экологическая роль бактериального сообщества эпифитов
реклама
На правах рукописи да ЗАИКИНА Ирина Аркадьевна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ЭПИФИТОВ ФИЛЛОСФЕРЫ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ 03 00 07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь - 2008 0 0 3 1G8BS3 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Мануйлов Игорь Михайлович. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент Василенко Надежда Филипповна; кандидат биологических наук, доцент Карасева Эмма Викторовна. Ведущая организация: ФГОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Защита диссертации состоится 21 мая 2008 г в 11-00 часов на заседа­ нии диссертационного совета ДМ 212 256 09 в Ставропольском государ­ ственном университете по адресу 355009, г Ставрополь, ул Пушкина, 1, корп 2, ауд 506 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского іосударственного университета Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета / g ёИіЛСЛЛ ц 2008 г Ржепаковский И В ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Изучение микробно-раслтельных взаимодействии одно из быстро развивающихся направлений в современной биологии До последнего времени исследования микрофлоры растений, главным образом, были связаны с почвенными и ризосферными микроорганизмами, являю­ щимися симбионтами растений Значительно меньше внимания уделялось эпифитным микроорганизмам филлосферы При ее изучении интерес, в ос­ новном, был направлен на установление квантитативных показателей Видо­ вой состав, по мнению исследователей, зависел, главным образом, от случай­ но попадающих на растение микроорганизмов из воздуха, почвы, а также микробов занесенных с помощью насекомых (Burn R, 1903, Duggeli M, 1904, Clark N A, Weller H, 1929, Roller Е М, 1934) В то же время, трудно предста­ вить, что в процессе эволюции такой громадный полигон для роста микроор­ ганизмов, каким является филлосфера, не был бы заселен Микроорганизмы обитают повсеместно, постоянный контакт и сожительство должны были в процессе эволюции привести к появлению взаимовыгодных отношений меж­ ду растениями и микроорганизмами в результате естественного отбора В настоящее время некоторые исследователи подтверждают представ­ ления о том, что микрофлора надземных органов растений не является случайным скоплением микробов, а образует континуум микробно-растительных ассоциаций, внутри которых существует строгая видовая спе­ цифичность микроорганизмов для отдельных видов и органов растений, ее динамичность в течение вегетации, зависимость от условий произрастания растений и от ряда абиотических и биотических факторов (Холодный Н Г, 1953, Возняковская Ю М, 1969, Звягинцев Д Г, 1993, Jacques М А, Morris С Е, 1995, Добровольская ТГ, 2002, Глушакова А М , Чернов И Ю , 2004, Торопова Г В , 2005) Свойства, присущие эпифитным микроорганизмам и про­ явление их в вариативных условиях внешней среды, различны Изменение экологической обстановки может приводить к трансформации количествен­ ного и качественного составов микроорганизмов, к смене биотических отношений (Широков О Г, 1959, Самцевич С А , 1961) Можно предположить, что наряду с другими факторами, обеспечива­ ющими иммунитет у растений, эпифитная микрофлора служит первич­ ным барьером для защиты растений от попадающих из окружающей сре­ ды сапрофитных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, что делает перспективным и актуальным исследования по данной проблеме До настоящего времени не существует единой методики отбора материалов, культивирования эпифитных микробов на питательных средах, не существует единой классификации эпифитной микрофлоры филлосферы До сих пор 3 делаются попытки раскрыть экологическую роль микрофлоры растений, но сущность влияния микроорганизмов на растения изучена далеко недоста­ точно, несмотря на то, что она представляет большой интерес и имеет прак­ тическое значение В связи с вышеизложенным, комплексный подход к изу­ чению количественного и качественного состава эпифитной микрофлоры филлосферы, выявление особенностей взаимодействия эпифитных микро­ организмов с растениями и изыскание оптимальной питательной среды (ПС) для культивирования эпифитов представляется достаточно актуальным Цель исследования: изучить особенности структуры микробных ком­ плексов экологических ниш филлосферы (геммисферы, филлоплана, по­ верхности цветков, карпосферы) и определить экофизиологическую роль микроорганизмов в жизни растений Задачи исследования: 1) разработать питательную среду на основе тыквенного отвара для культивирования эпифитной микрофлоры «ТСЭМ» (тыквенная среда для культивирования эпифитной микрофлоры), 2) провести сравнительную оценку роста эпифитной микрофлоры на различных питательных средах, 3) установить