Биологический факультет МГУ - Московский государственный

На правах рукописи
Янкаускас Станисловас Стасисович
Исследование механизмов действия митохондриальнонаправленных антиоксидантов при острой почечной
недостаточности
03.03.01 - Физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА
2014
Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор,
Зоров Дмитрий Борисович
НИИ физико-химической биологии имени А.Н.
Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский
государственный университет имени М.В.
Ломоносова», заведующий лабораторией
структуры и функции митохондрий
доктор биологических наук,
Плотников Егор Юрьевич
НИИ физико-химической биологии имени А.Н.
Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский
государственный университет имени М.В.
Ломоносова», ведущий научный сотрудник
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
ФГБУ науки «Институт биохимии им.
А.Н.Баха» РАН, лаборатория биомедицинских
исследований, ведущий научный сотрудник
Ковалев Леонид Иванович
доктор биологических наук, ФГБУ
Сурин Александр Михайлович
«Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии» РАМН, ведущий
научный сотрудник
Ведущая организация:
НИИ молекулярной медицины ГБОУ ВПО Первого МГМУ им.И.М.Сеченова
Защита состоится « »
2014 г. в
часов
мин на заседании
Диссертационного совета Д 501.001.93 при Биологическом факультете МГУ
имени М.В. Ломоносована по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1,
стр. 12
С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ
имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ломоносовский пр-т, 27
Автореферат разослан « »
Ученый секретарь диссертационного
совета,доктор биологических наук
2014 г.
Б.А. Умарова
2
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Острая
почечная
недостаточность
(ОПН)
это
синдром,
характеризующийся быстрым (в течение часов или недель) снижением
скорости клубочковой фильтрации, которое сопровождается накоплением
продуктов азотного метаболизма, водно-электролитными и кислотнощелочными нарушениями (Devarajan P. et al, 2005). ОПН представляет собой
социально значимую патологию в силу ее широкой распространённости и
провоцируемой ею высокой смертности. Данная патология развивается у 5%
всех госпитализированных больных и у 30% пациентов отделений интенсивной
терапии, а летальность составляет 40-60% (Schrier R.W et al, 2004).
Такая высокая смертность частично объясняется преобладанием больных
пожилого и старческого возраста в популяции больных ОПН, а также тем
фактом, что в подавляющем большинстве случаев данная патология встречается
как осложнение различных тяжёлых состояний (в пост-операционном периоде,
при тяжёлых травмах, системных нарушениях гемодинамики, сепсисе,
сердечной недостаточности). Однако, главная причина высокого уровня
смертности заключается прежде всего в отсутствии эффективной
фармакологической терапии ишемической ОПН. Большинство современных
подходов направлено на коррекцию осложнений, возникающих в результате
нарушения работы почки, и носят симптоматический характер (Мухин Н.А.,
2009).
Структура смертности ОПН определяется ренальной формой этой
патологии, когда причиной почечной недостаточности становится повреждение
ткани органа. В 55-75% случаев повреждающим агентом является ишемия
органа, в 30-40% нефротоксическое действие различных препаратов
(аминогликозидные антибиотики, радиоконтрастные вещества, противораковые
и иммуносупрессивные препараты) (Thadhani R. et al, 1996; Lameire N., 2005;
Ярмагомедов А.А, 2005). Работы последних лет демонстрируют ключевую роль
окислительного стресса в патогенезе ишемической и нефротоксической ОПН
(Plotnikov E.Y. et al., 2007; Rodriguez F. et al, 2014). В условиях окислительного
стресса митохондрия является главным источником образования активных форм
кислорода (АФК) и одновременно мишенью их повреждающего действия
(Broekemeier K.M. et al, 1992; Zorov D.B. et al, 2000; Rasola A. et al, 2010).
Следствием
митохондриальной
дисфункции
становится
глубокий
энергетический дефицит переживаемый клетками нефрона, не позволяющий им
эффективно выполнять свои функции, и даже приводящий к их некрозу.
Одновременно активируются сигнальные пути апоптотической программы.
Таким образом, можно предполагать, что нормализация функционирования
митохондрии в условиях окислительного стресса может предотвратить
повреждение органа.
Существует две стратегии нефропротекции, рассматривающие как
главную мишень митохондриальный ретикулум. Первая основана на
использовании антиоксидантов и направлена на уменьшение количества АФК.
