГЧ и количество Ki-67 позитивных клеток в эпителии ворсин. 114 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Анастасьева В.Г. Морфофункциональные нарушения фето- плацентарного комплекса при плацентарной недостаточности. - Н-ск., 1997. - 508 с. 2. Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Николаева Ю.А.. Взаимосвязь пролиферативного статуса хорионического цитотрофобласта гонадотропина и с уровнем патологией развития плаценты//Журнал акушерства и женских болезней. - 2007. - № 1.С.129 - 140. 3. Беда Н.А. Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в иммунохимической оценке течения беременности и некоторой онкопатологии. Дис…к.м.н. / Российский государственный медицинский университет - 2002. -142с. 4. Волощук И.Н., Фидлер Р., Милованов А.П., Вербицкий М.Ш. Использование моноклональных хорионического гонадотропина антител для к в-субъединице исследования плаценты человека// Актуальные вопросы современной гистопатологии. М., 1988. — С. 42— 43. 5. Дубова Е.А., Павлов К.А., Есаян Р.М., Наговицына М.Н., Ткачева О.Н., Шестакова М.В., Щеголев А.И. Морфометрическая характеристика плаценты, страдающих диабетом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2011.- № 5.- С. 589-593. 6. Жантиева Е.М. Активность ферментов в плаценте при нарушении жизнедеятельности новорожденных. //Акушерство и гинекология. 1980. - №8. - С. 48-51. 7. Жантиева Е.М., Колодько В.Г. Содержание стероидных гормонов и активность термостабильного изофермента щелочной фосфатазы в крови женщин при беременности высокого риска.// Акушерство и гинекология. 1980. - №12. - С. 33-36. 115 8. Кадыров М. Становление компонентов плацентарного барьера в процессе гестации и его патология при нарушениях маточноплацентарно-плодного кровотока: Автореф. Дис...к.м.н. / Акад. мед. наук НИИ морфологии человека. -1991. -20с. 9. Милованов А.П., Кирющенков П.А., Шмаков Р.Г. и др. Плацентарегулятор гемостаза матери. //Акушерство и гинекология. - 2001. №3. - С. 3-5. 10. Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод: Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1999. -448с. 11. Москаленко Н.П. Иммунохимическое исследование плацентарной щелочной фосфатазы у беременных женщин при поздних гестозах: Дис...к.м.н. – Российский Государственный Медицинский Университет.- 2005. -124с. 12. Павлов К.А., Дубова Е.А., Щеголев А.И. Фетоплацентарный ангиогенез при нормальной беременности: роль сосудистого эндотелиального фактора роста // Акушерство и гинекология. 2011. № 3. С. 11—16. 13. Сухарев А.Е. Тканевые и сывороточные острофазовые белки в клинической оценке неспецифических заболеваний и рака легких: Автореф. дис... д.м.н. - Астрахань, 1992. - 28 с. 14. Сухарев А.Е., Булах Н.А., Ахушкова Л.М. Плацентарная щелочная фосфатаза – маркер эмбриональных и малингизированных тканей // Фундаментальные исследования. – 2011. – №4. – С. 41-46. 15. Сухарев А.Е., Вайчулис Ю.В., Асфандияров Р.И., Панченко Л.Ф. и др. Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в клинико-лабораторной оценке факторов повышенного геморрагического риска в акушерстве: монография. -Астрахань, 2006. - С. 44-67. 116 16. Цирельников Н.И., Сенчук С.А., Манваладзе Н.З., Цирельникова Т.Г. Активность плацентарной щелочной фосфомоноэстеразы при нормальной и осложненной беременности. // Тезисы докл. Съезда акушеров-гинекологов. РСФСР. - Москва, с. 1987. – С. 234 – 235. 17. Щеголев А.И., Дубова Е.А., Павлов К.А., Ляпин В.М., Куликова Г.В. Шмаков Р.Г. Морфометрическая характеристика терминальных ворсин плаценты при преэклампсии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2012.- № 7. - С. 104-107. 18. Abdallah M.A., Lei Z.M., Li X., Greenwold N., Nakajima S.T., Jauniaux E., Rao C.V. Human. Fetal nongonadal tissues contain human chorionic gonadotropin/luteinizing hormone receptors // J Clin Endocrinol Metab.2004; №89. - Р. 952–956. 19. Adler R., Ng A., Rote. N. Monoclonal antiphosphatidylserine antibody inhibits intercellular fusion of the choriocarcinoma line // Biol Reprod. – 1995. -№53. - Р. 905-910 20. Ahmed A., Dunk C., Ahmad S., Khaliq A. //Regulation of placental vascular endothelial growth factor (VEGF) and placenta growth factor (PIGF) and soluble Flt-1 by oxygen -a review.//Placenta. - 2000 Mar-Apr. – Р. 16-24. 