ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРОЦЕСС ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ
ПРОЦЕСС ПРИ
МУКОВИСЦИДОЗЕ – НОВЫЕ
ДАННЫЕ
Сергиенко Д.Ф., Кондратьева Е.И.,
Янкина Г.Н.
Астрахань – Краснодар -Томск
актуальность
Изучение причинно-следственных взаимоотношений при поражениях у
больных МВ выявило приоритетное значение нарушения цитокиновой
регуляции в формировании и прогрессировании воспаления.
Цитокиновая регуляторная сеть привлекает к себе особое внимание, так
как она обеспечивает взаимодействие иммунокомпетентных и других
клеток организма, опосредованное секретируемыми ими продуктами молекулами цитокинов.
Учитывая иммунный генез полиорганного поражения при
МВ, дальнейшие перспективы изучения связаны с
переводом исследований на молекулярно-генетический
уровень, поиском прямых предшественников белков каскада
комплемента, цитокиновых молекул и их рецепторов на
разных уровнях развития врожденного и приобретенного
иммунитета.
Гены цитокинов и
воспалительный ответ
характер воспалительного ответа зависит от
индивидуального
ансамбля
высокои
низкопродуцируюших вариантов генов про- и
противовоспалительных цитокинов
характер воспалительного ответа может
значительно
различаться
между
индивидуумами
с
полярными
("провоспалительным"
и
"противовоспалительным") генотипами.
поляризация
воспалительного
ответа
ответственна за выраженную дисрегуляцию
воспаления и протекание воспалительного
ответа - остроту, хронизацию, уровень
лихорадки и др.
Гены цитокинов и
воспалительный ответ
для пациентов с "противовоспалительным" генотипом
иммунокоррекция проводится путем введения аналогов
провоспалительных цитокинов или блокирование продукции
противовоспалительных цитокинов
для лиц с "провоспалительным" генотипом – данные
мероприятия могут сопровождаться выраженным побочным
эффектом;
Выявление
ассоциации той или иной патологии с
определенным генотипом может дать возможность для
создания базы данных позволяющей сделать долгосрочный
индивидуальный прогноз для конкретного лица и провести
необходимые
терапевтические
мероприятия
для
предотвращения развития заболевания или снижения
тяжести его протекания.
А.Ю. Громова, А.С. Симбирцев. Цитокины и воспаление. 2005.
Т. 4, № 2. С. 3-12.
Роль аллелей генов семейства IL-1 при различной
патологии
Заболевание
Аллель
Роль при развитии патологии
Источник
Хронический
гнойный
риносинусит
IL1RN*2
IL1В(+ 3953) \
IL1RN*2
Ассоциирован с заболеванием
Гаплотип ассоциирован с заболеванием
Громова А.Ю. и соавт.,
2005
Сепсис
IL1RN*2
Ассоциирован с заболеванием
Fang X.M. et al, 1999
Хронический
гепатит
IL1RN*2
Ассоциирован с циррозом печени и
иммунологически опосредованным поражением
печени
Bahr M.J. et al, 2003
Фактор риска
Langdahl B.L. et al, 2000
Остеопороз
IL1RN*2
Zhang P.A. et al, 2004
Роль аллелей генов семейства ИЛ-4, ИФН–у при
различной патологии
Заболевание
Аллель
Роль при развитии патологии
Источник
Бронхиальная
астма
ИЛ-4Ra (I50V),
ИЛ-4 (G717C)
Ассоциирован с заболеванием, влияет на тяжесть
аллергического воспаления
Фрейдин М.Б,
Брагина Е.Ю.2001,2006
Mitsuyasu, H. 1999
герпесвирусная
инфекция
Т1488С ИФН-у
Ассоциирован с тяжелым течением заболевания
Фрейдин, М.Б. 2006.