Несмотря на множество экспериментальных доказательств, эффективность
3
подхода оспаривается данными клинических испытаний (Kromhout D., 2001).
Причиной этого, по всей видимости, является недостаточная концентрация
«классических» антиоксидантов в клеточных компартментах, ответственных за
образование и реализацию ключевых эффектов АФК. Различные группы
исследователей в настоящее время разрабатывают подходы, позволяющие
антиоксидантным молекулам преимущественно накапливаться и осуществлять
своё антиоксидантное действие внутри митохондрии (Sheu S.S. et al, 2006;
Zabbarova I., Kanai A., 2008; Антоненко Ю.Н. и др., 2009).
Вторая
стратегия,
получившая
название
ишемического
прекондиционирования (ИПК), использует активацию сигнальных путей,
приводящих к увеличению толерантности клетки к уже образовавшимся АФК.
Запуск сигнальных каскадов может осуществляться при помощи как
физиологических, так и фармакологических манипуляций. Ряд исследований
показали ключевую роль митохондрии и АФК в реализации защитных
механизмов ИПК (Park K.M. et al, 2001; Juhaszova M. et al, 2009).
Целью данной работы было исследование действия митохондриальнонаправленных соединений семейства SkQ при ОПН через влияние на
продукцию АФК и сигнальные пути прекондиционирования органа.
Задачи работы:
1. Исследовать влияние различных митохондриально-направленных
соединений семейства SkQ на почечную недостаточность, возникающую при
ишемии/реперфузии почки.
2. Изучить роль сигнальных путей ишемического/фармакологического
прекондиционирования в реализации эффектов митохондриально-направленных
соединений семейства SkQ.
3. Исследовать изменения почечного кровообращения, вызываемые
ишемией/реперфузией почки, и возможность влияния на эти изменения при
помощи митохондриально-направленных соединений семейства SkQ.
4. Исследовать влияние митохондриально-направленных соединений
семейства SkQ и фармакологического прекондиционирования на острую
почечную недостаточность, вызываемую аминогликозидным антибиотиком
гентамицином.
Научная новизна работы:
Показано нефропротекторное действие митохондриально-направленного
антиоксиданта
10-(6'-пластолхинонил)
децил-родамина
(SkQR1)
при
ишемии/реперфузии почки, включающее в себя увеличение выживания
животных, уменьшение почечной недостаточности, улучшение гистологической
картины ткани почки, снижение выраженности окислительного стресса и
нормализацию содержания эритропоэтина в почке.
Продемонстрирована ключевая роль активации сигнальных каскадов
ишемического прекондиционирования в защите почки от ишемического
повреждения. Показано, что нефропротекторный эффект SkQR1 сопряжён с
ингибированием киназы гликогенсинтазы (GSK-3) в ткани почки и
увеличением образования эритропоэтина в эпителиоцитах почечных канальцев.
4
Показано нефропротекторное действие прекондиционирования почки
сверхкороткими периодами (15 сек) ишемии и реперфузии, которое
наблюдалось у молодых животных и отсутствовало у старых.
Показана возможность защиты почки при ишемии/реперфузии с помощью
частичного разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования.
Продемонстрировано защитное действие классического (2,4-динитрофенол) и
митохондриально-направленного (додецил-родамин, С12R1) разобщителей на
функцию почки при ишемии/реперфузии.
При помощи ультразвуковой допплеровской техники впервые описано
снижение общего почечного кровотока и увеличение почечного сосудистого
сопротивления на ранних стадиях реперфузии (до 30 мин) после ишемии почки.
Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 обращал эти изменения,
увеличивая общий почечный кровоток и снижая почечное сосудистое
сопротивление.
Обнаружено
защитное действие митохондриально-направленного
антиоксиданта SkQR1 при развитии гентамициновой нефротоксичности,
включающее в себя увеличение выживания животных, уменьшение ОПН и
нормализацию содержания эритропоэтина в почке.
Показано, что индукция сигнальных каскадов ишемического
прекондиционирования агонистом -опиодных рецепторов даларгином или
хлоридом лития
приводит к уменьшению почечной недостаточности,
нормализации гистологической картины ткани, снижению выраженности
окислительного стресса при нефротоксическом действии гентамицина.
