ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ риологическим исследованием патологического материала, полученного при комиссионном диагностическом убое реагирующих животных (выделена M. bovis). Источник возбудителя инфекции в этих хозяйствах не был выявлен. По-видимому, распространению туберкулеза крупного рогатого скота в районе способствовали: несвоевременная и неквалифицированная постановка диагноза (не использовались офтальмопроба и внутривенная туберкулиновая проба, не проводилась симультанная проба через 30–45 дней); нарушение сроков массовых диагностических исследований; передержка реагирующих животных; возможно несоблюдение режима пастеризации молока и обрата, как на неблагополучных фермах, так и на молокоперерабатывающем предприятии. Используемый в течение 1,5 лет в неблагополучных хозяйствах метод систематических диагностических исследова- ний животных с помощью ППД-туберкулина для млекопитающих, с последующей сдачей на убой реагирующих, не позволил оздоровить поголовье крупного рогатого скота всех неблагополучных хозяйств. Оздоровление этим методом было достигнуто только в СПК «Острогожсксадпитомник», имевшем незначительное количество животных. В ТОО «Кривополянское», «Должанское», «Красный май», «Девицкое» наиболее эффективным оказался метод полной замены поголовья, в результате чего ограничения по туберкулезу были сняты в 1999–2000 гг., и район в настоящее время считается благополучным. Анализ оздоровительных противотуберкулезных мероприятий, проведенных в Острогожском районе Воронежской области, показал, что метод полной замены неблагополучного стада эффективнее метода систематических диагностических исследований. УДК 619:616.579.873.21Т И.Б. Павлова, Д.А. Банникова (ВНИИВСГЭ) ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ ПОПУЛЯЦИЙ МИКОБАКТЕРИЙ Многие патогенные и потенциально патогенные бактерии способны существовать и активно размножаться не только в организме хозяина, но и в объектах окружающей среды: в почве, в воде, на растительных субстратах [2, 3, 4]. Совершенно очевидно, что перед патогенными бактериями, обитающими во внешней среде, возникает очень сложная задача — быть готовыми адаптироваться к условиям существования, качественно различающимся не только питательными субстратами, но и всем комплексом биотических и абиотических факторов. В настоящее время все больше осознается необходимость изучения экологии патогенных микроорганизмов с широких биологических позиций, привлечения популяционно-экологических подходов к решению фундаментальных и прикладных аспектов этой сложной проблемы. Целесообразность использования сканирующего электронного микроскопа в этой области очевидна, т.к. он помогает понять закономерности развития и существования бактерий в окружающей среде. Материалы и методы В опытах использован паспортизиВетеринарная патология. № 1–2. 2004 рованный штамм Mycobacterium avium, штамм № 61–97. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) мембранные фильтры с выросшими на них колониями микобактерий снимали с питательной среды и фиксировали парами 25%-ного глутарового альдегида, обезвоживали в парах пропиленоксида. Образцы препаратов напыляли платиной 20 минут на установке «Hitachi-Е-102» и просматривали на электронном микроскопе со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1–10 тыс. Для экспериментального исследования морфологии и выживания клеток M.avium в жидком навозе и воде в стерильную колбу на 100 мл вносили 50 мл стерильной воды и 20 г нативного навоза. Концентрация клеток М.аvium составляла 109 кл/мл. Температурный режим хранения тест-культур +22–26° С, срок наблюдения 12 месяцев. Отбор проб проводили каждые 3 месяца. Пробы жидкого навоза фильтровали через стерильный бумажный фильтр и наносили дозаторной пипеткой в количестве 0,5 мкл в центр мембранных фильтров 65 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ «Владипор» № 2, помещенных на поверхность среды Левенштейна-Йенсена. Чашки термостатировали при 37° С. Через 48– 72 часа учитывали рост культуры на поверхности фильтров. Для изучения морфологии клеток в популяции готовили препараты для световой и сканирующей электронной микроскопии. Для исследования влияния температурного фактора на выживание клеток М.avium культуру микобактерий выращивали на мембранных фильтрах при +42° С и затем