Молекулярно - генетические маркеры иммунной системы у

Молекулярно генетические маркеры
иммунной системы у
больных муковисцидозом
Кондратьева Е.И., Сергиенко Д.Ф.,
Янкина Г.Н.
Томск – Астрахань – Москва
Актуальность
В настоящее время известна роль
цитокинов в развитии и поддержании
хронического воспалительного процесса
при муковисцидозе
Представляет научный и практический
интерес изучение вклада в развитие
заболевания
генов
МНС
и
генов
модификаторов иммунного ответа
Гены цитокинов и
воспалительный ответ
характер воспалительного ответа зависит от
индивидуального
ансамбля
высокои
низкопродуцируюших вариантов генов про- и
противовоспалительных цитокинов
характер воспалительного ответа может
значительно
различаться
между
индивидуумами
с
полярными
("провоспалительным"
и
"противовоспалительным") генотипами.
поляризация
воспалительного
ответа
ответственна за выраженную дисрегуляцию
воспаления и протекание воспалительного
ответа - остроту, хронизацию, уровень
лихорадки и др.
Гены цитокинов и
воспалительный ответ
для пациентов с "противовоспалительным" генотипом
иммунокоррекция проводится путем введения аналогов
провоспалительных цитокинов или блокирование продукции
противовоспалительных цитокинов
для лиц с "провоспалительным" генотипом – данные
мероприятия могут сопровождаться выраженным побочным
эффектом;
Выявление ассоциации той или иной патологии с
определенным генотипом может дать возможность для
создания базы данных позволяющей сделать долгосрочный
индивидуальный прогноз для конкретного лица и провести
необходимые
терапевтические
мероприятия
для
предотвращения развития заболевания или снижения
тяжести его протекания.
А.Ю. Громова, А.С. Симбирцев. Цитокины и воспаление. 2005.
Т. 4, № 2. С. 3-12.
Гены семейства интерлейкина 1
и воспаление
Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков семейства
IL-1 играет одну из ключевых ролей в развитии, регуляции и исходе воспалительного
процесса
Чаще встречающийся аллель гена IL1RN*1 содержит четыре тандемных
повтора по 86 п.о. (VNTR - variable number tandem repeat), наиболее значимым
из мутантных вариантов является аллель IL1RN*2
Носительство аллеля IL1RN*2 связано с повышенным уровнем
циркулирующего IL-1Ra и уровнем экспрессии мРНК в ходе воспаления
Выявлен ряд точечных маркеров высокопродуцирующего варианта гена IL1B,
наследуемых чаще сцепленно (+3953, -3737, -1469, -999)
У лиц, гомо- или гетерозиготных по высокопродуцирующему аллелю
IL1B(+3953)CRT, продуцируется, соответственно, в 4 и 2 раза большее
количество этого цитокина, чем у лиц, гомозиготных по не мутантному
варианту этого гена (IL1B*1)
Присутствие в геноме полярных сочетаний (знак "+" - вариант гена присутствует,
знак "-" - отсутствует) IL1B(+3953)+/IL1RN*2-, IL1B(+3953)-/IL1RN*2+ и сочетанного
носительства IL1B(+3953)+/IL1RN*2+ может оказывать существенное влияние на
соотношение экспрессии и продукции этих белков и являться одной из главных
причин дисрегуляции воспалительного ответа
ИФН-γ занимает особое место среди провоспалительных
цитокинов
Принимает активное участие в запуске реакций ранней
фазы воспаления и антивирусной защите, повышая
функциональную активность Т-лимфоцитов, NK-клеток,
эффекторных макрофагов, а также, обеспечивая
эффективность презентации антигенов и распознавание их
Т-лимфоцитами [Федосеев Г.Б., 1998].
Установлено, что проявление аллеля С в генотипе
полиморфизма Т-1488С в гена IFN-y ассоциировано с
повышением экспрессии гена ИФН-γ. [Ожегова Д.С., 2009].