Научно-практическое значение работы:
Проведённые исследования расширяют представления о механизмах
защиты почки при ОПН ишемического и нефротоксического (при
использовании аминогликозидных антибиотиков) генеза. Были изучены
сигнальные каскады, активация которых увеличивает толерантность почки к
ишемическому и токсическому повреждению. Эти данные дают возможность
разработки новых нефропротекторных лекарств.
В данной работе показан терапевтический потенциал ряда соединений:
митохондриально-направленного антиоксиданта SkQR1, ингибиторов GSK-3
даларгина и хлорида лития, разобщителей дыхания и фосфорилирования 2,4динитрофенола и С12R1. Проведенные исследования открывают перспективы
для проведения доклинических исследований применения данных веществ в
терапии ОПН.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 предотвращает
развитие почечной недостаточности после ишемии/реперфузии почки, улучшая
функцию органа, уменьшая повреждение ткани и снижая выраженность
окислительного стресса.
2. Нефропротекторное действие SkQR1 сопряжено с увеличением
фосфорилированной (цитопротекторной) формы GSK-3β и содержания
эритропоэтина в ткани почки, что указывает на сходство механизмов защитного
действия SkQR1 с ишемическим прекондиционированием.
5
3. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 снижает
выраженность нарушений почечного кровообращения, возникающих после
ишемии/реперфузии почки и проявляющихся в уменьшении почечного
кровотока и увеличении почечного сосудистого сопротивления.
4. Выраженность нефропатии, вызываемой аминогликозидным
антибиотиком гентамицином и сопряженной с развитием окислительного
стресса, повреждением ткани почки и снижением её функции, уменьшается при
действии SkQR1 или агонистов фармакологического прекондициоинрования.
Апробация работы и публикации
Основное содержание работы изложено в 24 работах. Апробация работы
была проведена на открытом семинаре отдела биоэнергетики Научноисследовательского
института
физико-химической
биологии
им.
А.Н.Белозерского МГУ (председатель - академик РАН В.П.Скулачев).
Результаты исследований докладывались на международных и российских
конференциях: EuroNanoMedicine (Словения, Блед 2009 г.), Международная
научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов2010» (Москва 2010 г.), 16th European Bioenergetics Conference (Польша,
Варшава 2010 г.), 21-й съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова
(Калуга 2010 г.), 5-я Всероссийская с международным участием школаконференция «Физиология кровообращения» (Москва 2012 г.), 37th FEBS
Congress (Испания, Севилья 2012 г), Международная конференция «Рецепторы
и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2013 г.), 50th ERA-EDTA Congress
(Турция, Стамбул 2013 г.).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «материалы
и методы», результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.
Материал диссертации изложен на 171 странице, содержит 35 рисунков и 3
таблицы, в списке цитируемой литературы 367 наименований.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 24 научных работы, в том
числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 17 тезисов конференций.
Материалы и методы исследования
Эксперименты были выполнены на беспородных самцах белых крыс (250–
450 г), содержавшихся в условиях вивария и получавших стандартный рацион
питания ad libitum. На проведение экспериментального исследования было
получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ Физико-химической
биологии имени А.Н.Белозерского (протокол №1 от 8 апреля 2013 г.).
1.Моделирование ишемической ОПН
Для наркоза использовали хлоралгидрат (в/б 300 мг/кг). Сосудистый
пучок левой почки освобождали от прилежащей жировой ткани и пережимали
на 40 минут микрососудистым нетравматическим зажимом. Правую почку
удаляли. С ложнооперированными животными производили те же
манипуляции, исключая наложение зажима на сосудистый пучок почки. В
течение всего времени действия наркоза температуру животного поддерживали
на уровне 37оС. Через 48 ч реперфузии у животных забирали кровь из хвостовой
6
вены. Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли с помощью
автоматического анализатора CellTac («Nihon Kohben», Италия). Часть крыс
декапитировали после глубокого наркоза этиловым эфиром и извлекали почку
для дальнейших исследований.
В опытах по исследованию ИПК микрососудистый зажим накладывали
на сосудистый пучок почки на 15 сек, после чего восстанавливали кровоток на
15 сек. Такой цикл повторяли 4 раза. После последнего 15 сек периода
реперфузии сосудистый пучок пережимали на 40 мин.