Сахарный диабет
Т1488С ИФН-у
Ассоциирован с иммунологически опосредованным
поражением поджелудочной железы
Ожегова Д.С.2009
Сальмонелез,
Туберкулез
Т1488С ИФН-у
Влияние на тяжесть заболевания
Ожегова Д.С. 2009
Характеристика изученных
полиморфных маркеров генов цитокинов
Ген
MIM
Хромосо
мная
локализация
Локализ
а-ция в
гене
Полиморфизм
Название белка
Фермент
рестрикции
IL1B
147720
2q14
Экзон 5
+3953 А1/А2
Интерлейкин -1
Taq I
Провоспалительный
ответ, стимуляция
клеточного звена
иммунитета
IL1RN
147679
2q14.2
Интрон 2
VNTR
Антагонист
рецептора к
интерлейкину 1
-
Взаимодействие с
рецептором к IL1 и
ингибирование
провоспалительного
ответа
IL4
147780
5q31.1
3′′-UTR
G717C
Интерлейкин - 4
VneI
Гуморальный
иммунный ответ
IL4RA
147781
16р12.1р11.2
Экзон 3
I50V
Рецептор к
интерлейкину – 4
RsaI
Взаимодействие с IL4,
влияние на
гуморальный ответ
T-1488C
Интерферон
IFN-у
12q24.1.
Роль в иммунном
ответе
Стимулирует продукцию
TNF, IL-1, 6; экспрессию
на мембранах макрофагов,
антигенов МНС II
Цель:
Проанализировать частоты
полиморфизмов в генах иммунного
ответа : интерлейкина 1 (IL1β –
+3953 А1/А2), антагониста
рецептора интерлейкина 1 (IL1Rа –
VNTR), интерлейкина 4 (IL4 – 3′-UTR
G/C), рецептора интерлейкина 4 (IL4
RA – I50V), интерферона –γ (IFNγ Т1488С )среди больных
муковисцидозом и здоровых индивидов.
Изучить ассоциации полиморфизмов в
указанных генах с течением
бронхолегочного процесса и с
характером поражения системы
пищеварения у больных
муковисцидозом, а также влияние на
экспрессию кодируемых цитокинов
Дизайн :
Случай (n=82) – Контроль, популяционный (n=91)
Основная
группа (больные муковисцидозом) проходили лечение в отделении
медицинской генетики Государственного Учреждения Российской детской
клинической больницы Росздрава, пульмонологических стационарах г.Томска, г.
Астрахани
Контрольная группа для проведения генетических
исследований составлена из 91 здорового русского
жителя г. Томска. От всех индивидов было получено
информированное согласие на участие в медикоэпидемиологическом исследовании.
Методы исследования
Все пациенты были обследованы в соответствии со стандартами
высокотехнологичной медицинской помощи Минздравсоцразвития
России для данной категории больных.
Иммунологический блок обследования:
ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, показатели интерферонового статуса
(ИФН-γ и ИФН-α) в сыворотке крови и в мокроте (метод
иммуноферментного анализа, реактивы фирмы ООО «Цитокин»,
С-Петербург, «ВСМ Diagnostics» (США).
Генетический блок обследования: генотипирование полиморфных
маркеров гена и ИЛ-4, ИФН-γ , ИЛ 1в.Генотипирование изучаемых
генов осуществляли с помощью ПЦР и ПДРФ-анализа.
Методы статистической обработки
Тестирование на соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга (РХВ)
с помощью критерия χ2
Сравнение частот аллелей между группами точным тестом Фишера с
расчетом отношения шансов (ОR)
OR= (А/Б) / (А1/А2)
где А и А1 соответственно частоты встречаемости нормального аллеля у
больных и здоровых лиц,
Б и Б1 – частоты мутантного аллеля у больных и здоровых соответственно
Для количественных показателей рассчитывали медиану (Ме) и 1,3
квартили (Q1 и Q3).
Для сравнения значений показателей в двух группах был использован
метод непараметрической статистики – критерий Манна - Уитни.
Характеристика обследованных
больных
♂ 52,38% ♀47,62%
Средний возраст 10,19±0,40 (от 0,2 до 18 лет);
Средний возраст манифестации кишечного синдрома
0,19±0,081 (от 0 до 6) года Средний возраст
манифестации легочного синдрома 0,33±0,11 (0 до
10) Средний возраст постановки диагноза 3,14±0,25
года (0,1- 14 лет)
Смешанная форма заболевания у 97,3 % больных
Средний МРИ 91,53±4,56% от д. (от 63 до 134)
Средние показатели ФЖЕЛ 75,36 ±4,47% от д.
Средние показатели ОФВ1 70,23 ±3,18% от д.