21. Akoum A., Metz C.N., Morin M. Marked increase in macrophage migration inhibitory factor synthesis and secretion in human endometrial cells in response to human chorionic gonadotropin hormone //J Clin Endocrinol Metab. – 2005. - №90. – Р. 2904–2910. 22. Albe K.R., Witkin H.J., Kelley L.K., Smith C.H. Protein kinases of the human placental microvillous membrane //Exp. Cell Res. -1983. №147. Р. 167-176. 23. Al-Zuhair A.G., Ibrahim M.E., Mughal S., Abdulla M.A. Loss and regeneration of the microvilli of human placental syncytiotrophoblast //Arch Gynecol. – 1987. №240(3). - Р. 147-51. 117 24. Armant D.R. Blastocysts don’t go it alone. Extrinsic signals finetune the intrinsic developmental program of trophoblast cells //Dev Biol. – 2005.№ 280. - Р. 260–80. 25. Aumailley M., Smith N. The role of laminins in basement membrane function //J Anat. – 1998. - July; 193 (Pt 1). - Р. 1–21. 26. Azuma K., Calderon I., Besanko M., MacLachlan V., Healy D.L. Is the luteo-placental shift a myth? Analysis of low progesterone levels in successful art pregnancies //J Clin Endocrinol Metab. – 1993. -№77. – Р. 195–198. 27. Baczyk D., Satkunaratnam A., Nait-Oumesmar B., Huppertz B., Cross J.C., Kingdom J.C. Complex patterns of GCM1 mRNA and protein in villous and extravillous trophoblast cells of the human placenta //Placenta. - 2004. - №25. – Р. 553–559. 28. Baergen R.N. Manual of Benirschke and Kaufmann's pathology of the human placenta. - New York, 2005. pp. 72–74. 29. Bardawil W.A., Toy B.L. The natural history of choriocarcinoma: problems of immunity and spontaneous regression //Аnnals of the New York Academy of Sciences, 1959. - №80. – Р. 197–261. 30. Barry B. Serum Heat-Stable Alkaline Phosphatase in Pregnancy complicated by Hypertension// Journal of Obstetrics and Gynecology British Commonwealth. – 1970. № 77. –Р. 990-993. 31. Beckman G., Beckman L., Holm S., Sikström C., Wennberg C. Placental alkaline phosphatase types and transplacental IgG transport //Hum Hered. - 1995. - Jan-Feb. Р. 45(1):1-5. 32. Benirschke K., Kaufmann P. Pathology of Human placenta. - New York: Springer-Verlag, 1995. - 720р. 33. Benirschke K., Kaufmann P. Pathology of the human placenta (2nd ed.). New York: Springer-Verlag, 1990. - 947р. 118 34. Bentouati L., Samadi M., Hachem H. et al. Hyperphosphatasemia related to three intestinal alkaline phosphatase isoforms: biochemical study //Clinica Chimica Acta. - 1990. - №189. - P. 145-152. 35. Bernatchez P.N., Soker S., Sirois M.G. Vascular endothelial growth factor effect on endothelial cell proliferation, migration, and platelet-activating factor synthesis is Flk-1-dependent //J Biol Chem. – 1999. №274. – Р. 31047–31054. 36. Berndt S., Blacher S., d'Hauterive P.S., Thiry M., Tsampalas M., Cruz A., Pequeux C., Lorquet S., Munaut C., Noel A., Foidart J.M. Chorionic gonadotropin stimulation of angiogenesis and pericyte recruitment //J Clin Endocrinol Metab. – 2009. №94. – Р. 4567–4574. 37. Billingsley S.A., Wooding F.B. An immunogold, cryoultrastructural study of sites of synthesis and storage of chorionic gonadotropin and placental lactogen in human syncytiotrophoblast //Cell Tissue Res. – 1990. Aug. 261(2). Р. 375-82. 38. Bischof P., Irminger-Finger I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon //Int J Biochem Cell Biol. – 2005. -№37. – Р. 116. 39. Blond J.-L., Lavillette D., Cheynet V., Bouton O., Oriol G., ChapelFernandes S., Mandrand B., Mallet F., Cosset, F. L. An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor //J Virol. – 2000. -№74. –Р. 3321-3329. 40. Boyd J. D., Hughes A. F. W. Observations on human chorionic villi using the electron microscope //J Anat. – 1954. - July; 88(Pt 3). – Р. 356–362.3. 41. Bratbury F.M., Oscleford C.D. A confocal and conventional epifluorescence microscope study of intermediate filaments in chorionic villi //Anatomy. -1990. - №160. - P.173-189. 119 42. Brescia R.J., Kurman R.J., Main C.S., Surti U., Szulman AE. Immunocytochemical localization of chorionic gonadotropin, placental lactogen, and placental alkaline phosphatase in the diagnosis of complete and partial hydatidiform moles //Int J Gynecol Pathol. – 1987. - №6(3). – Р. 213-29. 43. Brown K., Heller D.S., Zamudio S., Illsley N.P. Glucose transporter 3 (GLUT3) protein expression in human placenta across gestation // Placenta. – 2011. - Dec;32(12). – Р. 1041-9. 