2. Изучение кровотока при помощи высокочастотной допплеровской
техники
В опытах по исследованию гемодинамики использовали высокочастотную
ультразвуковую допплеровскую технику, работающая на частоте 27 МГц,
разработанную в биоинженерной лаборатории НИИ общей патологии и
патофизиологии РАМН. Измерение кровотока выполняли датчиками
бандажного типа с внутренним диаметром 1,5-2 мм, прокалиброванными в
единицах объёмной скорости кровотока. Датчики накладывали на почечную
артерию и брюшную аорту. Регистрацию скорости кровотока начинали через
10-15 мин после фиксации датчиков, ожидая стабилизации кровотока.
В течение эксперимента осуществляли регистрацию линейной (V) и
объёмной (Q) скорости кровотока. Оцифровку данных, поступающих от
ультразвукового прибора, проводили при помощи компьютерной программы
«Graph2Digit». Анализ состояния кровотока осуществляли на основании
следующих параметров:
 частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин)
 объёмная скорость кровотока (Q, мл/мин)
 пиковая систолическая скорость кровотока (Vmax, см/с)
 конечная диастолическая скорость кровотока (Vmin, см/с)
 индекс резистивности: (Vmax - Vmin)/ Vmax
3. Моделирование аминогликоизидной ОПН
В течение 6 сут крысам в/б вводили гентамицин (KRKA, Словения) в дозе
160мг/кг.сут. Через 24 ч после последней инъекции гентамицина у животных
забирали кровь из хвостовой вены для определения концентрации мочевины. В
течение 14 дней наблюдали за выживанием животных.
4. Определение продукции АФК
Продукцию АФК оценивали по интенсивности флуоресценции 2,7дихлорфлуоресцеина диацетата (2,7-DCF DA; Calbiochem, San Diego, США).
при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (Carl
Zeiss, Германия). После 40 мин ишемии и 10 реперфузии, или через 3 ч после
инъекции гентамицина (в/б 160 мг/кг/сут), или аналогичного периода без
ишемии/реперфузии, или после введения физраствора без гентамицина, почку
выделяли и помещали в среду инкубации (стандартный раствор Хенкса для
клеточных культур с добавлением 10 мМ Hepes-NaOH рН 7,4). Затем при
помощи вибрационного микротома Vibratom NLS (WPI, США) получали срезы
коркового вещества почки толщиной 150-200 мкм. Срезы инкубировали в
7
течение 10 мин в среде инкубации, содержащей 10 мкМ 2,7-DCF DA и
отмывали чистой средой инкубации в течение 5 мин. После этого срезы
анализировали на конфокальном микроскопе.
В ряде опытов исследовали продукцию АФК в изолированном сегменте
брюшной аорты. Вырезанный сегмент разрезали в продольном направлении и
помещали в среду инкубации (как и в предыдущих опытах) с добавлением или
без добавления ангиотензина (АНГ) II (100 нг/мл). Через 1 ч инкубации среду с
АНГ II заменяли на чистую среду инкубации, после чего расправляли и
фиксировали сегмент сосуда. Далее сосуд окрашивали 2,7-DCF DA, как описано
выше, и при помощи конфокальной микроскопии оценивали продукцию АФК в
интиме сосуда.
5. Определение малонового диальдегида (МДА) в ткани почки
Концентрацию МДА определения с помощью тиобарбитуровой кислоты
(ТБК) в гомогенатах почечной ткани. Почку извлекали, почечную капсулу
удаляли, ткань размельчали ножницами и гомогенизировали в 3 мл буфера
(1,15% KCl , 0,38% EDTA) при 4оС. К гомогенату добавляли 0,8% ТБК и 1%
H3PO4 в соотношении 1 : 1,1 : 3,3, соответственно. Смесь инкубировали 40
минут при 100оС, после чего центрифугировали 5 мин при 11 000 g.
Супернатант отбирали и измеряли его оптическую плотность при длине волны
532 нм на спектрофотометре Hitachi 557. Результаты нормировали на
концентрацию белка.
6. Определение концентрации белка
Определение концентрации белка в гомогенатах почечной ткани
определяли по методу, описанному Смитом и соавт. (Smith et al., 1985),
основанному на колориметрической реакции бицинхониновой кислоты с
белками, в микромодификации метода для 96-луночного планшета.