Микробиологический пейзаж
мокроты
42,86%
41,27%
45%
40%
35%
26,98%
Ps. aeruginosa
30%
St. Aureus
25%
B.cepacia
20%
Al. xylosoxidans
15%
H. influenzae
3,20%
10%
5%
0%
1
4,81%
Осложнения
60,00%
хроническое легочноуе сердце
49,80%
50,00%
поллипоз носа
кровохарканье
40,00%
31,74%
30,00%
20,00%
ателектазы
пневмоторакс
цирроз печени
сахарный диабет
17,46%
остеопороз
10,00%
3,21%4,81%
1,61%
0,00%
1
9,52%
6,40%
4,81%
1,60%
СДИО
поликистоз легкого
Фенотип
Муковисцидоз (n=82)
пол
возраст
терапия
время манифестации кишечного и респираторного синдромов
Время постановки диагноза
Хроническая синегнойная, сепационная и стафилококковая инфекции
•
Цирроз печени
•
СДИО
•
МИ
•
Показатели ФВД
•
ХЛС
•
МРИ
Уровень цитокинов в сыворотке крови у больных
МВ с зависимости от степени тяжести (Ме)
Уровень цитокинов в мокроте у больных МВ с
зависимости от степени тяжести (Ме)
1200
1012,8
1000
800
587,4
600
387,8
400
200
324,8
264,1
132,9
78,6
36,4
206,6
158,9
104,6
67,1
202,8
54,275,6
84,6
23,936,9
0
ИЛ-1β
ИЛ-6
ИЛ-8
легкая
средняя
ИФНγ
тяжелая
ИЛ-4
ИЛ-10
Содержание интерлейкина IL- 1β в сыворотке крови и
супернатанте культуры Мн-Мф у детей с муковисцидозом в
зависимости от формирующегося цирроза печени
нг /мл
120
100
80
60
40
20
0
p=0,04
формирующийся
цирроз
сыворот ка
спонт анная
отсутствие
цирроза
cт имул ированная
Содержание интерлейкина IL- 1β в сыворотке крови и
супернатанте культуры Мн-Мф у детей с муковисцидозом в
зависимости от наличия бронхоэктазов
нг /мл
140
120
100
80
60
40
p=0,04
20
0
бронхоэктазы
сыворот ка
спонт анная
отсутствие
бронхоэктазов
cт имул ированная
Выраженные изменения индуцированного
цитокинового каскада и последующей
дисиммунорегуляцией могут быть
обусловлены как влиянием гена CFTR, так и
влиянием генов –модификаторов иммунного
ответа
Сравнительный анализ распределения частот аллелей
полиморфизмов генов в группе контроля и больных
муковисцидозом
Частота аллеля
контроль
ОR
P
больные
VNTR полиморфизм гена IL1RN*
A1=0,826
A1=0,732
0,03
1,73 (1,05<OR<2,86)
+ 3953 A1/A2 гена IL1В
A2=0,026
A2=0,255
0,231
1,37 (0,84<OR<2,24)
G/C 3’-UTR полиморфизм гена IL4
C=0,256
C=0,261
0,993
1,03 (0,65<OR<1,64)
Полиморфизм 150V гена IL4RA
I=0,590
I=0,625
0,536
0,86 (0,57<OR<1,51)
Полиморфизм T-1488C гена IFN γ *
С=0,360
С=0,500
0,018
1,77 (1,10<OR<2,87)
Показатели ФЖЕЛ и ОФВ1 у детей с различными генотипами по
полиморфизму T1488C гена ИФН –γ
низкие значения (ниже 50%)
умеренное снижение (50-70%)
легкое снижение (70-80%)
условная норма (выше 80%)
11,1
Т/Т
Т/С,С/С
3,7
33,4
23,4
0%
Т/Т
Т/С,С/С
25%
3,7
48,1
42,5
30,4
50%
44,4
11,1
0%
7,4
26,8
75%
7,4
37,1
46,1
25%
50%
100%
23,4
75%
100%
Достоверность различий между генотипами: ФЖЕЛ (р=0,03), ОФВ1 (0,01)
Ассоциация мутации T-1488C гена ИФН –γ с
характером инфекционного агента в бронхиальном
дереве
29,2%
рр<0,05
P.aeroginosa
P.aeroginosa
54,1%
42,3%
S.aureus
S.aureus
35,1%
р<0,05
В.серасia
В.серасia
0%
0%
10%
15,4%
38,7%
20%
ТС,СС
30%
40%
50%
60%
ТТ
сравнение частот генотипов при синегнойной инфекции; ТС/СС- ТТ: OR= 0,34 (p= 0,036);
при сепационной инфекции ТС/СС - ТТ: OR= 0,3(p= 0,048)).
