1 Количественные изменения компонентов клубочков почки при
реклама
Количественные изменения компонентов клубочков почки при первичном нефротическом синдроме у детей И. В. Сахаров, Т. А. Летковская, Е. Д. Черствый, А. В. Сукало УО «Белорусский государственный медицинский университет» Введение Нефротический синдром (НС) — это клинический симптомокомплекс, характеризующийся протеинурией (потеря белка с мочой 3 г/сут и более у взрослых, 50 мг/кг/сут и более у детей), отѐками, гипоальбуминемией и гиперлипидемией. Протеинурия является ведущим симптомом НС, еѐ развитие связывают с изменениями подоцитов клубочков почки. Подоциты — высокоспециализированные клетки клубочков, главной функцией которых является обеспечение гломерулярной фильтрации. При протеинурии наблюдаются изменения пространственной структуры подоцитов, что при трансмиссивной электронной микроскопии описывают как феномен «слияния» малых ножек. Количественные изменения подоцитов также играют роль в почечной патологии. Прогрессирование поражений клубочков при НС связано с развитием в них склеротических изменений, которые могут развиваться при уменьшении числа подоцитов. В последние годы количественные изменения подоцитов стали объектом интенсивного исследования. Они описаны как в эксперименте, так и при заболеваниях человека (диабетическая, IgA- и ВИЧ-ассоциированная нефропатии). Однако в изучении НС внимание исследователей сосредоточено на изменениях различных функциональных молекул подоцитов. Количественные изменения подоцитов при НС, в том числе и первичном, остаются малоизученными, несмотря на их роль в развитии этой патологии. Также не изучены количественные изменения других компонентов клубочка (капилляров, клеток мезангия, эндотелия). Цель нашего исследования — дать количественную характеристику основных гистологических структур клубочков почки при первичном НС у детей. Материалы и методы Исследование проводилось на текущем и архивном материале пункционных нефробиопсий, проведѐнных во 2-й детской клинической больнице г. Минска в период 2006-2010 гг. В исследуемую группу был включѐн 31 ребѐнок с клиническими диагнозами «нефротический синдром», «нефропатия с протеинурией» (неполный нефротический синдром — протеинурия без экстраренальных проявлений) и «хронический гломерулонефрит, нефротическая форма». Группа сравнения включала 30 детей с клиническими диагнозами «острый гломерулонефрит, затяжное течение», «нефропатия с 1 гематурией» и «хронический гломерулонефрит, гематурическая форма». Основным клиническим проявлением в группе сравнения являлась изолированная гематурия. В группу сравнения не включались больные с IgA-нефропатией. Статистический анализ данных проводился с использованием программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoftInc.). Взаимосвязь между показателями определялась при помощи непараметрического двустороннего коэффициента корреляции Спирмена. Для сравнения двух независимых выборок использовались U-критерий Манна-Уитни и t Стьюдента, для сравнения трѐх и более независимых выборок — тест Краскела-Уоллиса. За уровень статистической значимости принимался p<0,05. При гистологическом исследовании в обеих группах были выявлены минимальные изменения (МИ), мезангиальная пролиферация (МзП) и фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС). Клинико-морфологические характеристики групп пациентов представлены в таблице 1. В исследовании учитывались как важнейшие лабораторные характеристики нефротического синдрома (уровни суточной протеинурии, содержания общего белка, альбумина и холестерина в сыворотке), так и показатели, характеризующие азотовыделительную функцию почек (содержание мочевины и креатинина). Также учитывались возраст больных, длительность заболевания от начала до момента биопсии, возраст дебюта заболевания. Лабораторные и возрастные характеристики групп представлены в таблице 2. В исследуемой группе у некоторых пациентов уровень протеинурии был ниже нефротического (50 мг/кг/сут), так как на момент проведения нефробиопсии большинство из них уже прошли часть курса терапии