квантитативные показатели эпифитной микрофлоры на экологических нишах филлосферы, 4) провести идентификацию штаммов микроорганизмов и уточнить видовой состав эпифитных микроорганизмов на различных экологических нишах филлосферы, 5) определить экофизиологическую роль эпифитных микроорганизмов, ассоциированных с растениями, Научная новизна. Впервые был применен комплексный подход в ис­ следовании эпифитной микрофлоры, охватывающий экологические ниши филлосферы, в частности, геммисферу, филлоплан, цветки и карпосферу Уточнен видовой состав эпифитов в экологических нишах филлосферы Выявлены доминантные представители эпифитной микрофлоры надзем­ ных органов растений Установлена численность эпифитной микрофлоры филлосферы зеленых растений в сезонной и годовой динамике Выявлены представители эпифитов, имеющих высокую адаптивную способность к воздействию экологических факторов Разработана новая питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры «ТСЭМ», изготовленная по оригинальной технологии на основе тыквенного отвара Ее приоритетность подтверждена уведомлени­ ем о положительном результате формальной экспертизы на изобретение, заявка от 27 08 2007, № 2007125909/13 4 Теоретическая и практическая значимость. Сведения о видовом соста­ ве эпифитной микрофлоры из разных экологических ниш филлосферы дают основания говорить о разнообразии эпифитов, входящих в различ­ ные таксономические группы Выделены доминантные представители эпи­ фитной микрофлоры экологических ниш филлосферы Разработана и вне­ дрена питательная «ТСЭМ» для культивирования эпифитных микроорга­ низмов Научные разработки используются в работе лаборатории науч­ но-образовательного центра «Технологии живых систем и биологических материалов» Ставропольского государственного университета, а также в учебнОдМ процессе медико-биолого-химического факультета СГУ при чте­ нии курсов «Микробиология», «Микробиоценозы человека, животных и растений», «Санитарная микробиология», «Экология» При помощи ком­ пьютерного комплекса визуализации изображения создана база фотогра­ фий эпифитных микроорганизмов филлосферы Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доло­ жены и обсуждены на межрегиональных научных конференциях «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2005,2006, 2007), в межвузовском сборнике научных работ «Естествознание и гуманизм» (Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Монито­ ринг природных систем» (Пенза, 2007), VII Международной научной конфе­ ренции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2007) Основные положения, выносимые на защиту 1 Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры технология приготовления и результаты исследования 2 Динамика (циркааннуальная и годовая) квантитативных показателей эпифитных микроорганизмов на экологических нишах филлосферы 3 Трансформация видового состава эпифитной микрофлоры филлосферы 4 Специфичность эпифитных микроорганизмов филлосферы Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 14 работ, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня веду­ щих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени Объем и структура диссертационной работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследо­ ваний, заключения, выводов, практических предложений, списка исполь­ зованной литературы в количестве 195 научных источников, в том числе на иностранном языке - 48 Работа изложена на 150 страницах компьютер­ ного текста, содержит 13 таблиц, 8 рисунков и 53 фотографии 5 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводились на базе кафедры общей биологии, НОЦ «Технологии живых систем и биологических материалов» Ставропольско­ го государственного университета в течение 2004-2007 гг Объектами ис­ следований служили микроорганизмы, выделенные с культурных и дико­ растущих растений Rubus L, Pyrus L, Malus Mill, Ceiasus Juss, Rosa canina L, Sorbus aucupana L, Prunus L , Viburnum opulus L , Juglans regia L , Querents robur L, Betula pendula L , Giossulana Mill, Ribes L , Salix alba L, Syringa vulgaris L. Отбор проб эпифитной микрофлоры проводился в сезонной динамике с геммисферы, филлоплана, поверхности цветков, карпосферы (методами отпечатков и смыва) (Нетрусов А И , 2005) Все пробы снимали с разных частей растений 2 раза в месяц на поверхность питательной среды в 3-х кратной повторности каждого образца Культивирование микроорганизмов проводили при t = 28±2°С в течение 2-9 суток на ПС «ТСЭМ» (Мануйлов И М , Заикина И А, 2005) Изучали культуральные, тинкториальные, биохимичес­ кие, физиологические свойства эпифитных микроорганизмов Концентра­ цию водородных ионов (рН) в питательной среде «ТСЭМ», клеточном соке растений и осадках определяли с помощью рН-метра - «рН-150 М» Химический анализ среды «ТСЭМ» включал выявление углеводов методом хроматографического анализа (Березкина В Г, 1986), элементный анализ на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer-2280 (USA)(ВолгинВ И, 1969, Мокроиосов A T , БорзенковаРА , 1978), каче­ ственный анализ витаминов (Березов ТТ, Коровкин Б Ф, 2002), определе­ ние общего азота методом Кьельдаля (Волгин В И , 1969), а также другие химические показатели среды «ТСЭМ» Изучение количественных показателей симбиотрофных эпифитных бактерий проводили в лабораторных условиях по общепринятым методи­ кам (Возняковская Ю М , 1958, Пименова М Н и др , 1971, Аникиев В В , Лукомская К А , 1997, Теппер Е 3 ,2004) Идентификацию микроорганиз­ мов осуществляли, руководствуясь определителями Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, Kurtzman С P, Fell J W, 1998, Саттон Д и др , 2001, Вейант Р, Мосс У и др, 1999) Фотографирование препаратов микроорганизмов осуществляли при помощи компьютерного комплекса визуализации изображения на базе микроскопа «Микмед-2» и цифровой фотокамеры «Olympus-5050» Резуль­ таты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с помощью программы Primer of Biostatics (Version 4 03) 6 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Технология приготовления питательной среды «ТСЭМ» и ее характеристика Исходя из того, что эпифитиые микроорганизмы - эккрисотрофы, при­ способившиеся питаться выделениями растений на протяжении длитель­ ной эволюции, можно было предположить, что их потребностям больше всего будут соответствовать среды из растительных отваров. Особеннос­ тью эпифитной микрофлоры является способность развиваться на средах с низкой концентрацией питательных веществ. Питательная среда, основой которой будет являться тыквенный отвар, может служить оптимальной ПС для культивирования эпифитной микрофлоры, учитывая ее высокую поликомпонентность. Проведя ряд исследований, мы убедились в полноценнос­ ти «ТСЭМ» по химическому составу (рис.1). Установлено, что «ТСЭМ» имеет широкий набор активных субстанций, необходимых для полноценного развития различных физиологических групп микроорганизмов: макро- и мик­ роэлементы, витамины, углеводы (рис. 1), а также белки в составе 0,8 г/100 г, каротин - 0,6 г/100 г, общий азот - 0,034 %, зола - 0,6 %. В ПС обнаружены органические кислоты - яблочная, винная, лимонная, щавелевая. Рис. 1. Некоторые показатели химического состава питательной среды «ТСЭМ»: А - витамины, %; Б - углеводы, %; В - элементный состав, %. 7 Технологический цикл получения ПС включает две стадии 1 стадия приготовление тыквенного отвара (ТО) 200-250 г мелко нарезанной тыквы, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин Жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем до 1 л кипяченой водой 2 стадия к ТО добавляют 20-25 г агара, 1 г - (NH4)2HP04,1 г - NaCl, рН = 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 2 атм Срок годности ПС «ТСЭМ» составляет 3 месяца со дня изготовления, при условии хранения при t = +2-3 °С Готовая жидкая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный) Преимущества ПС «ТСЭМ» экологически чистая ПС, т к в состав вхо­ дит натуральный продукт растительного происхождения, не требует добав­ ления стимуляторов роста для микроорганизмов, доступный способ при­ готовления ПС в стационарных условиях, не требует добавления дорогос­ тоящих веществ для улучшения питательной ценности среды, ПС содер­ жит достаточно веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорга­ низмов, длительный срок хранения «ТСЭМ», круглогодичная доступность ингредиентов для приготовления ПС Сравнительная оценка роста эпифптноіі микрофлоры на различных питательных средах Культивирование микроорганизмов на первых этапах исследования проводили на трех средах (ГРМ-агар, капустная среда № 19, «ТСЭМ»), с целью выявления наиболее благоприятной среды для культивирования эпифитных микроорганизмов Обильный рост микроорганизмов наблю­ дался на ГРМ-агаре у Micr aurantiaca, Косигш rosea, Mycoc luteus, Kocuria rhizophila, которые быстро развивались на данной среде, подав­ ляли рост споровых форм и типичных представителей эпифитной микро­ флоры, являющиеся олиготрофами. Рост микроорганизмов на капустной среде № 19 проявлялся образованием слизи на поверхности среды и вок­ руг колоний, что затрудняло выделение чистой культуры и, в дальнейшем, идентификацию микроорганизмов При культивировании эпифитной микрофлоры на питательной среде «ТСЭМ» давали обычный рост микроорганизмы, входящие в различные таксономические группы, но обильный рост отмечался у типичных пред­ ставителей эпифитной микрофлоры Изменений тинкториальных, культуральных, морфологических свойств микроорганизмов на среде не отме­ чено ПС «ТСЭМ» имеет в своем составе широкий набор активных суб­ станций, необходимых для полноценного развития различных видов эпи­ фитной микрофлоры В результате сравнительной оценки питательных сред дальнейшие исследования проводили на «ТСЭМ». 