44. Burton G.J., Hempstock J., Jauniaux E. Nutrition of the human fetus during the first trimester // Placenta. – 2001. - № 22. – Р. 70-76. 45. Burton G.J., Jones C.J. Syncytial knots, sprouts, apoptosis, and trophoblast deportation from the human placenta //Taiwan J Obstet Gynecol. – 2009. №48(1). Р. 28–37. 46. Burton G.J. Deportation of syncytial sprouts from the term human placenta // Placenta. – 2011. – №32(1). - Р.96–98. 47. Burton G.J. The fine structure of the human placental villus as revealed by scanning electron microscopy //Scanning Microsc. – 1987. Dec. 1(4). – Р. 1811-28. 48. Caniggia I., Taylor C.V., Ritchie J.W., Lye S.J., Letarte M. Endoglin regulates trophoblast differentiation along the invasive pathway in human placental villous explants //Endocrinology – 1997. -№138. – Р. 4977– 4988. 49. Caniggia I., Winter J., Lye S.J., Post M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia // Placenta. – 2000. Mar-Apr. - №21. – Р. 25-30. 50. Castellucci М., Kosanke G., Verdenelli F., Huppertz B., Kaufmann P. Villous sprouting: fundamental mechanisms of human placental development //Hum. Reprod. Update. – 2000. - №6(5). – Р. 485-94. 120 51. Caulfield J.J., Sargent I.L., Ferry B.L., Starkey P.M., Redman C.W. Isolation and characterisation of a subpopulation of human chorionic cytotrophoblast using a monoclonal anti-trophoblast antibody (NDOG2) in flow cytometry // J Reprod Immunol. – 1992. - №21. – Р. 71–85. 52. Chamley L.W., Chen Q., Ding J., Stone P.R., Abumaree M.Trophoblast deportation: just a waste disposal system or antigen sharing? //J Reprod Immunol. – 2011. Mar. - №88(2). – Р. 99-105. 53. Charnock-Jones D.S. & Burton G.J. Placental vascular morphogenesis. Baillie`re’s Best Practice & Research //Clinical Obstetrics & Gynaecology. – 2000. -№14. – Р. 953–968. 54. Chen L.M., Liu B., Zhao H.B., Stone P., Chen Q., Chamley L. IL-6, TNFalpha and TGFbeta promote non-apoptotic trophoblast deportation and subsequently causes endothelial cell activation //Placenta. – 2010. №31(1). – Р.75–80. 55. Chen Q., Stone P., Ching L.M., Chamley L. A role for interleukin-6 in spreading endothelial cell activation after phagocytosis of necrotic trophoblastic material: implications for the pathogenesis of pre-eclampsia // The Journal of Pathology. – 2009. - №217(1). – Р.122–131. 56. Chen Q., Stone P.R., McCowan L.M., Chamley L.W. Phagocytosis of necrotic but not apoptotic trophoblasts induces endothelial cell activation // Hypertension. – 2006. -№47(1). - Р. 116–121. 57. Chua S., Wilkins T., Sargent I., Redman C. Trophoblast deportation in pre-eclamptic pregnancy //Br J Obstet Gynaecol. – 1991. Oct. - №98(10). –Р. 973-9. 58. Conley A.J., Mason J.I. Placental steroid hormones //Baillieres Clin Endocrinol Metab. – 1990. Jun. -№4(2). – Р. 249-72. 59. Crocker I.P., Cooper S., Ong S.C., Baker .PN. Differences in apoptotic susceptibility of cytotrophoblast and syncytiotrophoblast in normal 121 pregnancy to those complicated with preeclampsia and intrauterine growth restriction //Am J Pathol. – 2003. - №162. – Р. 637–643. 60. Dabare A.A., Nouri A.M., Cannell H., Moss T., Nigam A.K., Oliver R.T. Profile of placental alkaline phosphatase expression in human malignancies: effect of tumour cell activation on alkaline phosphatase expression // Urol Int. – 1999. - №63(3). – Р. 168-74. 61. Demir R., Kaufmann P., Castellucci M. Fetal vasculogenesis and angiogenesis in human placental villi //Acta Anat. – 1989. - №136. – Р. 190-203. 62. Demsey E.W., Wislocki G.B. Histochemical Reactions Associated with Basophilia and Acidophilia in the Placenta and Pitutary gland //The American Journal of Anatomy. – 1945. - №76(3). Р. 277-295. 63. Devisme L., Merlot B., Ego A., Houfflin-Debarge V., Deruelle P., Subtil D. A case-control study of placental lesions associated with pre-eclampsia //Int J Gynaecol Obstet. – 2013. Feb. - №120(2). – Р. 165-8. 64. d'Hauterive S.P., Berndt B.S., Tsampalas M., Charlet-Renard C., Dubois M., Bourgain C., Hazout A., Foidart J.B., Geenen V. Dialogue between Blastocyst hCG and Endometrial hCG/LH Receptor: Which Role in Implantation? //Gynecol Obstet Invest. – 2007. - №64. – Р. 156–160. 65. Douglas G.W., Thomas L., Carr M., Cullen N.M., Morris R. Trophoblast in the circulating blood during pregnancy //American Journal of Obstetrics and Gynecology. – 1959. - №78. – Р. 960–973 66. Dunk C., Shams M., Nijjar S., Rhaman M., Qiu Y., Bussolati B., Ahmed A. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 activate trophoblast Tie-2 to promote growth and migration during placental development //Am J Pathol. – 2000. - №156. – Р. 2185–2199. 67. Enders A.C., Mead R.A. Progression of trophoblast into the endometrium during implantation in the western spotted skunk //Anat Rec. – 1996. - № 244. – Р. 297–315. 122 68. Endo T., Higashino K., Hada T. Et al. Structures of the Asparagine-linked Oligosas-charides of an Alkaline Phosphatase, Kasahara Isozyme, Purified from FL Amnion Cells // Cancer Resaarch. - 1990. - №50. - P. 1079-1084. 69. Fisher, S.J., Leitch, M.S., and Laine, A. External labelling of glycoproteins from first-trimester human placental microvilli // Biochem. J. – 1984. - №221. – Р. 821-828. 70. Fishman W.H., Bardawil W.A., Habib H.G., Anstiss C.L .and Green S. The placental isoenzyme of alkaline phosphatase in sera of normal pregnancy // American Journal of Clinical Pathology. – 1972. - №57. –Р. 65-74. 71. Fox H., Agrafojo-Blanco A. Scanning electron microscopy of the human placenta in normal and abnormal pregnancies.// Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 1974. - №4(2). – Р. 45-50. 72. Frendo J.-L., Cronier L., Bertin G., Guibourdenche J.,Vidaud M.,Brion D.-E., Malassiné A. Involvement of Connexin 43 in human trophoblast cell fusion and differentiation //J Cell Sci. – 2003. Aug - №15. – Р. 341321. 73. Frendo J.-L., Thérond P., Guibourdenche J., Bidart J.-M., Vidaud M. and Evain-Brion, D. Modulation of copper/zinc Superoxide Dismutase expression andactivity with in vitro differentiation of human villous cytotrophoblast // Placenta. -2000. - №21. – Р. 773-781. 74. Fujimoto S., Hamasaki K., Ueda H. Immunoelectron microscope observation on secretion of the humsn placenta lactogen (hPL) in the human chorionic villus //Anst. Rec. - 1996. - №216. -P. 68-72. 75. Fukushima K., Miyamoto S., Tsukimori K., Kobayashi H., Seki H., Takeda S., Kensuke E., Ohtani K., Shibuya M., Nakano H. Tumor necrosis factor and vascular endothelial growth factor induce endothelial integrin repertories, regulating endovascular differentiation and apoptosis in a 123 human extravillous trophoblast cell line //Biol Reprod. – 2005. - №73. – Р. 172–179. 76. Geva E., Ginzinger D.G., Zaloudek C.J., et al. Human placental vascular development: vasculogenic and angiogenic (branching and nonbranching) transformation is regulated by vascular endothelial growth factor-A, angiopoietin-1, and angiopoietin-2 // J Clin Endocrinol Metab. – 2002. №87. – Р. 4213–4224. 77. Gill J.S., Salafia C.M., Grebenkov D., Vvedensky D.D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi //J Theor Biol. – 2011. Dec. - № 21. – Р. 33-41. 78. Gosseye S. and Fox. H. An immunohistological comparison of the secretory capacity of villous and extravillous trophoblast in the human placenta // Placenta. – 1984. - №5. – Р. 329–348. 79. Henley J.D.; Young R.H.; Wade C.L.; Ulbright T.M. Seminomas with exclusive intertubular growth: a report of 12 clinically and grossly inconspicuous tumors // Am-J-Surg-Pathol. - 2004. - Vol. 28, № 9. - P. 1163-8. 80. Herr F., Baal N., Reisinger K., Lorenz A., McKinnon T., Preissner K.T., Zygmunt M. hCG in the regulation of placental angiogenesis. Results of an in vitro study //Placenta. – 2007. - №28. – Р. 85–93. 81. Hohn H.P., Denker H.W. Experimental modulation of cell-cell adhesion, invasiveness and differentiation in trophoblast cells // Cells Tissues Organs. - 2002. - №172. – Р. 218–36. 82. Holmgren P.A., Stigbrand T., Damber M.G. and Schonlz B.W. Serum levels of Placental Alkaline Phosphatase in High Risk Pregnancies //Obstetrics and Gynecology. – 1979. - № 54. – Р. 631-634. 83. Hunter R.J. and Herret J.D. Serum Heat-Stable Alkaline Phosphatase Levels in Normal and Abnormal Pregnancies //Journal of Obstetrics and Gynecology British Commonwealth. – 1973. -№70. – Р. 957-961. 124 84. Huppertz B. Placental villous trophoblast: the altered balance between proliferation and apoptosis triggers pre-eclampsia //J Reproduktionsmed Endokrinol. – 2006. - №3. – Р. 103–108. 