Данные о влиянии полиморфизма Т-1488С в гене IFN-y на
течение муковисцидоза у детей отсутствуют.
Характеристика изученных
полиморфных маркеров генов цитокинов
Ген
MIM
Хромосо
мная
локализация
Локализ
а-ция в
гене
Полиморфизм
Название белка
Фермент
рестрикции
IL1B
147720
2q14
Экзон 5
+3953 А1/А2
Интерлейкин -1
Taq I
Провоспалительный
ответ, стимуляция
клеточного звена
иммунитета
IL1RN
147679
2q14.2
Интрон 2
VNTR
Антагонист
рецептора к
интерлейкину 1
-
Взаимодействие с
рецептором к IL1 и
ингибирование
провоспалительного
ответа
IL4
147780
5q31.1
3′′-UTR
G717C
Интерлейкин - 4
VneI
Гуморальный
иммунный ответ
IL4RA
147781
16р12.1р11.2
Экзон 3
I50V
Рецептор к
интерлейкину – 4
RsaI
Взаимодействие с IL4,
влияние на
гуморальный ответ
T-1488C
Интерферон
IFN-у
12q24.1.
Роль в иммунном
ответе
Стимулирует
продукцию TNF, IL-1,
6; экспрессию на
мембранах
макрофагов,
антигенов МНС II
Цель:
Исследовать ассоциацию генов модификаторов иммунного
ответа : интерлейкина 1 (IL1β – +3953 А1/А2), антагониста
рецептора интерлейкина 1 (IL1Rа – VNTR), интерлейкина 4 (IL4
– 3′-UTR G/C), рецептора интерлейкина 4 (IL4 RA – I50V),
интерферона –γ (IFNγ - Т1488С )
с муковисцидозом и его клиническими проявлениями,
влияние на варьирование патогенетически значимых признаков
(цитокины, их рецепторы и антагонисты, функциональное
состояние моноцитов-макрофагов крови)
Дизайн :
Случай (n=82) – Контроль, популяционный (n=117)
Пациенты Томской области, Астраханской области и дети, получавшие
лечение в отделении медицинской генетики РДКБ
Гены (полиморфизмы)
интерлейкина 1
(IL1β – +3953 А1/А2),
антагониста рецептора интерлейкина 1
(IL1Rа – VNTR),
интерлейкина 4
(IL4 – 3′-UTR G/C),
рецептора интерлейкина 4
(IL4 RA – I50V),
интерферона γ
(IFN-γ -Т1488С )
Фенотип
Муковисцидоз (n=82)
•F 508del
•Легочная форма
•Кишечная форма
•Смешанная форма
•Хроническая
синегнойная
и
стафилококковая
инфекции
•Цирроз печени
•Бронхоэктазы
•ХЛС
•
Методы исследования
Иммунологические:
Определение содержания
IL-1β
β, IL-4, TNF-α
α, INF-y в
сыворотке крови (метод
иммуноферментного анализа,
реактивы фирмы ООО
«Протеиновый контур», СПетербург) и
противовоспалительных
цитокинов : IL-10 и
антогонист рецептора IL1Rа в
сыворотке крови и
супернатанте культуры МнМф –наборами фирмы Вектор
(Новосибирск)
ЦНИЛ СИБГМУ
ЦНИЛ АГМА
Молекулярногенетические :
Генотипирование
полиморфных
маркеров изучаемых
генов проводили с
помощью ПЦР и
ПДРФ
НИИ медицинской
генетики СО РАМН
Методы статистической
обработки
Тестирование на соответствие распределения генотипов равновесию ХардиВайнберга (РХВ) с помощью критерия χ2
Сравнение частот аллелей между группами точным тестом
Фишера с расчетом отношения шансов (ОR)
OR= (А/Б) / (А1/А2)
где А и А1 соответственно частоты встречаемости нормального
аллеля у больных и здоровых лиц,
Б и Б1 – частоты мутантного аллеля у больных и здоровых
соответственно
Для количественных показателей рассчитывали медиану (Ме)
и 1,3 квартили (Q1 и Q3).