8 КВАНТИТАТИВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ВИДОВОЙ СОСТАВ ЭПИФИТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ НИШАХ ФИЛЛОСФЕРЫ Гсммпсфера Изучение эпифитной микрофлоры геммисферы является неотъемле­ мой частью в исследованиях микроорганизмов филлосферы в целом По мнению ряда авторов, геммисфера является носителем типичных предста­ вителей эпифитной микрофлоры, которые, попадая в почки в осенний период их формирования, обеспечивают себе условия для перезимовки Весной эпнфитные микроорганизмы из почек рассредотачиваются на поверхности филлоплана, цветков и карпосферы В собственных исследованиях проведенных в осенне-зимне-весенний период исследовали количественный и видовой состав геммисфе­ ры Количественные показатели микроорганизмов геммисферы в 2005-2007 гг преобладали у следующих растений Rubus L, Rosa camna L , Sorbus aucuparia L , Grossitlarm Mill, Ribes L , Salix alba L , Synnga vulgaris L., по сравнению с Pyrus L , Malus Mill, Cerasus Juss , Primus L, Juglans regia L , Quercus robur L , Betula pendula L (табл 1) Возможно, это связано с морфологическими особенностями и био­ химическими показателями геммисферы, а также с бактерицидной ак­ тивностью данных растений Микрофлора геммисферы присутствует в почках и в зимний период, причем увеличение численности микроорганизмов наблюдается в февра­ ле месяце и достигает своего пика в период раскрытия почек Резких отли­ чий в разнице квантитативных показателей по годам в геммисфере изуча­ емых растений не было отмечено Видовой состав геммисферы, по сравнению с другими экологичес­ кими нишами на протяжении всех периодов исследований, оказался более однородным и постоянным. Видовой состав геммисферы всех модельных растений представлен следующими эпифитными микроор­ ганизмами Bacillus subtdis, Вас megatenum, Вас mesentericus, Paenibacillus macerans, Paembacillus polymyxa, Lactobacillus plantarum, Pantoae agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Ps fliiorescens, Ps putida, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter flavescens, Arthrobacter album, Pullularia pullulans, Kocuria rosea, Mycobacterium phlei, которые встречаются и на других экологических нишах филлосферы 9 Квантитативные показатели эгшфитных микроор на экологических нишах филлосферы (КОЕ х Rubus L 734*032(14,25*0,11 6 66*0.54 0,99*0,11 ' 17 11±0 14 8 56*021 Pymih Malm Mill 101*0,14 20,60*016 1056*0 13 Cermus 135*0,15 , 1033±045 5,66*0 11 Juss Row canmaL 9,45*0,48 123,36*0,34 1433*0.22 Sorbus au863*037 14,77±057 6 00±0?0 cupana L Prvnw L 145±0 12 1 1811±035 8 00*030 Viburnum 1 1,28*0,22 23 87*0.23 7,45±017 opuhn L luglans 030*0,10 0,45*0,22 034*015 regia L Qucrai\ 0,29*0,09 | 1,78*0,21 0 50*0^4 rvbur\. Bewlapen1,58±0,13 I 14,33*0,23 5 77*017 dula L GrOKirlana 6 84±0 42 j 1945*0 11 6 86*0,42 Mill Rib a L 6.23*0 36 1 15,11±017 8,77*0,48 Sal ix alba L 5 59*0,27 12,33*0,24 738*032 Seringa vul­ 6,59*0,24 ' 11 32*0 19 433*0 IS garis L карпосфера цветок о - филлоплап 1 геммисфера У — 2006 карпосфера Названия растений цветок 2005 1 14 76*034 10,24*0 47 2792*021 6 64*042 i 13 66*02 20 63*023 2 01*0,10 2047±019 949*024 12366*01 19,00±016 2,43±0,11 25,55*0,17 11 65*0,24 ! 18,44*0.2 13 67±0,43 2,67*0,21 15,64*011 6 84*042 | 14 87*03 2533*056 1161*0,30 26 73±0,16 10,47*0 13 i 25 77±0 1 U,43±011 116640 31 15 89*021 734*014 | 1145*0.2 22,22*011 2 43±O03 23,29*031 7,56*011 2056*05 19,00*0,21 1046*0.21 25,65*022 9 56*021 | 17,45*0,1 1,43±0,Ю 1,83*0 16 2 67*0,12 034*019 i 244*014 2,01±010 1,36*0 15 1 76*0,10 0 37*028 i ЗР1±0ЛЗ Зр5±0,12 1,34*0,13 18 58*0,16 6,76*024 ] 436*0,32 23,55*015 9 47±0 32 1865*015 834*036 ! 1945*03 16 66±0 I9J 9,45*034 29,46*0,18 7,99*047 ' 15 67*0 6 856*0,21 644±0 42 11 68*034 8 55*054 1 1023*01 466*0,11 9 58±0 53 15,77*033 5 78*022 } 422*028 Филлоплан Исследование микрофлоры филлоплана проводили путем отбора проб с нижней и верхней поверхности листовой пластинки. Результаты числен­ ного состава колоний на верхней и нижней поверхности листовой плас­ тинки изучаемых растений отражены на рис. 1,2. Количественные показатели колоний микроорганизмов на нижней поверхности листовой пластинки оказались выше, чем на верхней. Это объясняется меньшим воздействием солнечной инсоляции, достаточ­ ным увлажнением, более низкой температурой на нижней стороне ли­ стовой пластинки. В весенний период 2005 г. поверхность филлоплана подверглась воздействию кислотных осадков (рН 4,5-5,0), в результате чего произошло снижение квантитативных показателей эпифитных мик­ роорганизмов на поверхности филлоплана всех исследуемых растений. В связи с изменением водородного показателя в сторону ацидофиль­ ное™ на филлоплане увеличилась численность микроскопических гри­ бов: Mucor ramosissimus, Alternaria alternata, PeniciUium chrysogenium, Pullularia pullulans. При сравнении результатов квантитативных показателей разных мето­ дов исследования - отпечатков (рис.1 и 2) и смыва (табл. 1), показано сни­ жение количества микроорганизмов у всех исследуемых растений на дан­ ной экологической нише. Следовательно, с достаточной долей вероятнос­ ти, можно предположить, что изменения количественных показателей свя­ зано с варьипованием волополного показателя. </.