85. Hwang J.H., Koh S.H., Han D.I., Chung S.R., Park M.I., Hwang Y.Y., Jang S.J. Expression of transforming growth factor-1, 2 in the decidua of the early pregnancy: Comparison of decidua basalis and decidua parietalis //Korean J Obstet Gynecol. – 2001. - №44. – Р. 1145–9. 86. Iioka H., Hisanaga H., Akada S., Shimamoto T., Yamada Y., Sakamoto Y., Moriyama I.S., et al. Characterization of human placental activity for transport of taurocholate, using brush border (microvillous) membrane vesicles //Placenta. – 1993. – №14(1). – Р. 93-102. 87. Iqbal S.I., Davies T., Holland S. et al. Alkaline phosphatase isoenzymes and Clinical features in hypophosphatasia //Ann.Clin.Bio-chem. - 2000. № 37. - P. 775-80; 88. Jain K., Kavi V., Raghuveer C.V., Sinha R. Placental pathology in pregnancy-induced hypertension (PIH) with or without intrauterine growth retardation //Indian J Pathol Microbiol. – 2007. - №50. – Р. 533–537. 89. James J.L., Stone P.R., Chamley L.W. The regulation of trophoblast differentiation by oxygen in the first trimester of pregnancy //Hum Reprod Update. – 2006. Mar-Apr. - №12(2). – Р. 137-44. 90. Jauniaux E., Gulbis B., Burton GJ. The human first trimester gestational sac limits rather than facilitates oxygen transfer to the foetus--a review //Placenta. – 2003. Apr. - №24. – Р. 86-93. 91. Jauniaux E., Watson A.L., Hempstock J., Bao Y.P., Skepper J.N. and Burton G.J. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. A possible factor in human early pregnancy failure //Am J Pathol. – 2000. - № 157. – Р. 2111–2122. 125 92. Johansen M., Redman C.W., Wilkins T. and Sargent I.L. Trophoblast deportation in human pregnancy—its relevance for pre-eclampsia //Placenta. – 1999. - №20. – Р. 531–539. 93. Johnson P.M., and Brown P.J. The IgG and transferrin receptors of the human syncytiotrophoblast microvillous plasma membrane //Am. J. Reprod. Immunol - 1980. - №1. – Р. 4-9. 94. Jones C.J.P., Fox H. Ultrastructure of the normal human placenta //Electron Microscop Rev. – 1991. - №4. - Р. 129-178. 95. Kamada M., Ino H., Naka O., Irahara M., Daitoh T., Mori K., Maeda N., Maegawa M., Hirano K., Aono T. Immunosuppressive 30-kDa protein in urine of pregnant women and patients with trophoblastic diseases //Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 1993. - №50. – Р.219–225. 96. Kaneda T., Shiraki K., Hirano K., Nagata I. Detection of maternofetal transfusion by placental alkaline phosphatase levels //J. Pediatr. - 1997 May. Vol. 130, - № 5. - P. 730-5. 97. Kastschenko N. Das menschliche Chorionepithel und dessen-Rolle bei der Histogenese der Placenta //Arch. Anat. Physiol., Anat. Abt. - 1885. - № 12. - P. 451-480. 98. Kaufmann P. and Castellucci M. Exstravillous trophoblast in the human placenta //Trophoblast Res. - 1997. - №10. - P. 21-65. 99. Kaufmann P. Development and differentiation of human placental villous tree //Biblthca Anat. - 1982. - №22. - P. 29-39. 100. Kaufmann P., Bruns R., Leiser, M. Luckhardt E., Winterhager. The fetal'vascularisation of term human placental villi. Intermediate and terminal villi //Anat. Embriol. - 1985. - №173. - P. 203-214. 101. Kaufmann P., Senn D.K., Schweikhart G. Classification of human placental villi.// I. Histology P. D.K. Cell Tissue Res. - 1979. - №200. - P. 409-423. 126 102. Kawagoe K., Akiyama J., Kawamoto T., Morishita Y., Mori S. Immunohistochemical demonstration of epidermal growth factor (EGF) receptors in normal human placental villi // Placenta. – 1990. - №11. – Р. 7-15 103. Kawagoe K. Negative surface charge of human trophoblast and its biological role (author's transl). Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 1982 Apr;34(4):497-506. 104. Kingdom J., Huppertz B., Seaward G., Kaufmann P. Development of the placental villous tree and its consequences for fetal growth // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 2000. Sep. - №92(1). – Р. 35-43. 105. Kingdom J.C., Kaufmann P. Oxygen and placental villous development: origins of fetal hypoxia //Placenta. – 1997. Nov. - №18(8).- Р. 613-21. 106. Kliman H.J., Segel L. The placenta may predict the baby //J Theor Biol. – 2003. - №225. – Р. 143–145. 107. Koj A. Metabolic Studies of Acute-phase Proteins// Pathophysiol. Plasma Protein Metab. - 1984. – Р. 221-248. 108. Korhonen M., Virtanen I. Immunohistochemical localization of laminin and fibronectin isoforms in human placental villi //J Histochem Cytochem. – 2001. Mar. - №49(3). – Р. 313-22. 