Для сравнения значений показателей в двух группах был
использован метод непараметрической статистики – критерий
Манна - Уитни.
Характеристика обследованных
больных с муковисцидозом
Всего 82 пробанда с муковисцидозом
Средний возраст детей (лет):
11,2 ± 4,58 ( 0,2-18,0)
Средний возраст постановки диагноза (лет)
3,8 ± 3,2 (0,1-15,0)
До года диагноз установлен – 4-м пациентам
Из них 2-ое выявлены по неонатальному
скринингу
Манифестация заболевания у этих пациентов: 1мекониальный илеус, 3 – о. пневмония.
Характеристика обследованных детей
Распределение по полу и по возрасту
100
90
43,1%
(37)
56,9%
(45)
80
мальчики
девочки
70
30,5%
15-18 лет
3-15 лет
до 3-х лет
60
50
40
30
61%
20
10
0
8,5%
Характеристика обследованных детей
Форма болезни , тяжесть течения
Легочная
Кишечная
Смешанная
100
8%
2%
90
80
70
легочная
кишечная
смешанная
90%
60
50
40
30
20
10
0
1
Среднетяжелая
Тяжелая
0
Легкая
Микрофлора мокроты
микрофлора мокроты
42,86%
41,27%
45,00%
40,00%
35,00%
26,98%
Ps. aeruginosa
30,00%
St. Aureus
25,00%
B.cepacia
20,00%
Al. xylosoxidans
15,00%
H. influenzae
10,00%
3,20%
5,00%
0,00%
1
4,81%
Осложнения заболевания
осложнения у больных МВ
60,00%
49,80%
хроническое легочноуе сердце
50,00%
поллипоз носа
кров охарканье
40,00%
ателектазы
31,74%
пнев моторакс
30,00%
цирроз печени
сахарный диабет
20,00%
17,46%
остеопороз
СДИ О
9,52%
10,00%
3,21%
6,40%
4,81%
1,61%
0,00%
1
поликистоз легкого
4,81%
1,60%
Варианты выявленных мутации в гене
МВТP у обследованных больных МВ
Мутации
F 508 del (гомозиг.)
F508/-
Количество случаев
(n-82)
19
36 (44%)
17
N1303K
2
3944delTG
3849+10кbC-T
1
1
CFNRdele2,3(21кв)
G551D/W1282X
7
1
R334W
2184insA
1
1
неидентифицировано
32
(9%)
Сравнительная характеристика провоспалительных и
противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и
супернатанте моноцитов-макрофагов при муковисцидозе
( контроль – 100%)
400
IL-4
350
300
IL-4
IL-4
IL-10
IL-10
250
200
IL-1
TNF
150
Контрольные
значения
TNF
TNF
100
50
IL-10
INF-Y
INF-Y
IL-1
IL-1 RA
IL-1 RA
IL-1
INF-Y
IL-1 RA
0
сыворот ка
спонт анная
cт имул ированная
Содержание интерлейкина IL- 1β в сыворотке крови и
супернатанте культуры Мн-Мф у детей с муковисцидозом в
зависимости от формирующегося цирроза печени
нг /мл
120
100
80
60
40
20
0
p=0,04
формирующийся
цирроз
сыворот ка
спонт анная
отсутствие
цирроза
cт имул ированная
Содержание интерлейкина IL- 1β в сыворотке крови и
супернатанте культуры Мн-Мф у детей с муковисцидозом в
зависимости от наличия бронхоэктазов
нг /мл
140
120
100
80
60
40
p=0,04
20
0
бронхоэктазы
сыворот ка
спонт анная
отсутствие
бронхоэктазов
cт имул ированная
Сравнительный анализ распределения частот аллелей
полиморфизмов генов в группе контроля и больных
муковисцидозом
P
Частота аллеля
контроль
ОR
больные
VNTR полиморфизм гена IL1RN*
A1=0,826
A1=0,732