„/; <Ж/М/УУ^/У Ф& 'Ѵ^&Ѵ <? «ѵ у <& Рис. 2. Количество колонии микроорганизмов на верхней поверхности филлоплана за 2005-2007 гг. (метод отпечатков). 1 1 поверхности филлоплана за 2005-2007 гг. (метод отпечатков). Видовой состав филлоплана более разнообразен и представлен сле­ дующими видами микроорганизмов: Pseudomonas fluorescens, Ps. chlororaphis, Ps. liquefaciens, Ps. radiobacter, Ps. putida, Ps. aeruginosa, Pantoae agglomerans, Вас. megaterium, Вас. megaterium, Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. mycoides, Paenibacillits polymyxa, Paenibacillus macerans, K. rosea, Aspergillus flavus, A. niger, Lactobacillus plantarum, Arthrobacter album, Arthrobacter flavescens, Lactobacillus plantarum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophiticus, Candida albicans, Serratia liquefaciens, Serratia marcensens, Erwinia amylovora. В совокупности квантитативные показатели филлоплана оказались бо­ лее высокими в сравнении с другими экологическими нишами филлосферы, что можно объяснить длительным взаимодействием эпифитной мик­ рофлоры растения с поверхностью филлоплана. Поверхность цветков Исследования показали, что, несмотря на короткий срок цветения, на поверхности цветков наблюдается динамика численности микроорганизмов (табл.1, рис. 4). Видовое разнообразие эпифитной микрофлоры цветков ха­ рактерно для всех экологических ниш исследуемых растений. Особенность качественного состава микрофлоры поверхности цветков заключается в том, что наряду с истинными эпифитами, обнаруживается сопутствующая мик12 рофлора, занесенная различными насекомыми. Видовой состав цветков представлен следующими эпифитами: Pseudomonas chlororaphis, Ps. liquefaciens, Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. radiobacter, Ps. putida, Ps. desmolytica, K. rosea, K. rhizophila, Rhodococcus flavum, Lactobacillus plantarum, Sporobolomyces roseits, Cryptococcus albidus, Escherichia coli, Kocuria rosea, Erwinia amylovora, Pantoae agglomerans, Arthrobacter flavescens, Arthrobacter album, Lactobacillus plantarum, Pullularia pullulans, Вас. subtilis, Вас. megaterium, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis, Sarcina maxima. Рис. 4. Количество колонн» микроорганизмов поверхности цветков за 2005-2007 гг. (метод отпечатков) Карпосфера Исследование области карпосферы было затруднено в связи с особен­ ностями морфологического, физиологического, биохимического различия плодов (консистенция околоплодника, объем плодов, цвет, выделения). Следовательно, сравнение квантитативных показателей возможно только в циркааннуальной динамике каждого растения. На данной экологической нише также прослеживается сезонная динамика. Исследование карпосфе­ ры методом отпечатка показало, что в 2005 г. наблюдалось снижение коли­ чественных показателей микробов у всех растений по сравнению с 20062007 гг. (рис. 5, табл. 1). Pyrus L., Mains Mill., Primus L., Juglans regia L., Grossularia Mill., Cerasus Juss., Viburnum opulus L., Ribes L. имеют более высокие квантитативные показатели по сравнению с Rosa canina L., Sorbus aucuparia L., Juglans regia L., Quercus robur L., Betulapendula L., Salix alba L., 13 Syringa vulgaris L. Видовой состав карпосферы представлен следующими видами Alternaria alternata, Aspergillus flavus, A. niger, Paenibacillus macerans, Вас. megaterium, Вас. mesentericus, Вас. mycoides. Вас. subtilis, Candida albicans, Ps. liquefaciens, Ps. fluorescens, Ps. chlororaphis, Ps. putida, Pulhdaria pullulans, Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus, Rhodococcusflavum, Arthrobacter agilis, Arthrobacterflavescens, Arthrobacter album, Lactobacillus plantarum, Pantoae agglomerans, K. rosea, Sarcina maxima, Sarcina ventriculi, Escherichia coli, Penicillhtm chrysogenium, Rhodococcus eiytrhopolis, Rhodococcus rubber, Rhodotorula glutinis, Sarcina maxima, Sar. ventriculi, Sporobolomyces roseus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophiticus, Serratia liquefaciens, Serratia marcensens, Erwinia amylovora, Erwinia alni, Micr. luteus. / / *w/ / / o*>V / / / £ # y&~* О / / . <tf 0v / / of « J? & Рис. 5. Количествоколоііиіі микроорганизмов поверхности карпосферы за 