помещали в холодильник в условия +4° С и -10° С. Срок наблюдения составил 120 суток. Исследование морфологии и выживания клеток проводили непосредственно после окончания времени экспозиции опыта, а так же после высева исследуемых образцов на среду Левенштейна-Йенсена для изучения процессов реверсии культуры с использованием методов сканирующей электронной микроскопии. Результаты исследований Исследование выживания популяций микобактерий в пробах воды и жидкого навоза в сканирующем электронном микроскопе выявило существование клеток Mycobacterium avium в микроколониях, закрытых покровами. Отмечено, что в голодной среде обитания (вода) покровы гладкие и более тонкие, часто выявляются места нарушения целостности покровов. В таких участках видны клетки микобактерий, объединенные межклеточным матриксом (рис. 1). При обитании микобактерий в жидком навозе, где имеется питательный субстрат, при СЭМ выявили формирование плотных, бугристых покровов (рис. 2). Общим для выживания популяций патогенных микобактерий в жидком субстрате была постепенная адаптация клеток в виде гетероморфизма с проявлением L-трансформации, что проявилось в поздние сроки наблюдения — 10–12 мес. (рис. 3). При высеве таких культур на среду ЛевенштейнаЙенсена наблюдали типичный рост культуры M.avium, что свидетельствовало о реверсии клеток в исходную форму. Адаптационная способность микобактерии в виде L-трансформации — закономерное явление, связанное с воздействием на популяции клеток абиотических факторов. Полученные нами экспериментальные данные позволяют заключить, что микобактерии способны не только выживать, но и размножаться на объектах окружающей среды. Другим разделом работы явилось изучение влияния температурного фактора на морфологию клеток микобактерий в популяции. При температуре +42° С культура ми66 кобактерий развивалась очень интенсивно, в течение 18–20 часов культивирования на мембранных фильтрах, помещенных на среду Левенштейна-Йенсена, появлялся обильный рост. Культура при этом имела плотный гладкий покров. Рядом исследователей показано, что при высоких температурах в клеточных стенках микобактерий увеличивается синтез миколовых кислот с высокой углеродной цепью (С60–С90). Следовательно, повышается и содержание в популяции кордфактора — 6,6-димиколат трегалозы — специфического гликолипида патогенных микобактерий, ответственного за вирулентность микобактерий [1]. Изучение развития микобактерий при пониженных температурах (+4° С) подтвердило точку зрения целого ряда исследователей о том, что снижение температуры вызывает уменьшение количества миколовых кислот и корд-фактора. При этом при низких температурах клеточные стенки и продуцируемые ими экзопродукты содержат больше ненасыщенных кислот с короткой углеродной цепью (С10–С12), что объясняется адаптацией клеток в ответ на изменение температуры окружающей среды [5, 6]. При низких температурах синтез ненасыщенных кислот способствует сохранению проницаемости и текучести мембран и контролируется на уровне плазмид. Такая температурная адаптация имеет исключительно важное значение для выживания клеток. На сканограмме (рис. 4) видно, что при +4° С покровы на поверхности клеток истончаются. При этом становится видна структура популяции, разделенная на отдельные кластры, в каждом из которых клетки имеют определенную ориентацию и находятся в ассоциации за счет межклеточного матрикса. Палочковидная форма клеток микобактерий в данном эксперименте, а так же их размер и наличие межклеточного матрикса предполагало способность популяции быстро реверсировать в исходное состояние при благоприятных условиях. Данное предположение было подтверждено при перенесении мембранных фильтров с культурой на свежую среду Левенштейна-Йенсена при +37° С. При этом наблюдали быстрый рост культуры, имеющей характерную пигментацию. Исследование в СЭМ препаратов из таких культур показало наличие на поверхности клеток массивных покровов (рис. 5). Сканирующая электронная микроскопия культуры микобактерий, хранившихся при -10° С, выявила значительную деградацию покровов на поверхности клеток. Отдельные клетки в популяции имели измененную форму (рис. 6). Ветеринарная патология. № 1–2. 