7. Иммуноблоттинг
Электрофорез белков для последующего иммуноблоттинга проводили в
псевдоградиентном (10-20% полиакриламидном) геле в денатурирующих
условиях по Laemmli (Laemmli, 1970). По окончании электрофореза переносили
белки на PVDF мембрану. Мембрану блокировали обезжиренным молоком,
промывали и инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами
(к Р-GSK-3, GSK-3, эритропоэтин, АНГ II, -тубулин). Мембраны промывали
и инкубировали 1,5 ч при 25°C с вторичными антикроличьими антителами.
Мембраны промывали, специфические полосы детектировали с помощью
хемилюминесцентного субстрата ECL Advance Western blotting detection kit.
Хемилюминесценцию регистрировали с помощью фотопленки (Kodak, США).
Изображение оцифровывали на сканере V100 Photo (Epson, Япония) и
анализировали с помощью программного обеспечения WCIF ImageJ (NIH,
Bethesda, MD, США).
8. Иммуногистохимия
Срезы коркового вещества почек, получали как описано в п.4 и
фиксировали в течение 12 ч в 4% формалине при 4°C, пермеабилизовали 0,1%
Тритоном X-100 в течение 10 мин при 4°C и отмывали фосфатным буфером (5
мин каждая промывка). После 1-ч блокирования 1% бычьим сывороточным
8
альбумином срезы инкубировали 2 ч при комнатной температуре с первичными
кроличьими антителами к эритропоэтину (1:50), отмывали и инкубировали 1 ч с
вторичными
антителами
(1:50)
(анти-кроличьи
антитела
козы,
конъюгированные с Aleхa-594 (Sigma, США). После отмывки срезы
фиксировали на предметном стекле.
Анализировали образцы при помощи лазерного сканирующего
конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Для возбуждения
флуоресценции использовались аргоновый лазер (полоса излучения 488 нм) и
HeNe лазер (568 нм). Конфокальные снимки получали с помощью 40×1,3 N.A.
иммерсионного объектива и впоследствии анализировали в программе «Corel
Photo Paint 12» (США).
9. Гистологическое исследование
Почку фиксировали 1 сут в модифицированном фиксаторе Телесницкого
(70% изопропанол, 10% формалин и вода в соотношении 7:2:1), обезвоживали 1
сут в 90% изопропаноле и 1 сут в изопропаноле-99, заливали парафином. На
микротоме делали срезы толщиной 6 мкм и фиксировали их на предметные
стёкла. Срезы депарафинизировали в ксилоле (2-3 мин), обезвоживали в 96%
спирте (два раза по 1-2 мин), окрашивали гематоксилином (4 мин) и эозином (1
мин), отмывали водой и 96% спиртом (20 сек). Перед заключением срезы
обрабатывались ксилолом (0,5-1 мин). Срезы заключались в синтетическую
смолу «полимаунт». Срезы изучали, используя световой микроскоп.
Производили полуколичественную оценку выраженности патоморфологических
изменений коркового вещества.
10. Статистика
Выборка в опытах на животных составляла не менее 5 животных для
каждой группы; при конфокальной микроскопии и гистологическом
исследовании оценивалось не менее 10 полей зрения для каждого образца. Все
данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.
Сравнение между группами проводилось с помощью теста Стьюдента для
параметрических данных и U-критерий Манна-Уитни для непараметрических
данных.
Результаты исследования
Нефропротекторное
действие
митохондриально-направленного
антиоксиданта SkQR1при И/Р почки
Модель транзитной ишемии и последующей реперфузии (И/Р) почки
крысы in vivo наиболее часто используется для экспериментального изучения
ОПН. В нашей работе мы подвергали почку 40-мин ишемии и оценивали её
функцию через 48 ч после операции. Такая ишемия приводила к резкому
нарушению функции органа: на 2-е сут мы наблюдали увеличение
концентрации мочевины (основной маркёр выделительной функции почки) в
крови животных примерно в 8 раз и падение содержания эритропоэтина в ткани
почки примерно на треть. И/Р также приводила к гибели 50% животных к 4-м
сут эксперимента (рис. 1).
При
в/б
введении
животным
митохондриально-направленного
антиоксиданта SkQR1 за 3 ч до начала ишемии, через 1 ч после начала
9
реперфузии и три раза через каждые 12 ч мы наблюдали выраженный
терапевтический эффект, если доза каждой инъекции составляла 20 или 100
нмоль/кг. SkQR1 снижал концентрацию мочевины примерно в 2 раза и
увеличивал выживание до 80-83%. Иммуноблотинг почечной ткани показал, что
лечение животных SkQR1 также позволяло сохранить нормальную продукцию
эритропоэтина (рис. 1).