0,03
1,73 (1,05<OR<2,86)
+ 3953 A1/A2 гена IL1В
A2=0,026
A2=0,255
0,231
1,37 (0,84<OR<2,24)
G/C 3’-UTR полиморфизм гена IL4
C=0,256
C=0,261
0,993
1,03 (0,65<OR<1,64)
Полиморфизм 150V гена IL4RA
I=0,590
I=0,625
0,536
0,86 (0,57<OR<1,51)
Полиморфизм T-1488C гена IFN γ *
С=0,360
С=0,500
0,018
1,77 (1,10<OR<2,87)
Роль аллелей генов семейства IL-1 при
различной патологии
Заболевание
Аллель
Роль при развитии патологии
Источник
Хронический
гнойный
риносинусит
IL1RN*2
IL1В(+ 3953)
\ IL1RN*2
Ассоциирован с заболеванием
Гаплотип ассоциирован с заболеванием
Громова А.Ю. и
соавт., 2005
Сепсис
IL1RN*2
Ассоциирован с заболеванием
Fang X.M. et al, 1999
Хронический
гепатит
IL1RN*2
Ассоциирован с циррозом печени и
иммунологически опосредованным
поражением печени
Bahr M.J. et al, 2003
Фактор риска
Langdahl B.L. et al,
2000
Остеопороз
IL1RN*2
Zhang P.A. et al,
2004
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных
маркеров генов у больных МВ с ХЛС и МВ без ХЛС.
Получена ассоциация МВ+ХЛС с полиморфизмом VNTR
гена IL1RN
%
70
60
50
P=0,012
*
40
МВ+ХЛС
30
20
МВ без ХЛС
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Cравнение частот аллелей А1А1 + А1А2 – OR= 0,9 (0,01<OR<0,86) ; p=0,030
Сравнение генотипа A1A2 против остальных генотипов –
OR= 0,69(0,30<OR<1,56)
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных
маркеров генов у больных МВ с ХЛС и МВ без ХЛС.
Ассоциация МВ+ХЛС с полиморфизмом I50V гена
IL4Ra
60
%
50
40
МВ+ХЛС
30
20
МВ без ХЛС
10
0
ii
iv
vv
Cравнение частот аллелей I– V , p= 0,054;
II - VV+IV – OR= 0,32 (0,11<OR<0,94); p= 0,037
Сравнение генотипа IV против остальных генотипов –
OR= 0,50(0,25<OR<1,01)
Уровень цитокинов в общей группе больных МВ в
зависимости от генотипов
гена IL-4Ra I50V, Me (Q1-Q3)
Box & Whisker Plot
р1-2=0,027
Box & Whisker Plot
1600
65
1400
60
1200
55
1000
50
800
iv
45
ii
600
40
400
35
Средний = 45,19
25%-75%
= (29,81, 57,18)
Min-Max
= (28,64, 60,26)
30
25
Var4
200
Средний = 92,53
25%-75%
= (49,42, 142,4)
Min-Max
= (28,07, 1407)
0
-200
Var10
Уровень ФНО–α выше при генотипе iv гена IL4RA
Показатели ОФВ1 у детей с различными
генотипами по полиморфизму T-1488C
гена ИФН –γ
низкие значения (менее 50%)
умеренное снижение (50-70%)
легкое снижение (70-80%)
нормальные показатели (больше 80%)
11,1
Т/Т
Т/С,С/С
3,7
0%
44,4
26,8
7,4
37,1
46,1
25%
50%
23,4
75%
100%
н г /м л
Ассоциация полиморфизма T-1488C гена
ИФН –γ с уровнем ИФН –γ в сыворотке крови
2400
2200
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-200
т/т
генотипы
т/с
с/с
Медиана
25%-75%
Мин-Макс
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных маркеров
генов
у больных с МВ + синегнойная инфекция и МВ без синегнойной
инфекции
Ассоциация МВ+синегнойная инфекция с полиморфизмом
Т1488С гена INF-γ
P=0,03
80
P=0,02
*
70
60
МВ+Ps.aur.