Ассоциация полиморфизма T-1488C гена
ИФН –γ с уровнем ИФН –γ в сыворотке крови
400
350
300
250
200
150
пг/мл
100
50
0
т/т
т/с
с/с
генотипы
Достоверность показателей между генотипами р=0,01
Медиана
25%-75%
Мин-Макс
Ассоциация полиморфизма T-1488C гена ИФН –γ
с поражением ЖКТ у больных МВ
ТС/СС -ТТ– OR= 6,96 p= 0,003
60%
Р=0,003
53,80%
50%
40%
30%
20%
16,20%
10%
0%
ТТ
ТС,СС
Полученный нами результат
закономерно соотносится с ролью
ИФН-γ, который с одной стороны
способен оказывать прямое
цитотоксическое действие на
гепатоциты [Мажитов А.И.2008,
.Яковенко Я.В. ] и повышать
содержание цитолитических
ферментов [Xu
Y. et –al.,
1998]
С другой
увеличивать
количество и стимулировать
пролиферацию звездчатых клеток печени, что в конечном итоге,
приводит к усилению фибропластической активности и
новообразованию коллагеновых волокон [Маколкин В.И.,
Овчаренко С.И., 1999 ]. В тоже время повышение синтеза NO,
обусловленное высокими титрами ИФН-γ,способствует развитию
портальной гипертензии .
Средние значения и показателей функции внешнего
дыхания (ФЖЕЛ и ОФВ1) у больных с различными
генотипами по мутации 3’-UTR G/C гена ИЛ-4.
GG;
90
80
GC/CC
70
70,7
% от должного
60
GG;
83,1
GC/CC;
76,3
66,6
Р=0,11
Р=0.016
50
40
30
20
10
0
Ф ЖЕЛ
ОФ В 1
GC/CC
GG
Средние значения ФЖЕЛ и ЖЕЛ у больных МВ
с разными генотипами по гену Ил-4 в зависимости
от возраста
ОФВ1
G/C, С/С
G /G
Критерий МаннаУитни
5-11 лет
61,2±12,5
88,8±6,12
p=0,09
12-18 лет
57,3±2,3
71,8±6,70
р=0,01
ФЖЕЛ
G/C, С/С
G /G
5-11 лет
71,5±9,4
90,6±4,7
p=0,10
12-18 лет
63,1±4,7
78,5±6,51
р=0,046
Ассоциация полиморфизма I50V гена ИЛ-4Ra с
показателями ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ1) у больных
МВ
79,6
80
73,3
65,3
64,1
70
60
% от должного
50
40
30
20
10
0
Ф ЖЕЛ
ОФ В 1
IV/VV
Р1=0,038 ;
II
р2=0,018
.
Нарушение функции внешнего дыхания у больных с полиморфизмом I50V
обусловлены увеличением активности субъединицы α рецептора ИЛ-4,
повышением активации STAT-6 - внутриклеточного активатора
транскрипции генов ИЛ-4 и тяжелых цепей иммуноглобулинов
Избыточная активность ИЛ-4
ответа, выраженная активация
гуморального механизма,
синтезу иммуноглобулинов
различных классов в том числе
и IgЕ, которые в свою очередь
способствуют повышению
гиперреактивности бронхов,
выраженности обструктивного.
синдрома
снижении ОФВ1
Избыточное количество АТ,
секретируемое в следствии
стимуляции В- лимфоцитов
приводит к нарастанию ЦИКов,
в результате повреждающего
действия которых происходит
нарушение целостности
морфологических структур
органа с формированию
бронхоэктазов
снижении ФЖЕЛ.
Ассоциация МВ+ХЛС с полиморфизмом I50V
гена IL4Ra
сравнение частот аллелей I– V , p= 0,054; II - VV+IV p= 0,037
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных маркеров генов
у больных с МВ + синегнойная инфекция и МВ без синегнойной инфекции.
Ассоциация МВ+синегнойная инфекция с полиморфизмом VNTR гена
IL1RN
%
70
P=0,05
60
*
50
МВ+Ps.aur.
40
30
20
МВ без Ps.aur.