109. Korhonen M, Virtanen I. The distribution of laminins and fibronectins is modulated during extravillous trophoblastic cell differentiation and decidual cell response to invasion in the human placenta //J Histochem Cytochem. – 1997. Apr. - №45(4). – Р. 569-81. 110. Kosanke, G., Castellucci, M., Kaufmann P. et al. Branching patterns of human placenta villous trees: perspectives of topological analysis // Placenta. – 1993. -№14. – Р. 591–604. 111. Kumari S.A., Kumar N.S., Chitra K.Y. Caste variation of two placental phosphatases //Gene. Geogr. - 1996. - №10. - P. 75-77. 127 112. Lafond, J., Auger, D, Fortier, J., and Brunette. M.G. Parathyroid hormone receptor in human placental syncytiotrophoblast brush border and basal plasma membranes //Endocrinology. – 1988. - №123. – Р. 2834-2840. 113. Lash G.E., Postovit L.M., Matthews N.E., Chung E.Y., Canning M.T., Pross H., Adams M.A., Graham C.H. Oxygen as a regulator of cellular phenotypes in pregnancy and cancer //Can J Physiol Pharmacol. - 2002. №80. – Р. 103–109. 114. Laurence A Cole. Biological functions of hCG and hCG-related molecules //Reprod Biol Endocrinol. – 2010. - №8. - Р. 102 115. Leitner K., Szlauer R., Ellinger I., Ellinger A., ZimmerK.P., Fuchs R., Placental Alkaline Phosphatase Expression at the Apical and Basal Plasma Membrane in Term Villous Trophoblasts //J Histochem Cytochem. – 2001. September. - №49, 9. – Р. 1155-1164. 116. Li D., Wen X., Ghali L., Al-Shalabi F.M., Docherty S.M., Purkis P., Iles R.K. hCGβ expression by cervical squamous carcinoma - in vivo histological association with tumor invasion and apoptosis //Histopathology. – 2008. - №53. – Р.147–155. 117. Lessey B.A., Ilesanmi A.O., Lessey M.A., Riben M., Harris J.E., Chwalisz K. Luminal and glandular endometrial epithelium express integrins differentially throughout the menstrual cycle: implications for implantation, contraception, and infertility //Am J Reprod Immunol. – 1996.- № 35. - Р. 195–204. 118. Librach CL, Werb Z, Fitzgerald ML, Chiu K, Corwin NM, Esteves RA, Grobelny D, Galardy R, Damsky CH, Fisher SJ. 92-kD type IVcollagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J Cell Biol 1991; 113: 437– 49. 119. Loch A., Kainz C. Immunohistochemistry in the diagnosis of the gestational trophoblastic disease // Acta Obstet. Gynecol. Scand. - 1996. Sep. Vol.75, № 8. - P. 753-6. 128 120. Loregger T., Pollheimer J., Knöfler M. Regulatory transcription factors controlling function and differentiation of human trophoblast //Placenta. – 2003. – Р. 104–110. 121. Lunghi L., Ferretti M.E., Medici S., Biondi C., Vesce F. //Reprod Biol Endocrinol. – 2007. Feb. - №8. – Р. 5-6. 122. Makiya R., Stigbrand T. Placental Alkaline Phosphatase has a Binding Site for the Human Immunoglobulin- GFc portion //European Journal of Biochemistry. – 1992. - №205. – Р. 341-345. 123. Mangal A., Shrivastava P., Gaur U., Jain A., Goyal U., Rath G. Histochemical Analysis of Placental Alkaline Phosphatase in Hypertensive Disorders complicating Pregnancy //J.Anat.Soc. India. – 2005. - №54 (2). – Р. 1-9. 124. Matsubara S., Tamada T., Saito T. Ultracytochemical localizations of alkaline phosphatase and acid phosphatase activities in the human term placenta //Acta Histochem Cytochem. – 1987. - №20. – Р. 283–294. 125. Matsubara S., Tamada T, and Saito T. Cytochemical study of the electronmicroscopical localization of Ca ATPase activity in the human trophoblast //Acta Obstet. Gynaecol. Jpn. – 1987. - №39. – Р. 10801086. 126. Matsubara S., Tamada T., and Saito T. Ultracytochemical localizations of adenylate cyclase, guanylale cyclase and cyclic 3', 5'-nucleotide phosphodiesterase activity on the trophoblast in the human placenta //Histochemistry. – 1987. - №87. – Р. 505-509. 127. Matsuura T., Sugimura M., Iwaki T., Ohashi R., Kanayama N., Nishihira J. Anti-macrophage inhibitory factor antibody inhibits PMSG-hCGinduced follicular growth and ovulation in mice //J Assist Reprod Genet. – 2002. - №19. – Р. 591–595. 129 128. Mayhew T.M. Villous trophoblast of human placenta: a coherent view of its turnover, repair and contributions to villous development and maturation //Histol Histopathol – 2001. Oct. - №16(4). – Р.1213-24. 