А
В
Б
Рис. 1. SkQR1 предотвращает
развитие
почечной
недостаточности
(А,Б)
и
увеличивает выживание (В)
после 40-мин ишемии (И/Р).
Концентрация мочевины в крови
(А) и иммуноблотинг гомогенатов
почечной ткани (Б) через 48 ч
после И/Р. SkQR1 вводили в/б за
3 ч до начала ишемии, через 1, 18,
30, 42 ч после начала реперфузии.
Доза каждой инъекции составляла
20, 100 или 500 нмоль/кг.
«ЛО» n=5; «И/Р» n=18; «И/Р +
SkQR1 20 нмоль/кг» n=9; «И/Р +
SkQR1 100 нмоль/кг» n=31; «И/Р
+ SkQR1 500 нмоль/кг» n=7.
ЛО
–
ложнооперированные
животные; ЭПО – эритропоэтин;
* - р<0,001; ** - р<0,05; н/д – нет
достоверных отличий.
Гистологическое исследование ткани почки через 48 ч после И/Р выявило
значительное нарушение нормальной структуры ткани (рис. 2). Наиболее
выраженные изменения наблюдали в корковом слое почки и во внутренней
полоске наружного мозгового вещества. В то время как у ложнооперированных
животных не наблюдалось патологических изменений, у крыс перенесших И/Р
были видны многочисленные очаги некроза (рис. 2Б,белая стрелка), часто
встречались дилатированные канальцы (рис. 2Б, чёрная стрелка), их обструкция
гиалиновыми цилиндрами, потеря щёточной каёмки. Полуколичественный
анализ выраженности патоморфологических изменений показал, что при
10
лечении животных SkQR1 в дозе 100 нмоль/кг частота встречаемости погибших
канальцев резко уменьшалась и достоверно реже наблюдалась дилатация (рис.
2Г). При этом митохондриально-направленный антиоксидант не влиял на
обструкцию дистальных отделов нефрона.
А
Г
Б
В
Рис.
2.
Патоморфологические
изменения ткани почки через 48 часов
после
40-мин
ишемии
(И/Р).
Микрофотографии коркового вещества
почки ложнооперированных животных
(ЛО) (А), перенесших И/Р (Б) и
перенесших И/Р на фоне лечения SkQR1
(в/б 100 нмоль/кг за 3 ч до начала
ишемии, через 1, 18, 30, 42 ч после начала
реперфузии) (В). Полуколичественная
оценка
выраженности
патоморфологических изменений (Г).
* - р<0,001; # - р<0,05; н/д – нет
достоверных отличий.
Считается, что в начале каскада патологических событий, ведущих к
ОПН, лежит гиперпродукция АФК (Paller M.S. et al, 1984; Plotnikov E.Y. et al.,
2007). Мы исследовали образование кислородных радикалов при помощи
флуоресцентного зонда на АФК – 2',7'-дихлорфлуоресцина (DCF). 40-мин
ишемия
приводила
к
многократному
увеличению
интенсивности
флуоресценции DCF уже через 10 мин реперфузии, что говорит об увеличении
образования кислородных радикалов. Предварительное введение SkQR1 за 3 ч
до начала ишемии приводило к падению сигнала DCF до контрольных значений
(рис. 3). Измерение концентрации МДА – маркёра перекисного окисления
11
липидов – через 48 ч после И/Р в ткани почки также показало увеличение
выраженности окислительного стресса после И/Р и уменьшение его
выраженности при использовании SkQR1 (данные не представлены).
Рис. 3. Продукция АФК через
40 мин ишемии и 10 мин
реперфузии. SkQR1 (в/б 100
нмоль/кг) вводили за 3 ч до
начала ишемии.
DCF – 2',7'-дихлофлуоресцина
диацетат; * - р<0,005.
Таким образом, мы обнаружили, что митохондриально-направленный
антиоксидант SkQR1 предотвращал вызываемое И/Р повреждение почки.
Сохранение функции почки, скорее всего, объясняется тем, что SkQR1
уменьшает продукцию АФК во время реперфузии, что в свою очередь
предотвращает гибель канальцевого эпителия.