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Сравнение генотипа A1A2 против остальных генотипов – OR=
0,65 (0,31<OR<1,37);p=0,05
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных
маркеров генов у больных МВ с ХЛС и МВ без ХЛС.
Получена ассоциация МВ+ХЛС с полиморфизмом VNTR гена
IL1RN
%
70
60
50
P=0,012
*
40
МВ+ХЛС
30
20
МВ без ХЛС
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Cравнение частот аллелей А1А1 + А1А2 – OR= 0,9 (0,01<OR<0,86) ; p=0,030
Сравнение генотипа A1A2 против остальных генотипов –
OR= 0,69(0,30<OR<1,56)
Анализ «случай – контроль» изучаемых полиморфных маркеров генов
у больных с МВ + цирроз печени и МВ без цирроза печени
Аccоциация МВ+цирроз печени с полиморфизмом VNTR гена IL1RN
P=0,001
80
*
70
60
50
МВ+цирроз
40
30
МВ без цирроза
20
10
0
А1А1
А1А2
А2А2
Cравнение частот аллелей А1 - А2 , p= 0,001
A1A1 +A1A2 – A2A2 - OR= 7,6 (1,44<OR<44,74), p=0,01
Сравнение генотипа A1A1 против остальных генотипов –
OR= 11,52 (4,65<OR<29,11); p=0,001
Выводы
при
муковисцидозе
наблюдается
провоспалительная
направленность
цитокинопосредованного воспаления: о чем
свидетельствует достоверное повышение
относительно
нормативных
значений
уровней провоспалительных цитокинов ИЛ1β, ИФН-γ, ИФН-α, ИЛ-6, ИЛ-8
и
противоспалительного - ИЛ-4 при низких
значениях ИЛ-10.
Получена
полиморфизма
муковисцидоза
(1,05<OR<2,86)
полиморфизма
(1,10<OR<2,87)
ассоциация
VNTR
гена IL1RN с развитием
–
ОR=
1,73
(р=0,03) и Т1488С
гена IFNγ – ОR= 1,77
(p= 0,018 )
Получена ассоциация полиморфизмома VNTR гена IL1RN генотип
A1A2 OR= 0,69(0,30<OR<1,56); полиморфизма 150V гена IL4RA
аллель V OR=0,32(0,11<OR<0,94), (p=0,03) с развитием
хронического легочного сердца при МВ.
Получена ассоциация с полиморфизмом VNTR гена IL1RN,
генотип А1А2 OR=0,65(0,31<OR<1,37), (p=0,05); полиморфизмом
Т1488С гена INF-γ аллель C OR=0,45(0,22<OR<0,89), (p=0,02) с
уровнем колонизации бронхиального дерева грамотрицательной
флорой при МВ.
Получена аccоциация с полиморфизмом VNTR гена IL1RN
генотип A1A1 – OR=11,52 (4,65<OR<29,11), (p=0,001) и
полиморфизма гена IFNγ аллеля С OR=6,16 (p=0,003) с развитием
цирроза печени при МВ.
Прогнозирование развития МВ , его осложнений
VNTR
полиморфизма
гена IL1RN– ОR= 1,73 (
(р=0,03)
Т1488С полиморфизма
гена IFNγ – ОR= 1,77 (p=
0,018 )
Риск развития
Фибороза легких
Риск развития МВ
Хроническое легочное сердце :
генотип A1A2 VNTR полиморфизма
гена IL1RN
генотип II полиморфизма 150V
гена IL4RA
Синегнойная инфекция
генотип А1А2 полиморфизма
VNTR гена IL1RN,
аллель
C
полиморфизма
Т1488С гена INF-γ
Цирроз печени
генотип A1A1 полиморфизма
VNTR гена IL1RN
Аллель
С
полиморфизма
Т1488С гена INF-γ
Количестово IL-1β
Ассоциации (OR)
Ассоциации с МВ
в сыворотке – риск
фиброза
печени
и
бронхоэктазов
Цитокины и их
гены
Провоспалительная
направленность
цитокинопосредованного
воспаления
Понимание
механизмов
воспаления
Практическая значимость
Новые подходы
к терапии
Разработка
инновационных
лекарств
Уточнение
генетической
основы МВ
Долгосрочный
индивидуальный
прогноз для
конкретного
больного МВ
Спасибо за внимание!