нефротического синдрома. Содержание общего белка в сыворотке большинства больных было снижен незначительно, а медиана входит в пределы возрастной нормы (52-76 г/л). В то же время, концентрация альбумина снижалась более существенно (при возрастной норме 38-54 г/л). Холестерин сыворотки был умеренно повышен (норма 3,13-5,25 ммоль/л). В целом, лабораторные изменения, обнаруженные у обследованных пациентов, оказались характерными для нефротического синдрома (протеинурия, гипоальбуминемия, гиперхолестеринемия). В группе сравнения названные показатели статистически значимо отличались от таковых в исследуемой группе. Уровень креатинина не имел статистически значимых отличий, что также объясняется проведѐнным лечением до момента биопсии. Различия между группами по основным лабораторным данным, характеризующим нефротический синдром, позволяют исключить влияние протеинурии морфологические характеристики группы сравнения. 2 и гипоальбуминемии на Между группами не наблюдалось значимых различий по возрастным характеристикам (Таблица 2) и по соотношению полов (Таблица 1, метод χ2, p=0,71). Для морфометрического анализа фотографировали пять случайно выбранных клубочков биоптата и полученные изображения анализировали с помощью программы анализа изображений WCIF ImageJ 1.43u (National Institute of Health, США). Для идентификации подоцитов применялось иммуногистохимическое моноклональных мышиных антител к белку окрашивание с использованием WT1 человека производства DAKO Cytomation, Дания (клон 6F-H2). Для визуализации применялась система EnVision (DAKO Cytomation, Дания). последующим В качестве докрашиванием хромогена препарата использовался гематоксилином диаминобензидин, Майера. Белок с WT1 экспрессировался в ядрах подоцитов, что отличало их от других клеток капиллярного тельца клубочка. В случаях ФСГС исследовались клубочки без сегментарных склеротических изменений. В качестве позитивного контроля использовалась ткань яичка человека (экспрессия WT1 наблюдалась в клетках сперматогенного эпителия). Для количественной характеристики изменений в клубочках были выбраны показатели, представленные в Таблице 3. В каждом клубочке измеряли площадь капиллярного тельца, обводя его по контуру. Затем с помощью модуля Cell Counter подсчитывали число подоцитов, общее число других клеток (мезангиоцитов и эндотелиоцитов), а также число просветов капилляров. Полученные средние для пяти клубочков значения использовали для расчѐта выбранных показателей. Результаты Площадь клубочков Площадь среза клубочка зависит от многих факторов: кровенаполнение капилляров, расширение мезангиального матрикса, склеротические изменения. Поскольку количество клеток и капилляров в клубочках характеризовалось по отношению к площади клубочка, группы пациентов должны были быть сопоставимы по этой площади. В исследуемой группе средняя площадь пяти измеренных клубочков имела больший диапазон значений, чем в группе сравнения. Однако статистически значимых различий между группами по этому показателю не было выявлено. Следовательно, площадь клубочков не влияла на наличие или отсутствие групповых различий по показателям, рассчитанных на эту площадь. В обеих группах площадь клубочков достоверно увеличивалась с возрастом (ρ Спирмена 0,44 и р=0,013 в исследуемой группе, ρ Спирмена 0,43 и р=0,017 в группе сравнения). Плотность капилляров По числу подоцитов на один капилляр значимых различий между группами обнаружено 3 не было (также и между морфологическими вариантами внутри групп). Групповые различия по числу капилляров в клубочке оказались статистически значимыми, причѐм в исследуемой группе медиана показателя была на 19,6% меньше. Эти различия не исчезали даже при исключении из статистического анализа пациентов обеих групп с ФСГС. В исследуемой группе наблюдалась прямая корреляция умеренной силы плотности подоцитов и плотности капилляров (ρ Спирмена 0,52, р=0,003). В группе сравнения такой связи выявлено не было. Плотность подоцитов В исследуемой группе плотность подоцитов оказалось меньше, чем в группе сравнения с уровнем статистической