129. Mayhew T.M. Stereological studies on fetal vascular development in human placental villi //Anal Stereol. – 2003. - №22. – Р. 49-56. 130. Millan J. L. Mammalian Alkaline Phosphatases // WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. - 2006. - P. 187-205. 131. Mori M., Ishikawa G., Luo S.S., Mishima T., Goto T., Robinson J.M., Matsubara S., Takeshita T., Kataoka H., Takizawa T. The cytotrophoblast layer of human chorionic villi becomes thinner but maintains its structural integrity during gestation // Biol Reprod. – 2007. Jan. - №76(1). – Р. 16472. 132. Morrish D.W., Dakour J., Li H. Functional regulation of human trophoblast differentiation // J Reprod Immunol. – 1998. Aug. - №39(1-2). – Р. 179-95. 133. Morrish D.W, Marusyk H., Bhardwaj D. Ultrastructural localization of human placental lactogen in distinctive granules in human term placenta: comparison with granules containing human chorionic gonadotropin //J Histochem Cytochem. – 1988. Feb. - 36(2). – Р. 193-7. 134. Muyan M., Boime I. Secretion of chorionic gonadotropin from human trophoblasts //Placenta – 1997. - №18. – Р. 237-241. 135. Nelson A.C., Enders B.F., King. Galactosyltransferase activity of the microvillous surface of human placental syncytial trophoblast //Gynecol. Invest. – 1977. - №8. – Р. 267−281. 136. Nomura M., Yamagishi S., Harada S., Hayashi Y., Yamashima T., Yamashita J., Yamamoto H. Possible participation of autocrine and paracrine vascular endothelial growth factors in hypoxia-induced proliferation of endothelial cells and pericytes //J Biol Chem. – 1995. Nov. - №24, 270(47). – Р. 28316-24. 130 137. Ng Y.H., Zhu H., Leung P.C., Twist regulates cadherin-mediated differentiation and fusion of human trophoblastic cells //J Clin Endocrinol Metab. – 201.1 Dec. - № 96(12). – Р. 3881-90. 138. Nouri A.M., Torabi-Pour N., Dabare A.A. A new highly specific monoclonal antibody against placental alkaline phosphatase: a potential marker for the early detection of testis tumour //BJU Int. – 2000. Nov. №86(7). – Р.894-900. 139. Ockleford C.D., and Menon G. Differentiated regions of human placental cell surface associated with exchange of materials between maternal and foetal blood: a new organelle and the binding of iron //J. Cell Sci. – 1977. - №25. - Р. 279-291. 140. Ogren L., Talamentes F. The placenta as an endocrine organ: polypeptides // Physiology of reproduction. - 1994. - №.75. - Р. 945. 141. Okamoto T., Seo H., Mano H., Furuhashi M., Goto S., Tomoda Y., Matsui N. Expression of human placenta alkaline phosphatase in placenta during pregnancy // Placenta. – 1990. Jul-Aug. - №11(4). – Р. 319-27. 142. Okesina A. B., Donaldson B., Lacelles P.T., Moris P. Effects of gestational age on levels of serum alkaline phosphotase isoenzymes in healthy pregnant women. // Obstet Gynec.- 1995.- V. 48., № 1.- Р. 25- 29. 143. Onwuameze I.C., Onwubere B.J., Ezeoke A.C. Serum heat-stable alkaline phosphatase activity in normal pregnancy // East. Afr. Med. J. - 1999. Vol. 76, № 6. - P. 341-3. 144. Parmley R.T., Takagi M., Denys F.R. Ultrastructural localization of glycosaminoglycans in human term placenta //Anat Rec. – 1984. Nov. №210(3). – Р. 477-84. 145. Paulsson М. Basement membrane proteins: structure, assembly, and cellular interactions //Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. – 1992. Vol 27. - № 1. – Р. 93-127. 131 146. Pekhlivanov B., et al., Alkaline phosphatase isoenzyme activity in the serum of women during the second half of pregnancy //Аkush Ginekol (Sofiia). - 1989. - №28(2). - Р. 10-4. 147. Pijnenborg, R., Dixon, G., Robertson, W.B. and Brosens, I.: Trophoblastic invasion of human decidua from 8 to 18 weeks of pregnancy // Placenta. – 1980. - №1. – Р.3–19. 148. Povinelli C.M., Knoll B.J. Trace expression of the germ-cell alkaline phosphatase gene in human placenta // Placenta. – 1991. Nov-Dec. №12(6). – Р.663-8. 149. Rajakumar A., Cerdeira A.S., Rana S., Zsengeller Z, Edmunds L., Jeyabalan A., Hubel C.A., Stillman I.E., Parikh S.M., Karumanchi S.A. Transcriptionally active syncytial aggregates in the maternal circulation may contribute to circulating soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia // Hypertension. – 2012. Feb. - №59(2). – Р. 56-64. 150. Rao C.V. In: Human chorionic gonadotropin (hCG). Elsevier, Oxford UK; 2010. Paradigm shift on the targets of hCG actions. in press Chapter 11. 