Нефропротекторное действие ИПК при И/Р
Известно, что ключевую роль в увеличении толерантности ткани к
ишемическому повреждению играют сигнальные пути ИПК. Конечной точкой
данных сигнальных путей является 3-изоформа киназы гликогенсинтазы (GSK3). Ингибирование фермента, происходящее при фосфорилировании серина-9,
приводит к предотвращению открытия поры неспецифической проницаемости
митохондрии. Открытие поры становится причиной запуска апоптотической
А
Б
Рис.
4.
SkQR1
увеличивает
фосфорилирование
GSK-3β
(А)
и
содержание эритропоэтина (ЭПО) в ткани
почки (Б). Иммуноблоттинг гомогенатов
почечной ткани через 3 и 24 ч после
инъекции SkQR1 (в/б 1 мкмоль/кг). P-GSK-3β
– фосфорилированная форма 3β изоформы
киназы гликоген синтазы
12
Рис.
5.
Ишемическое
прекондиционирование
(ИПК)
предотвращает развитие почечной
недостаточности
после
40-мин
ишемии
(И/Р).
Концентрация
мочевины в крови через 48 ч после
И/Р. ИПК – 4 цикла по 15 сек ишемии
и 15 сек реперфузии непосредственно
перед И/Р. Крысы возрастом 3-4 мес
(«И/Р» n=13; «И/Р+ИПК» n=4) и 20
мес («И/Р» n=2; «И/Р+ИПК» n=3). ЛО
– ложнооперированные животные
(n=5); * - р<0,001.
программы. Одним из триггеров открытия митохондриальной поры является
окислительный стресс (Zorov D.B. et al., 2009; Juhaszova M. et al., 2009).
В нашей работе мы обнаружили, что в/б введение SkQR1 интактным
животным приводит к увеличению содержания P-GSK-3 в почке (рис. 4А).
Также нами было показано, что митохондриально-направленный антиоксидант
увеличивает синтез эритропоэтина в почке (рис. 4Б). Известно, что сигнальные
каскады активации рецептора данного гормона приводят в том числе и к
фосфорилированию GSK-3 (Maiese K. et al., 2004).
Физиологичным
способом
активации
сигнальных каскадов ИПК
является
ишемическая
тренировка органа. Мы
пережимали
сосудистый
пучок почки на 15 сек с
последующей
15
сек
реперфузией, и повторяли
этот цикл 4 раза. Потом
почку подвергали 40-мин
И/Р. Такая манипуляция
оказывала ярко выраженное
защитное
действие
на
функцию почки (рис. 5).
Рис.
6
Разобщение
дыхания
и Дальнейшие исследования
что
ИПК
фосфорилирования
предотвращает развитие показали,
почечную
почечной недостаточности после 40-мин ишемии предотвращает
(И/Р). Концентрация мочевины в крови через 48 ч недостаточность только у
после И/Р. С12R1 (в/б 100 нмоль/кг) и 2,4-ДНФ (в/б молодых крыс (3-4 мес), а у
275 нмоль/кг) за 3 ч до начала ишемии, через 1, 18, старых крыс (20 мес)
30, 42 ч после начала реперфузии. «ЛО» n=5; «И/Р» данный эффект исчезает
n=29; «И/Р+C12R1» n=5; «И/Р+2,4-ДНФ» n=5.
(рис. 5).
ЛО – ложнооперированные животные; *-р<0,05;
**-р<0,1
13
Нефропротекторное
действие
разобщения
дыхания
и
фосфорилирования при И/Р
Ещё одной стратегией нефропротекции, направленной на предотвращение
окислительного стресса и его последствий, является разобщение дыхания и
окислительного фосфорилирования митохондрий. Известно, что данный подход
увеличивает толерантность ткани к ишемическому повреждению (Sack M.N.,
2006). Мы исследовали влияние митохондриально-направленного соединения
C12R1, лишённого антиоксидантной части в составе своей молекулы, но
обладающей разобщающим действием на митохондрии (Severin F.F. et al., 2010).
Мы обнаружили, что C12R1 был не способен активировать сигнальные пути
ИПК (данные не приведены), но при этом его введение крысам при И/Р почки в
той же схеме, что и SkQR1, предотвращало нарушение почечной функции (рис.