2005-2007 гг. (метод отпечатков) Проблемы идентификации эпифитных микроорганизмов Идентификация микроорганизмов является длительным, сложным и трудоемким процессом и представляет значительные трудности. Иденти­ фикация эпифитной микрофлоры затруднена тем, что ряд видов микро­ организмов, входит в разные физиологические группы. Поэтому для це­ лей идентификации принято пользоваться набором питательных сред, на которых проявляются характерные особенности роста данного микроор­ ганизма, а также наблюдается изменение самих сред в процессе его выра­ щивания. Сложность процесса дальнейшей идентификации при использо14 вании набора питательных сред заключается в большом количестве элек­ тивных и дифференциально-диагностических сред (от 15 до 25), кото­ рые характеризуются относительной долговечностью, их использование снижает затраты на проведение анализа за счет сокращения времени, экономии реактивов, бактериологической посуды, но не снижает себе­ стоимость самого процесса идентификации микроорганизмов, не го­ воря об экономической эффективности. При определении видов у мик­ роорганизмов необходимо учитывать конститутивные и адаптивные свойства бактерий, последние при изменении условий внешней среды изменяются, что затрудняет процесс идентификации Трудности возникают при идентификации рода Bacillus, характери­ зующегося видовым разнообразием, морфо-физиологической колониаль­ ной изменчивостью, на разных средах колонии R-формы могут перехо­ дить в колонии S-формы и наоборот, что затрудняет первичное опреде­ ление по культуральным и тинкториальным признакам Также иденти­ фикация рода Bacillus затруднена тем, что виды имеют различные раз­ новидности В настоящее время не существует полных и однозначных сведений в литературе по определению представителей рода Bacillus Все культуры, кроме дрожжей, сарцин и споровых форм просмат­ ривали под микроскопом дважды в молодом возрасте (1-2 сут) и бо­ лее старом (7-10 сут) Это делается с целью установления морфоло­ гических особенностей микобактерий во вторую стадию их развития, без чего невозможно их определение Только при таком двухступен­ чатом изучении получается возможность отличить некоторые мико­ бактерий, имеющие клетки в виде палочек, от истинных бактерий (на­ пример, Arhtrobacter globiformis) или микобактерий от микококков (например, Мус brevicale), что ограничивает идентификацию во вре­ менном промежутке Количество жгутиков и их расположение является одним из наибо­ лее характерных признаков для каждого вида микроорганизма, облада­ ющего подвижностью Поэтому точное изучение вида без изучения числа и характера расположения жгутиков невозможно Трудность зак­ лючается в том, что они становятся видимыми в микроскоп только после специальной подготовки препарата и его окрашивания Лучшим мето­ дом наблюдения за характером образования жгутиков является их изу­ чение в электронном микроскопе при больших увеличениях, что воз­ можно только в крупных лабораториях Наиболее общепринятыми ме­ тодами окраски жгутиков в настоящее время можно считать метод Фонтана (Нетрусов А И , 2005) 15 Представители эпнфитной микрофлоры филлосферы Таким образом, в результате исследования было выделено и определе­ но 53 вида микроорганизмов филлосферы AUernana alternate, Arthrobacter agilis, Arthrobacter album, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter flavescens, Aspergillusflavus,A niger, Bacillus mycoides, Вас megatermm, Вас cereus, Вас mesentencus, Вас subtilis, Candida utilis, Candida oleophila, Candida albicans, Cryptococcus albidus, Crmagnus, Cr laurentu, Escherichia coli, Kocw іа rhizophila, К rosea, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Mucor ramosissimus, Мус phlei, Paembacdlus macerans, Paenibacillus polymyxa, Pantoae agglomerans, Pemcillium chrysogenium, Ps aeruginosa, Ps chlororaphis, Ps syrmgae, Ps desmolytica, Ps Jluorescens, Ps liquefaciens, Ps putida, Ps radiobacter, PuUulana pullulans, Rhodococcus erytrhopohs, Rhodococcus flavum, Rhodococcus rubber, Rhodotorula mucilagmosa, Rhodotorula glutinis, Sarcina maxima, Sar ventriculi, Sporobolomyces roseus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophiticus, Serratia liquefaciens, Serratia marcensens, Erwima amylovora, E aim, Micr luteits Выделенные микроорганизмы принадлежат к 24 родам Bacillus spp, Pseiidomonas spp, PuUulana sp, Aspergillus spp, AUernana sp, Pemcillium sp, Lactobacillus spp, Rhodotorula spp, Sarcina spp, Candida spp, Kocuria spp, Cryptococcus spp, Sporobolomyces sp, Paembacdlus sp, Mucor sp Rhodococcus spp , Arthrobacter spp , Pantoae sp , Echerichia sp , Staphylococcus spp, Erwima spp , Mycobacterium sp , Micrococcus sp На всех экологических нишах филлосферы растений обнаружено 11 постоянно присутствующих видов Pseiidomonas jluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pantoae agglomerans, Arhtrobacter flavescens, Artrobacter album, Lactobacillus plantarum, PuUulana pullulans, Kocuria rosea, Bacillus megatermm, Bacillus subtilis, которые мы относим к типичным эпифитам филлосферы (рис 6) ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЭПИФИТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЛОСФЕРЫ Изучение сезонной и годовой динамики эпифитной микрофлоры и структуры микробных популяций филлосферы растений показало, что эпифитные микроорганизмы характеризуются большой вариабельностью, как по численности, так и по видовому составу в зависимости от сезонного развития растений, их бактерицидной активности и метеорологических усло­ вий, вегетационного периода На экологических нишах филлосферы фор­ мируется микробный комплекс, трансформирующийся по мере развития 16 > if*>iia v \ #* 4 «./'" У ш и т тли т. ч > ¥і> /.-а* •*'** х А . Д Рис. 6. Некоторые типичные представители эпифитной микрофлоры Б) Kocuria rosea; В) Arhtrobacter flavescens; Г) Arhtrobacter album E) Bacillus megaterium. растений и отличающийся определенным соотношением разных физио­ логических групп микроорганизмов Эпифитная микрофлора обладает фунгицидными свойствами, что позволяет блокировать развитие фитопатогенных биотрофов и некротрофов Стеноионность эпифитных микроор­ ганизмов находится в пределах рН 7,0-7,4 Эпифитная микрофлора имеет высокую экологическую валентность и пластичность, о чем говорит рас­ пространение некоторых эпифитов на всех экологических нишах филлосферы, видовое сходство с ризосферной и почвенной микрофлорой Эпи­ фиты обладают биотическим потенциалом, который обусловлен достаточ­ ной степенью сопротивляемости некоторых видов микроорганизмов не­ благоприятным факторам окружающей среды Симбиотрофная микробиота растений представляет собой динамичный комплекс, который проявляется на всех экологических нишах филлосферы (геммисфере, филлоплане, поверхности цветков, карпосфере) Анализ кван­ титативных показателей в циркааннуальной и годовой динамике 15 расте­ ний показал зависимость численности микроорганизмов от абиотических и биотических факторов, физиологических особенностей растений На всех экологических нишах филлосферы растений обнаружено 11 кон­ стантно присутствующих микроорганизмов Psfluorescens,Ps chlororaphis, Ps putida, Pantoae agglomerans, Arthrobacterflavescens,Arlhrobacter album, Lactobacillus plantarwn, Pullulana pullulans, Вас subtilis, Вас megatenum, К rosea, которые мы относим к типичным эпифитам филлосферы Установлены изменения в качественном составе эпифитов в сторону увели­ чения споровых форм Вас subtilis, Paembacillus macerans, Вас megatenum, Вас mesentenciis, Вас mycoides, Paembacillus polymyxa, Lactobacillus plantarwn, что составило около 20% от общего числа микроорганизмов Роль эпифитной микрофлоры выражается в антагонистических функ­ циях, направленных на угнетение фитопатогенной микрофлоры и восста­ новлении рН среды на экологических нишах филлосферы Следовательно, можно предположить, что эпифитная микрофлора обес­ печивает первичный иммунный барьер в формировании неспецифичес­ кого иммунитета у растений ВЫВОДЫ 1 Разработана технология приготовления новой питательной среды на основе тыквенного отвара для культивирования эпифитной микрофлоры («ТСЭМ») Сравнительная оценка роста эпифитных микроорганизмов на 18 разных питательных средах показало, что питательная среда «ТСЭМ» яв­ ляется оптимальной для культивирования эпифитной микрофлоры 2 Квантитативные показатели эпифитной микрофлоры на экологичес­ ких нишах филлосферы, отражают динамическую модель жизнедеятель­ ности эпифитной микрофлоры, в результате которой установлен «филлосферный эффект», заключающийся в изменении численности микроорга­ низмов в разные периоды вегетационного состояния растений Возраст растений играет существенную роль в формировании бактериальных ком­ плексов в количественном отношении и качественном составе 3 Видовой состав эпифитов на экологических нишах филлосферы пред­ ставлен 53 видами микроорганизмов, входящими в различные физиологи­ ческие группы Во всех экологических нишах филлосферы растений обна­ ружено 11 константно присутствующих микроорганизмов Pseudomonas Jliioiescens, Pantoae agglomerans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Aihtrobacter flavescens, Aihtiobacter album, Lactobacillus piantarwn, PuUulana puUulans, Bacillus subtihs, Косина rosea, Bacillus megaterium, которые можно считать типичным эпифитами 4 Абиотические факторы окружающей среды оказывают существен­ ное влияние на рост эпифитной микрофлоры (рН среды, солнечная ради­ ация, влажность и т д ) Стеноионность эпифитных микроорганизмов на­ ходится в пределах рН 7,0-7,4 Кислотные дожди приводят к сдвигу водо­ родного показателя в ацидофильную сторону, следствием чего увеличи­ вается рост микроскопических грибов, способствующих возникновению фитопатогенных заболеваний растений 5 Эпифитная микрофлора обладает антибактериальными и фунгицидными свойствами и является первичным барьером, препятствующим раз­ витию условно-патогенных и патогенных микроорганизмов Эпифитная микрофлора имеет высокую экологическую валентность, пластичность и биотический потенциал ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Рекомендуется использовать питательную среду «ТСЭМ» в микроби­ ологической практике для культивирования эпифитных микроорганизмов филлосферы Результаты исследований могут быть использованы при приготовлении антигрибковых препаратов из ассоциаций эпифитных микроорганизмов в борьбе с фитопатогенной микрофлорой 19 Материалы диссертационной работы могут использоваться в научных целях, при составлении учебных и справочных,пособий, чтении лекций, ведении практических занятий по биотехнологии, микробиологии, экологии Список работ, опубликованных по теме диссертации 1 Заикина, И.А Экологическая роль эпифитной микрофлоры / И М Мануйлов, И А Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 50-й научно-метод конф «Университет­ ская наука - региону» /СГУ - Ставрополь, 2005 - С 188-189 2 Заикина, И А Особенности изменения эпифитной микрофлоры в вегетационный период у древесных растений / И М Мануйлов, И А Заи­ кина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 51-й научно-метод конф «Университетская наука - региону», посвящ 75-летию Ставропольского государственного университета / СГУ Ставрополь,2006 -С 126-128 3 Заикина, И А Особенности эпифитной микрофлоры оранжерейных и древесных растений / И М Мануйлов, И А Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 51-й научно-метод конф «Университетская наука - региону», посвящ 75-летию Ставропольс­ кого государственного университета/ СГУ - Ставрополь, 2006 - С 128-129 4 Заикина, И А Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры / И А Заикина, И М Мануйлов // Естествознание и гуманизм Сб. науч работ - Томск, 2006 - Т. 3 - № 2 - С. 67-68 5 Заикина, И А Сравнительная характеристика питательных сред для культивирования микроорганизмов филлосферы / И М Мануйлов, И А Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 52-й научно-метод конф «Университетская наука - региону» / СГУ - Ставрополь, 2007 -С 139-141 6 Заикина, И А Проблемы видовой идентификации эпифитной мик­ рофлоры / И А. Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 52-й науч - метод конф «Университетская наука - региону» / СГУ - Ставрополь, 2007 - С 59-65 7 Заикина, И А Биотехнология приготовления питательных сред для выращивания эпифитной микрофлоры / И М Мануйлов, И А Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материа­ лы 52-й научно-метод конф «Университетская наука - региону» / СГУ Ставрополь,2007 -С 127-130 8 Заикина, И А Изучение фунгицидных свойств эпифитных микроорга­ низмов / И А Заикина, С А Виноградский // Проблемы развития биологии и 20 экологии на Северном Кавказе Материалы 52-й научно-метод конф «Уни­ верситетская наука - региону» / СГУ - Ставрополь, 2007 - С 65-69 9 Заикина, И А Динамика сезонных колебаний количественного и ка­ чественного состава эпифитной микрофлоры / И М Мануйлов, И А Заи­ кина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 52-й научно-метод конф «Университетская наука - региону» / СГУ - Ставрополь, 2007 -С 130-132 10 Заикина, И А Симбиотические связи растений и эпифитной мик­ рофлоры / И М Мануйлов, И А Заикина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе Материалы 52-й научно-метод конф «Университетская наука - региону» / СГУ - Ставрополь, 2007 - С 132-139 11 Заикина, И А Эпифитная микрофлора здоровых растений / И А Заи­ кина // Общие проблемы мониторинга природных экосистем Всероссийская научно-практ конф Сб статей -Пенза РИОПГСХА,2007 -Ч 2 -С 40-44 12 Заикина, И А Некоторые представители эпифитных микроорганиз­ мов филлосферы как санитарноопасная патогенная микрофлора челове­ ка / И А Заикина // Состояние биосферы и здоровье людей Сб ст VII Междунар научно-практич конф - Пенза РИО ПГСХА, 2007 - С 79-81 13 Заикина, И А Экологическая роль эпифитной микрофлоры высших растений / И М Мануйлов, И А Заикина // Вестник Московского государ­ ственного областного университета Серия «Естественные науки» - 2007 № 1 - С 48-52 14 Заикина, И А Симбиотические связи эпифитной микрофлоры и растений / И А Заикина // Труды Кубанского государственного аграрного университета -2007 - № 8 -С 111-115 21 Формат 60x84 1/] б Бумага офсетная Подписано в печать 14 04 2008 Услпечл1,22 Тираж 100 экз Уч-издл1,15 Заказ 65 Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета 355009, Ставрополь, ул Пушкина, 1