значимости р<0,001. Также меньшим было и процентное содержание подоцитов от всех клеток клубочка. По плотности других клеток группы значимо не отличались. Кроме сравнения групп пациентов в целом, было проведено сравнение показателей у пациентов обеих групп с одним и тем же гистологическим диагнозом. Оказалось, что при всех вариантах гистологических изменений плотность подоцитов была ниже в исследуемой группе. Статистически значимые различия имелись при МзП и ФСГС (U Манна-Уитни, p=0,014 и р=0,025). При ФСГС в исследуемой группе также значимо меньшим было процентное содержание подоцитов. По остальным морфометрическим показателям статистически значимых различий выявлено не было. Плотность подоцитов была различной при разных гистологических вариантах НС в исследуемой группе (тест Краскела-Уоллиса, р=0,012) и уменьшалась в направлении МИ — МзП — ФСГС. Статистически значимым оказалось снижение показателя при ФСГС по сравнению с МИ (U Манна-Уитни, p=0,005). Морфологические варианты не имели значимых различий по плотности капилляров. В группе сравнения различий между гистологическими диагнозами по морфометрическим показателям не было выявлено. При разных морфологических вариантах НС возрастные характеристики в исследуемой группе также изменялись. Так, время от начала заболевания до проведения нефробиопсии уменьшалось в направлении МИ — МзП — ФСГС (тест Краскела-Уоллиса, р=0,042). То есть более тяжѐлые поражения чаще выявлялись у больных, которым нефробиопсия была показана на ранних этапах развития заболевания. Напротив, возраст на момент биопсии и возраст дебюта заболевания увеличивались в направлении МИ — МзП — ФСГС (тест Краскела-Уоллиса, р=0,011 и р=0,003). Статистически достоверных связей между лабораторными характеристиками НС и морфометрическими показателями в исследуемой группе обнаружено не было. Установлена обратная корреляционная связь средней силы уровня креатинина сыворотки 4 с процентным содержанием подоцитов в клубочке (ρ Спирмена -0,48, р=0,020) и с плотностью подоцитов (ρ Спирмена -0,60, р=0,003). Также уровень креатинина прямо коррелировал с возрастом на момент биопсии и возрастом дебюта заболевания (ρ Спирмена 0,72 и р<0,001, ρ Спирмена 0,59 и р=0,003). Обсуждение Развитие и прогрессирование многих заболеваний почек связано с патологией подоцитов. Это подтверждается как исследованиями.Уменьшение диабетической клиническими, количества гломерулопатии [15, так подоцитов 23], и в экспериментальными клубочках IgA-нефропатии [8, 9], описано а также при в экспериментальных моделях гломерулонефрита [7] и диабетической гломерулопатии [10, 21]. Патогенез повреждений подоцитов при первичном НС во многом остаѐтся неясным. При наличии мутаций генов, кодирующих белки подоцитов (нефрин, подоцин, подокаликсин, α-актинин-4 и др.), главным звеном патогенеза являются структурные аномалии подоцитов и щелевой диафрагмы. Однако выявить эти мутации в большинстве случаев первичногоНС не удаѐтся. В литературе имеются данные о возможности повреждения подоцитов циркулирующими в крови веществами [1]. В пользу этого свидетельствует обнаружение так называемого «ФСГС-фактора» в сыворотке больных ФСГС [3, 20], а также у больных с рецидивом ФСГС в трансплантате [19]. По данным Sharma et al [20] «ФСГС-фактор» является пептидом с массой от 30 до 50 кДа, который, возможно, относится к цитокинам [1] Напротив, по данным Coward et al [4] плазма больных НС лишена некоего фактора, который необходим для нормального функционирования щелевой диафрагмы. Уменьшение количества подоцитов в клубочках связано с отделением их от гломерулярной базальной мембраны и экскрецией с мочой. При этом происходит обнажение участков базальной мембраны, в которых в дальнейшем формируются адгезии между капиллярными петлями и между капиллярным тельцем и капсулой клубочка [12]. Подоциты — высокоспециализированные клетки, и восстановление их количества in vivo, видимо, невозможно, хотя отделяющиеся подоциты жизнеспособны и в культуре клеток могут делиться [17, 25]. Таким образом, уменьшение числа подоцитов в клубочке может являться наиболее ранним изменением при развитии поражений клубочков. Особенно важным уменьшение числа подоцитов представляется при НС, т. к. протеинурия — основной симптом НС — является прямым следствием патологии подоцитов и щелевой диафрагмы. Показано, что уменьшение числа подоцитов является фактором прогрессии протеинурии при IgA-нефропатии [8]. 