151. Riquelme G. Placental syncytiotrophoblast membranes – domains, subdomains and microdomains //Placenta. – 2011. Vol. 32. – Р. 196-202. 152. Rodesch F., Simon P., Donner C., Jauniaux E. Oxygen measurements in endometrial and trophoblastic tissues during early pregnancy //Obstet Gynecol. – 1992. Aug. - №80(2). – Р. 283-5. 153. Rovasio R.A., Monis B. Cytochemical changes of glycocalyx of human placenta with maturation // Experientia. – 1973. Sep 15. - №29(9). – Р. 1115-7. 154. Salehnia M., Farzad T.R., Tachikhani M. et al. Alkaline phosphatase histochemistry and biochemistry in the diagnosis of complete hydatidiform mole // Pathol.Oncol.Res. - 2000. - Vol. 6, № 2. - P. 105-10. 132 155. Sankar K.D., Bhanu P.S., Kiran S., Ramakrishna B.A., Shanthi V. Vasculosyncytial membrane in relation to syncytial knots complicates the placenta in preeclampsia: a histomorphometrical study //Anat Cell Biol. – 2012. Jun. - №45(2). – Р. 86-91. 156. Sasaki Y., Ladner D.G., Cole LA. Hyperglycosylated hCG the source of pregnancy failures //Fertil Steril. – 2008. - №89. – Р. 1871–1786. 157. Schmorl G. Pathologisch-anatomische Untersuchungen über PaerperalEklampsie, Verlag FCW Vogel, Leipzig – 1893. 158. Sembaj A., Carriazo C., Moreno Barral J. Placental alkaline phosphatase of high molecular weight in plasma of pregnant women in the last trimester of gestation // Rev. Fac. Cien. Med. Univ. Nac. Cordoba. - 2000. - Vol. 57, № 1. - P. 115-9. 159. She Q.B., Mukherjee J.J., Chung T., Kiss Z. Placental alkaline phosphatase, insulin and adenine nucleotides or adenosine synergistically promote long-term survival of serum-starved mouse embryo and human fetus fibroblasts // Cell.Signal. - 2000. - Vol. 12, № 9-10. - P. 659-65. 160. Shi Q.J., Lei Z.M., Rao C.V., Lin J. Novel role of human chorionic gonadotropin in differentiation of human cytotrophoblasts //Endocrinol. – 1993. - №132. – Р. 387–395. 161. Smith C.H., Nelson D.M., King B.F., Donohue T.M., Ruzycki ST.M., and Kelley, L.K. Characterization of a microvillous membrane preparation from human placental syncytiotrophoblast: a morphologic, biochemical and physiologic study //Am. J. Obstet. Gynecol. – 1977. - №128. – Р. 190196. 162. Stefaner I., Stefanescu A., Hunziker W. and Fuchs R. Expression of Placental Alkaline Phosphatase does not Correlate with IgG Binding // Internalization and Transcytosis. Biochemistry Journal. – 1997. - №327. – Р. 585-592. 133 163. Teasdale F., Jean-Jacques G. Morphometry of the microvillous membrane of the human placenta in maternal diabetes mellitus //Placenta. -1986. JanFeb - №7(1). – Р. 81-8. 164. Thie M., Denker H.W. In vitro studies on endometrial adhesiveness for trophoblast: cellular dynamics in uterine epithelial cells //Cells Tissues Organs. – 2002. - №172. – Р.237–52. 165. Tighe J.R., Garrod P.R. and Curran R.C. The trophoblast of the human chorionic villus //J. Pathol. Bacteriol. – 1967. - №93. – Р.559–567. 166. Truman P., Ford H.C. The brush border of the human term placenta //Biochim Biophys Acta. – 1984. Jun. - №25,779(2). – Р.139-60. 167. Tuuli M.G., Longtine M.S., Nelson D.M. Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy //Placenta. - 2011. Mar. - №32. – Р. 10918. 168. Veldman G.M., Finnerty H., Racie L., LaVallie E., Тang, X.-Y., Edouard P., Howes S. et al. Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis //Nature – 2000. - №403. – Р. 785-789. 169. Vongthavaravat V., Nurnberger M.M., Balodimos N. et al. Isolated elevation of serum alkaline phosphatase level in an uncomplicated pregnancy a case report // Am.J.Obstet.Gynecol. - 2000. - Vol. 183, № 2. P. 505-6. 170. Wainwright S.D., Wainwright L.K. Erythropoiesis in a cell population from the early chick blastodisc induced by diffusible product of second cell population //Nature. – 1974. Nov. - №22. – Р. 252. 171. Wan H., Marjan A., Cheung V.W., Leenen P.J.M., Khan N.A., Benner R., Kiekens R.C.M. Chorionic gonadotropin can enhance innate immunity by stimulating macrophage function //J Leukocyte Biol. – 2007. - №82. – Р. 926–933. 134 172. Wikström Shemer E., Thorsell M., Östlund E., Blomgren B., Marschall HU. Stereological assessment of placental morphology in intrahepatic cholestasis of pregnancy //Placenta. – 2012. Nov. - №33(11). – Р. 914-8. 135