50
40
30
МВ без Ps.aur.
20
10
0
с
t
cc+tc
Cравнение частот аллелей C- Т, p= 0,02;
СС+ТС – ТТ , OR= 0,34 (0,12<OR<0,94); p= 0,036
Ассоциация мутации T-1488C гена
ИФН –γ с высевом Burkholderia cepacia
с в ысев ом Burkholderia cepacia (р=0,1)
35,10%
Т/Т
15,40%
Т/С,С/С
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
с высевом Burkholderia cepacia (р=0,1)
40,00%
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных маркеров генов
у больных с МВ + синегнойная инфекция и МВ без синегнойной
инфекции.
Ассоциация МВ+синегнойная инфекция с полиморфизмом VNTR гена
IL1RN
%
70
60
P=0,05
50
*
МВ+Ps.aur.
40
30
20
МВ без Ps.aur.
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Сравнение генотипа A1A2 против остальных генотипов – OR=
0,65 (0,31<OR<1,37);p=0,05
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных маркеров генов
у больных с МВ + цирроз печени и МВ без цирроза печени
Аccоциация МВ+цирроз печени с полиморфизмом VNTR гена IL1RN
P=0,001
80
*
70
60
МВ+цирроз
50
40
30
МВ без цирроза
20
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Cравнение частот аллелей А1 - А2 , p= 0,001
A1A1 +A1A2 – A2A2 - OR= 7,6 (1,44<OR<44,74), p=0,01
Сравнение генотипа A1A2 против остальных генотипов –
OR= 11,52 (4,65<OR<29,11); p=0,001
Ассоциация полиморфизма T-1488C гена ИФН
–γ с поражением печени у больных МВ
65,4
70
60
53,8
50
38,5
40
30
32,4
27
16,2
20
10
0
частота цироза (р=0,003)
генотип Т/С,С/С
генотип Т/Т
частота ДЖВП
общая частота поражения
гепатобилиарной системы
(р=0,03)
Уровень цитокинов в общей группе больных МВ
в зависимости от генотипов
гена INF -γ (Т1488С) , Me (Q1-Q3)
р1-2=0,042
Box & Whisker Plot
Box & Whisker Plot
1800
600
1600
500
1400
1200
400
1000
300
cc
200
800
ct
600
400
100
200
Средний = 7,231
25%-75%
= (3,796, 11,744)
Min-Max
= (2,619, 542,5)
0
-100
Var1
Средний = 61,06
25%-75%
= (9,636, 1131)
Min-Max
= (3,435, 1726)
0
-200
Var7
Уровень IL-1β выше при генотипе сt гена INF-γ
Возможные механизмы формирования
цирроза печени при муковисцидозе
Определенную роль в формировании цирроза печени играют
иммунологические нарушения, обусловленные
провоспалительными цитокинами [Яковенко А.В].
Российскими и зарубежными исследователями установлены
корреляционные взаимосвязи между уровнями TNF-α, INF-γ и
содержанием цитолитических ферментов, морфологическими
изменениями печени [Мажитов А.И.2008].
Помимо этого, доказана, с одной стороны, способность INF-γ
оказывать прямое цитотоксическое действие на гепатоциты [Xu Y.
et al., 1998]
INF-γ в синергизме с ФНО-α активирует звездчатые клетки
печени, увеличивает количество рецепторов к цитокинам,
стимулирующим пролиферацию, что приводит к усилению
фибропластической активности и новообразованию коллагеновых
волокон [Маколкин В.И., Овчаренко С.И., 1999].
Выводы
Для больных с муковисцидозом характерен
«провоспалительный» генотип: повышение в
сыворотке крови провоспалительных цитокинов
(ФНО-α,
IL-1β,)
на
фоне
снижения
противовоспалительных
цитокинов
IL-10
и
антагониста рецептора IL-1.