5 Уменьшение количества подоцитов можно косвенно обнаружить по их экскреции с мочой. Количество подоцитов, обнаруженных в осадке мочи, увеличивается по мере прогрессирования заболевания и коррелирует с тяжестью поражений [6, 13]. Этот показатель рассматривают даже как дифференциально-диагностический для НМИ и ФСГС [14]. В то же время, есть свидетельства в пользу неспецифичности и непостоянства экскреции подоцитов с мочой и отсутствии еѐ корреляции с клиническими и лабораторными проявлениями заболевания, в т. ч. и НС [22].Также не выявлено достоверной связи между снижением числа подоцитов в клубочке и экскреции их с мочой [27]. Поэтому наиболее адекватно оценить изменения числа подоцитов в клубочках можно только в гистологическом срезе. Выявление подоцитов в гистологических срезах по экспрессии белка WT1 является наиболее достоверным методом [18, 21]. WT1 в норме экспрессируется зрелыми дифференцированными подоцитами. Следует учитывать, что при патологических состояниях подоциты могут утрачивать экспрессию WT1 [18]. Однако, в доступной литературе мы не нашли сведений о том, что это наблюдается при НС. Если подоциты WT1-негативны, то это указывает на их серьѐзное и, возможно, необратимое повреждение, т. к. белок WT1 регулирует экспрессию многих белков этих клеток и обеспечивает их нормальное функционирование. Даже при «слиянии» малых ножек и выраженном нарушении фильтрационной функции подоциты сохраняют экспрессию WT1. Таким образом, подсчитав количество WT1-позитивных клеток, мы получили число подоцитов, не утративших полностью свои функции. Методы оценки количественных изменений подоцитов, использующиеся рядом авторов [7, 16, 18, 21], основаны на определении объѐма капиллярного тельца, который приходится на один подоцит (glomerular volume per podocyte — GV/P). При таком подходе точность измерений достаточно высока, но сами методы довольно трудоѐмки и не всегда применимы при рутинном исследовании биопсийного материала. Во-первых, для определения объѐма клубочка и числа подоцитов в нѐм исследуют либо несколько серийных срезов одной толщины, либо два среза толщиной 3 мкм и 9 мкм. Это несложно при исследовании аутопсийного материала или материала от лабораторных животных, когда объѐм доступной для изучения ткани достаточно велик. Но материал пункционных биопсий почки зачастую очень мал по объѐму, и сделать несколько дополнительных срезов бывает невозможно из-за необходимости проведения гистохимических и иммуногистохимических окрасок. Во-вторых, упомянутые методы предполагают исследование большого числа клубочков в образце ткани (10-12 клубочков). Это повышает точность метода, но также может быть 6 неприемлемо для материала пункционных биопсий. В-третьих, для вычисления объѐма клубочка нужно точно знать толщину исследуемых срезов. Показано, что толщина срезов, сделанных микротомом, может значительно отличаться от заданного значения (22). Например, при заданной толщине 3 мкм микротом делает все срезы толщиной 3,9 мкм. Это значит, что для вычисления объѐма клубочка следует измерять толщину полученных срезов, что довольно трудоѐмко, недостаточно точно и требует значительного расхода исследуемого материала.