Балакирева А.В.

Êîíôåðåíöèÿ ¾Ëîìîíîñîâ 2012¿
Ñåêöèÿ ¾Áèîèíæåíåðèÿ è áèîèíôîðìàòèêà¿
Ñîçäàíèå áåëêà-ñóáñòðàòà ôèòàñïàçû ñ óëó÷øåííûì ñàéòîì ãèäðîëèçà.
Áàëàêèðåâà Àíàñòàñèÿ Âàñèëüåâíà
Ñòóäåíò
Ìîñêîâñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò èìåíè Ì.Â. Ëîìîíîñîâà, Ôàêóëüòåò
áèîèíæåíåðèè è áèîèíôîðìàòèêè, Ìîñêâà, Ðîññèÿ
E-mail: anasteya@bk.ru
Àãðîáàêòåðèè ôèòîïàòîãåííûå ìèêðîîðãàíèçìû, òðàíñôîðìèðóþùèå ðàñòèòåëüíûå êëåòêè â ïðîöåññå çàðàæåíèÿ. Òðàíñôîðìàöèÿ ïðîèñõîäèò ïóòåì ïåðåíîñà ÷àñòè
àãðîáàêòåðèàëüíîé ÄÍÊ â ðàñòèòåëüíóþ êëåòêó è âñòðàèâàíèÿ åå â ðàñòèòåëüíóþ õðîìîñîìó. Ýòîò ïðîöåññ îñóùåñòâëÿåòñÿ ïðè ïîìîùè ñïåöèàëüíûõ áåëêîâ âèðóëåíòíîñòè
àãðîáàêòåðèé.  ÷àñòíîñòè, áåëîê VirD2 ïðèñîåäèíÿåòñÿ ê ïåðåíîñèìîé ÄÍÊ è íàïðàâëÿåò åå â ÿäðî ðàñòèòåëüíîé êëåòêè. ßäåðíûé òðàíñïîðò ýòîãî êîìïëåêñà îáóñëîâëåí
íàëè÷èåì ñèãíàëà ÿäåðíîé ëîêàëèçàöèè (NLS) â áåëêå VirD2 [1].
 íåêîòîðûõ ðàñòåíèÿõ â îòâåò íà àãðîáàêòåðèàëüíîå çàðàæåíèå ðàçâèâàåòñÿ çàùèòíûé îòâåò, îñóùåñòâëÿåìûé ôåðìåíòîì ôèòàñïàçîé - ðàñòèòåëüíîé àñïàðòàò-ñïåöèôè÷íîé
ïðîòåàçîé, ÿâëÿþùåéñÿ àíàëîãîì àïîïòîòè÷åñêèõ ïðîòåàç æèâîòíûõ êëåòîê. Âáëèçè
Ñ-êîíöà VirD2 ôèòàñïàçà óçíàåò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü TATD ïåðåä ñèãíàëîì ÿäåðíîé
ëîêàëèçàöèè áåëêà è âíîñèò îäèíî÷íûé ðàçðûâ ïîñëå îñòàòêà àñïàðàãèíîâîé êèñëîòû,
îòùåïëÿÿ NLS è äåëàÿ, òàêèì îáðàçîì, ïðîöåññ òðàíñôîðìàöèè íåâîçìîæíûì [2].
Ðàíåå íà îñíîâå áåëêà VirD2 áûë ñîçäàí õèìåðíûé áåëîê-ñóáñòðàò ôèòàñïàçû, ïðåäñòàâëÿþùèé ñîáîé çåëåíûé ôëóîðåñöåíòíûé áåëîê GFP, ñîåäèíåííûé ñ Ñ-êîíöåâûì
ó÷àñòêîì VirD2 [3]. Îäíàêî èññëåäîâàíèå ñïåöèôè÷íîñòè ôèòàñïàçû ñ ïîìîùüþ ñèíòåòè÷åñêèõ ïåïòèäíûõ ôëóîðîãåííûõ ñóáñòðàòîâ ïîêàçàëî, ÷òî ïîñëåäîâàòåëüíîñòü TATD
íå ÿâëÿåòñÿ îïòèìàëüíîé äëÿ ãèäðîëèçà. Ñ ãîðàçäî áîëüøåé ýôôåêòèâíîñòüþ ôèòàñïàçà óçíàåò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü VEID [4].
 çàäà÷ó êóðñîâîé ðàáîòû âõîäèëî ñîçäàíèå íîâîãî áîëåå ýôôåêòèâíîãî áåëêàñóáñòðàòà ôèòàñïàçû ïóòåì çàìåíû â áåëêå GFP-VirD2 ïîñëåäîâàòåëüíîñòè TATD íà
VEID. Äëÿ ýòîãî áûë îñóùåñòâëåí ìóòàãåíåç ãåíà GFP-VirD2 ñ ïîìîùüþ ïîëèìåðàçíîé
öåïíîé ðåàêöèè. Ìû óáåäèëèñü ïóòåì ñåêâåíèðîâàíèÿ, ÷òî ïîëó÷åííàÿ íàìè ïëàçìèäà
äåéñòâèòåëüíî ñîäåðæèò æåëàåìûå ìóòàöèè.
Çàòåì ïîëó÷åííîé êîíñòðóêöèåé òðàíñôîðìèðîâàëè êëåòêè E.coli è âûäåëèëè èç íèõ
ðåêîìáèíàíòíûé áåëîê â èíäèâèäóàëüíîì ñîñòîÿíèè ïðè ïîìîùè àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Ñðàâíåíèå ñïîñîáíîñòè èñõîäíîãî áåëêà è ïîëó÷åííîãî ìóòàíòà ãèäðîëèçîâàòüñÿ ôèòàñïàçîé in vitro ïîêàçàëî, ÷òî â ðåçóëüòàòå ââåäåííûõ ìóòàöèé ýôôåêòèâíîñòü
ðàñùåïëåíèÿ áåëêà-ìèøåíè ôèòàñïàçîé ïîâûñèëàñü â íåñêîëüêî ðàç.
Ëèòåðàòóðà
1. ×óìàêîâ Ì.È. Ìåõàíèçì àãðîáàêòåðèàëüíîé òðàíñôîðìàöèè ðàñòåíèé. - Ñàðàòîâ:Èçäàòåëüñòâî "Ñëîâî 2001.
2. Hwang H.-H., Kirankumar S. Mysore, Stanton B. Gelvin. Transgenic Arabidopsis
plants expressing Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein are less suspectible to
Agrobacterium transformation. - Molecular Plant Pathology, 2006. 7(6) 473-484.
1
Êîíôåðåíöèÿ ¾Ëîìîíîñîâ 2012¿
3. Chichkova N.V., Sang Hyon Kim, Elena S. Titova, Markus Kalkum, Vasiliy S. Morozov,
Yuri P.Rubtsov, Natalia O. Kalinina, Micheal E. Taliansky, Andrey B. Vartapetian. A
plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. - The Plant
Cell, 2004. Vol. 16, 157-171.
4. Nina V Chichkova, Jane Shaw, Raisa A Galiullina, Georgina E Drury, Alexander I
Tuzhikov, Sang Hyon Kim, Markus Kalkum, Teresa B Hong, Elena N Gorshkova, Lesley
Torrance, Andrey B Vartapetian, Michael Taliansky. Phytaspase, a relocalisable cell
death promoting plant protease with caspase specity. The EMBO Journal (2010) 29,
1149-1161.
2