Моноциты - макрофаги культуры ткани при
стимуляции
ЛПС
комплексом
достоверно
увеличивают синтез IL- 4, чем могут способствовать
формированию гиперреактивности бронхов.
Получена ассоциация VNTR полиморфизма гена
IL1RN с развитием муковисцидоза – ОR= 1,73
(1,05<OR<2,86) (р=0,03) и Т1488С полиморфизма
гена IFNγ – ОR= 1,77 (1,10<OR<2,87) (p= 0,018 )
Выводы
Получена ассоциация полиморфизмома VNTR гена IL1RN
генотип A1A2 OR= 0,69(0,30<OR<1,56); полиморфизма 150V
гена IL4RA аллель I OR=0,32(0,11<OR<0,94), (p=0,03) с
развитием хронического легочного сердца при МВ.
Получена ассоциация с полиморфизмом VNTR гена IL1RN,
генотипА1А2 OR=0,65(0,31<OR<1,37), (p=0,05);
полиморфизмом Т1488С гена INF-γ аллель C
OR=0,45(0,22<OR<0,89), (p=0,02) и наличием синегнойной
инфекции при МВ.
Получена аccоциация с полиморфизмом VNTR гена IL1RN
генотип A1A2 – OR=11,52 (4,65<OR<29,11), (p=0,001) и
развитием цирроза печени при МВ.
Обоснование вакцинации
больных МВ
Установлена корреляционная зависимость
между тяжестью течения бронхолегочного
процесса у больных муковисцидозом и
частотой вирусных и бактериальных инфекций
внелегочной локализации
Пневмокооковая инфекция является триггером
воспалительного процесса в бронхолегочной
системе больных МВ
Особенности воспаления при МВ
(провоспалительный характер цитокинового
профиля, снижение ИФН –γ и др.)
Этиологическая роль Streptococcus
pneumoniae в развитии респираторных
инфекций
ОРЗ до 30 %
Отиты 28 – 60 %
Синуситы до 40 %
Бронхиты 16,5 – 25,5 %
Внебольничные пневмонии 35 – 76 %
Рост антибиотикоустойчивых штаммов Streptococcus pneumoniae:
резистентность к пенициллинам до 50 %, к макролидам – 35 %,
к тетрациклину – 25 %, к сульфаниламидам – 38%.
23 марта 2007 г.
Рекомендации ВОЗ:
ВОЗ:
«Признавая высокую значимость заболеваний, вызываемых
пневмококками у маленьких детей, и безопасность и
эффективность PCV-7 в данной возрастной группе, ВОЗ
полагает, что необходимо включать данную вакцину в
национальные иммунизационные программы, особенно в тех
странах, где смертность среди детей младше 5 лет составляет
>50/1000, или где >50 000 детей умирают ежегодно».
WHO Weekly Epidemiological Record, 23 March 2007, No.12, 2007, 82, 93-104, www.who.int/wer
1. Инструкция по применению Превенара. Регистрационный номер ЛСР000556/09 от 29.01.2009
2. Письмо №01/8774-9-32 от 23.06.2009 «О направлении временного
руководства CDC по применению 23-валентной пневмококковой вакцины
во время вспышки гриппа А (H1N1)»:
«Вакцина PCV7 рекомендована всем детям младше 5 лет, при этом
привитой контингент среди детей в возрасте от 19 до 35 месяцев с 3 или
более дозами вакцины PCV7 в настоящий момент составляет более 90%.
Поддержание привитого контингента на таком высоком уровне позволяет
не использовать вакцину PCV7 для детей старше 5 лет.»
Костинов М. П. , 2009
2
мес
I
4,5
мес
7
мес
7 – 11
мес
1215
мес
18
мес
24
мес
II
III
IV
Костинов М. П. , 2009
2–5
лет
На дороге к успеху:
никто кроме Вас не знает
как достичь успеха
никто не сделает эту
работу
за нас