2004 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ Остатки покровов Рис. 1. Микроколония M. avium. В участке повреждения покровов видны клетки микобактерий. Проба воды, 3 мес. СЭМ, × 3000. Рис.3. Фрагмент микроколонии M.avium. Видны измененные клетки на стадии L-трансформации. Проба воды, 10 мес. СЭМ, × 8000. Рис. 5. Микроколонии М. avium. Реверсия культуры при +37° С. СЭМ, × 5000. Ветеринарная патология. № 1–2. 2004 Рис. 2. Микроколония M. avium. Клетки закрыты с поверхности плотным покровом. Проба жидкого навоза, 3 мес. СЭМ, × 3000. Рис. 4. Фрагмент отдельного кластра в колонии М.avium (+4° С). СЭМ, × 4000. Рис. 6. Фрагмент колонии М. avium (-10° С). СЭМ, × 10000. 67 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ Таким образом, адаптационная способсокой устойчивостью к воздействию абионость микобактерий в условиях экстретических и биотических факторов окружамальных температур проявляется в текующей среды; чести липидов, продуцируемых клеточны- стратегия выживания популяций мими стенками, главным образом миколовых кобактерий связана с адаптационными мекислот и корд-фактора. ханизмами, проявляющимися в регуляции Важно отметить, что культивировасинтеза клеточной стенкой сложного комние M. avium при пониженных температуплекса липидов. Это проявляется в уменьрах (+4° С, -10° С) существенно не влияет шении синтеза миколовых кислот и кордна жизнеспособность популяции, но, можфактора при пониженных температурах, но полагать, приводит к временному сничто морфологически выражается в дегражению патогенности, обусловленному знадации наружных покровов и гетероморчительным уменьшением синтеза миколофизме клеток. Высокие температуры, навых кислот и содержания корд-фактора, против, вызывают увеличение синтеза мичто морфологически проявляется в деграколовых кислот и корд-фактора, что продации покровов на поверхности клеток миявляется в образовании массивных покрокобактерий. вов на поверхности клеток микобактерий. Заключение Таким образом, особую опасность для расЭкспериментальными исследованияпространения туберкулезной инфекции ми популяций патогенных микобактерий представляют условия повышенных темптичьего вида с использованием методов ператур. сканирующей электронной микроскопии Несмотря на структурно-функциональизучены факторы выживания и выявлены ные изменения, происходящие в популяструктурно-функциональные изменения в циях микобактерий при воздействии разпопуляции клеток при их существовании в личных факторов окружающей среды, поокружающей среде. К ним относятся: казана способность клеток микобактерий - способность клеток длительное время реверсировать в исходное состояние при выживать в микроколониях и колониях в благоприятных условиях. водной среде и на плотном субстрате, проАдаптационные механизмы, присущие являя адаптационную изменчивость в виде популяциям патогенных микобактерий, гетероморфизма с проявлением L-транспозволяют им длительно выживать и цирформации при неблагоприятных условиях; кулировать в окружающей среде, что обус- способность клеток продуцировать ловливает особое санитарное и эпидемиомежклеточный матрикс и массивные поклогическое значение возбудителей туберровы липидной природы, обладающие выкулеза. Литература 1. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. МГУ. 1984. С. 157. 2. Литвин В.Ю., Гинсбург А.Л. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерии. М.: НИИЭиМ. 1998. 3. Сомов Г.А., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий // Новосибирск: Наука. 1988. С. 5. 4. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах: Дисс. ... д.б.н., М., 1994. 5. Rilfors L. et al. Lipid and protein composition of membranes of Bacillus megaterium variants in the temperature range 5 to 70° C // J. Bacteriol. 1978. Vol. 135. N 3. P. 1043–1052. 6. Shleeva M. et al. Formation and resuscitation of non-culturable cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase // Microbiology. 2002. 148. N 5. P. 1581–1591. УДК 619:616.579.873.21Т Н.И. Баскаков, В.А. Бархударян, А.Н. Деринов (Комитет ветеринарии при Правительстве Калужской области) СИСТЕМА КОНТРОЛЯ ЭПИЗООТИЧЕСКОГО СТАТУСА СТАД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ В ХОЗЯЙСТВАХ КАЛУЖСКОЙ ОБЛАСТИ Из всех инфекционных заболеваний наибольший экономический ущерб животноводству причиняет туберкулез. Убикви68 тарность и устойчивость возбудителя, социальная опасность, сложность в диагностике ранних форм и дифференциация диаВетеринарная патология. № 1–2. 2004