В нашем исследовании толщина срезов была постоянной при установленном на микротоме значении 3 мкм. Даже если толщина срезов отличалась от заданной, это не влияло на конечный результат, т. к. объѐм клубочков не вычислялся. Siu et al [21] при изучении экспериментальной диабетической гломерулопатии выявили снижение плотности подоцитов в срезе клубочка и увеличение GV/P. Поэтому плотность подоцитов можно считать показателем, достаточно объективно характеризующим соотношение изменений подоцитов и всего клубочка в целом. Для изучения морфометрических показателей в клубочках при НС необходимо сопоставить их с морфометрическими данными при отсутствии клинико-лабораторных проявлений НС. С этой целью была сформирована группа сравнения. Показано, что уровень экспрессии основных специфических белков подоцитов, в т. ч. и WT1, при изолированной гематурии не изменяется [5]. Поэтому в группу сравнения вошли пациенты с гематурией и отсутствием нефротической протеинурии, как в ранее проведѐнных исследованиях [2, 24, 26]. Основным обнаруженным нами изменением явилось уменьшение плотности подоцитов в группе НС. Характерно, что это уменьшение наблюдалось не только при сравнении групп целиком, но и при сравнении пациентов из двух групп с одинаковым гистологическим диагнозом. Важно отметить снижение плотности подоцитов у больных с ФСГС при НС. Как указывалось ранее, развитие склеротических изменений связано именно с утратой подоцитов. Видимо, при НС этот процесс выражен более значительно, чем при гематурических состояниях. Таким образом, снижение плотности подоцитов становится более выраженным при более тяжѐлых морфологических вариантах НС. Такие изменения не наблюдались в группе сравнения. Выявленное увеличение площади клубочков с возрастом соответствует литературным данным [2, 24]. Suzuki et al описывают также увеличение площади клубочков при ФСГС. В исследованной нами группе больных НС площадь клубочков увеличивалась в направлении МИ — МзП — ФСГС, однако без статистической достоверности. По данным Akaoka et al [2] площадь клубочков коррелирует с площадью поверхности 7 тела, что отражает рост клубочков вместе с ростом всего организма. То же наблюдалось и в нашем случае: как во всей выборке, так и в группах (исследуемой и группе сравнения) по отдельности площадь клубочков увеличивалась с увеличением площади тела и с возрастом (значения p<0,05). Поскольку возраст больных увеличивался в направлении МИ — МзП — ФСГС, возник вопрос, не влияет ли увеличение размеров тела на уменьшение плотности подоцитов в клубочках. Для того чтобы исключить это влияние, был введѐн коэффициент, который вычислялся по формуле К= плотность подоцитов / площадь поверхности тела. Оказалось, что группы пациентов не имели достоверных отличий по К. Но в группе НС этот коэффициент достоверно уменьшался в направлении МИ — МзП — ФСГС (тест Краскела-Уоллиса, р=0,037), чего не наблюдалось в группе сравнения. Таким образом, даже при исключении влияния всех возможных факторов число подоцитов в клубочках уменьшается в указанном выше направлении. Функция подоцитов тесно связана с капиллярами клубочков. Подоциты не только участвуют в процессе тельца,охватывая одну фильтрации, или но несколько и поддерживают прилежащих форму капиллярных капиллярного петель [11]. Количественные изменения капилляров клубочков, а также их соотношение с числом подоцитовпри заболеваниях почек изучены недостаточно. В исследованной нами выборке число подоцитов на один капилляр было меньше в группе НС, однако статистически значимых отличий от группы сравнения не было выявлено.Это, вероятно, связано с меньшей плотностью капилляров в группе НС. Обнаруженное нами снижение плотности капилляров в группе НС может быть объяснено упрощением строения капиллярного тельца при НС. Известно, что характерные ультраструктурные изменения при НС, описываемые как «слияние» малых ножек подоцитов, на самом деле являются упрощением их пространственной структуры. Возможно, что и всѐ капиллярное тельце при этом становится более примитивно организованным. В пользу этого свидетельствует прямая корреляционная связь между плотностью подоцитов и плотностью капилляров в исследуемой группе и отсутствие такой связи в группе сравнения. С другой стороны, можно предположить увеличение плотности капилляров при развитии гематурии. Поэтому этот показатель нельзя признать диагностически значимым для НС. Между морфологическими вариантами в группе НС не было значимых отличий по плотности капилляров числу подоцитов на капилляр, что исключает возможность применения этих показателей для дифференциальной диагностики гистологических вариантов НС. Кроме подоцитов в клубочках присутствуют также мезангиоциты и клетки эндотелия капилляров. Их количественные изменения также представляют интерес. Но раздельный 8 подсчѐт мезангиоцитов и эндотелиоцитов затруднѐн тем, что ни те, ни другие не экспрессируют ядерных маркеров, по которым их можно достоверно отличить друг от друга. Проводить различия между этими клетками по их расположению в капиллярном тельце, а также по цитоплазматическим и мембранным маркерам ненадѐжно ввиду сложной пространственной структуры клубочков. Отличить эти клетки сложно даже при исследовании серийных срезов [23], поэтому мы подсчитывали их общее число в срезе клубочка. Между группами пациентов не было статистически значимых различий по суммарной плотности мезангиоцитов и эндотелиоцитов. Также не было различий между гистологическим вариантами по этому показателю. Вероятно, это объясняется тем, что реакция этих клеток (главным образом, мезангиоцитов) на повреждение является универсальной и не зависит от вида патологии. Выводы 1. При НС число подоцитов в клубочках уменьшается по сравнению с изолированной гематурией. 2. Число подоцитов при НС уменьшается вместе с числом капилляров клубочка. 3. Количество подоцитов различно при разных морфологических вариантах НС и уменьшается в направлении МИ — МзП — ФСГС. 4. Между морфологическими вариантами НС нет значимых различий по плотности капилляров, мезангиоцитов и эндотелиоцитовв клубочках. 9 Библиографический указатель 1. Пальцев, М. А., [ред.]. Патология: курс лекций. М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2007. Т. 2. с. 487-503 2. Akaoka K., White R. H., Raafat F. // J Pathol, 1994, vol. 173 (3), pp. 261-268. 3. Avila-Casado M. C., Perez-Torres I., Auron A. et al. // Kidney Int, 2004, vol. 66, pp. 133– 143. 4. Coward R. J. M., Foster R. R., Patton D. et al. // J Am Soc Nephrol, 2005, vol. 16, pp. 629– 637. 5. Guan N., Ding J., Zhang J. et al. // Pediatr Nephrol, 2003, vol. 18, pp. 1122–1127. 6. Hara M., Yanagihara T., Kihara I. // Nephron, 2001, vol. 89, pp. 342-347. 7. Kim Y. H., Goyal M., Kurnit D. et al. Kidney Int, 2001, vol. 60, pp. 957–968. 8. LanXu, Hai-Chun Yang, Chuan-Ming Hao et al. // Modern Pathology, 2010. vol. 23, pp. 1241-1250. 9. Lemley K. V., Lafayette R. A., Safai M. et al. // Kidney Int, 2002, vol. 61, pp. 1475–1485. 10. Macedo C. S., Lerco M. M., Capelletti S. M. et al. //Acta Cirúrgica Brasileira, 2007, vol. 22 (5), pp. 337-341. 11. Matovinović M. S. //eJIFCC 20/01 2009, http://www.ifcc.org. 12. Mundel P., Shankland S. J. // J Am Soc Nephrol,2002, vol. 13, pp. 3005–3015. 13. Nakamura T., Ushiyama Ch., Suzuki Sh. et al. // Nephrol Dial Transplant, 2000, vol. 15, pp. 1379–1383. 14. Nakamura T., Ushiyama Ch., Suzuki Sh. et al // Am J Nephrol, 2000, vol. 20, pp. 175-179. 15. Pagtalunan M. E., Miller P. L., Jumping-Eagle S. // J Clin Invest, 1997, vol. 99, pp. 342–348. 16. Pagtalunan M., Grachman J., Meyer T. // Kidney Int, 2000, vol. 57, pp. 2644–2649. 17. Petermann A. T., Krofft R., Blonski M. et al. // Kidney Int, 2003, vol. 64, pp. 1222–1231. 18. Sanden S. K., Wiggins J. E., Goyal M. et al. // J Am Soc Nephrol, 2003, vol. 14, pp. 2484– 2493. 19. Savin V. J., Sharma M., Sharma R. et al. // N Engl J Med, 1996, vol. 334, pp. 878-883. 20. Sharma M., Sharma R., McCarthy E. T. et al. // J Am Soc Nephrol, 1999, vol. 10, pp. 552– 561. 21. Siu B., Saha J., Smoyer W. E. et al. // BMC Nephrology, 2006, vol. 7, pp. 6-16. 22. Spadlo A., Wyka K., Kowalewska-Pietrzak M. et al. // Polski merkuriusz lekarski, 2007, vol. 22 (130), pp. 254-263. 23. Steffes M. W., Schmidt D., McCrery R. et al. // Kidney Int, 2001, vol. 59, pp. 2104-2113. 24. Suzuki J., Yoshikawa N., Nakamura H. //Pediatr Nephrol, 1994, vol. 8 (4), pp. 416-419. 10 25. Vogelmann S. U., Nelson W. J., Myers B. D. et al. // Am J Physiol Renal Physiol, 2003, vol. 285: F40–F48. 26. Wei M. J., Wu W. L., Chen M.Y. //Chin J Contemp Pediatr, 2010, vol. 12 (8), pp. 630-633. 27. Yu D., Petermann A., Kunter U et al. //J Am Soc Nephrol, 2005, vol. 16, pp. 1733–1741. 11