6). Введение животным классического разобщителя 2,4-динитрофенола в той же
схеме и в дозах того же порядка также имело выраженный терапевтический
эффект при И/Р почки (рис. 6).
Изменения почечного кровообращения при И/Р
Важную роль в патогенезе ишемической ОПН играет нарушение
почечного кровотока. Мы исследовали почечную и центральную гемодинамику
при помощи высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники (рис. 7).
Мы обнаружили, что после 40-мин ишемии почечный кровоток
восстанавливается не более чем до 40% от предишемических значений, а
почечное сосудистое сопротивление возрастает более, чем на 20% (рис. 8).
Регистрация линейной и средней скорости кровотока по брюшной аорте, а также
измерение ЧСС показало, что И/Р почки не приводит к значительным
Рис. 7. Изменения центрального и почечного кровотока, вызванные 40-мин
ишемией почки. Измерение линейной (А,В) и объёмной (Б,Г) скорости кровотока по
ao.abdominalis (А,Б) и a.renalis (В,Г) при помощи высокочастотной ультразвуковой
техники.
14
изменениям
центральной
гемодинамики (данные не
А
приведены).
Введение SkQR1 за 3 ч
до начала ишемии приводило
к увеличению почечного
кровотока
до
67%
от
предишемических значений и
нормализации сосудистого
сопротивления почки на
ранних сроках реперфузии
(рис. 8). Таким образом,
защитное
действие
митохондриальнонаправленного антиоксидант
Б
может быть связано с
уменьшением выраженности
гипоксии,
связанной
с
нарушением
почечного
кровотока после И/Р.
Механизм
положительного
влияния
митохондриальнонаправленного
антиоксиданта на почечную
гемодинамику может быть
связан
с
уменьшением
продукции АФК в стенке
сосуда и, как следствие,
увеличением биодоступности
Рис.
8.
SkQR1
увеличивает
скорость
NO, который с высоким
восстановления почечного кровотока (А) и
сродством
реагирует
с
снижает почечное сосудистое сопротивление
супероксидным радикалом
(Б) после 40-мин ишемии (И/Р). Измерение
кровотока
по
a.renalis
при
помощи
(Pryor W.A., Squadrito G.L.,
высокочастотной ультразвуковой техники. L-NA
1995).
При
совместном
(Nω L-нитроаргинин, в/в, 1 мг/кг) вводили за 10
введении крысам вместе с
мин до начала И/Р. SkQR1 (в/б 100 нмоль/кг)
SkQR1
неселективного
вводили за 3 ч до начала И/Р. «И/Р» n=5;
ингибитора NO-синтаз Nω-L«И/Р+SkQR1» n=4;
«И/Р+SkQR1+L-NA» n=4.
нитроаргинина мы отметили
* - р<0,05 ** - р<0,1 по сравнению с «И/Р».
уменьшение положительного
влияния митохондриально-направленного антиоксиданта на почечный кровоток
и сосудистое сопротивление (рис. 8). Через 48 ч после И/Р мы видели так же
отмену и нефропротекторного действия SkQR1 (рис. 9).
15
Рис. 9. Совместное применение Nω-Lнитроаргинина
(L-NA)
и
SkQR1
отменяет защитное действие SkQR1 на
функцию почки после 40-мин ишемии
(И/Р). Концентрация мочевины в крови
через 48 ч после И/Р. L-NA (в/в 1 мг/кг)
вводили за 10 мин до начала И/Р. SkQR1
(в/б 100 нмоль/кг) вводили за 3 ч до начала
ишемии, через 1, 18, 30, 42 ч после начала
реперфузии. «ЛО» n=5; «И/Р» n=56;
«И/Р+SkQR1» n=31; «И/Р+SkQR1+L-NA»
n=8. ЛО – ложнооперированные животные;
* - р<0,001; н/д – нет достоверных отличий.
Источником окислительного стресса в стенке артериальных сосудов
может быть не только сама И/Р, но и некоторые вещества, чья продукция
увеличивается в результате И/Р почки. Иммуноблоттинг гомогенатов почечной
ткани показал, что И/Р приводит к значительному увеличению содержания АНГ
II в почке (рис. 10А). Мы исследовали последствия инкубации АНГ II с
изолированным сегментом брюшной аорты и обнаружили, что пептид
увеличивает продукцию АФК в интиме сосуда (рис. 10Б,В).
Нефропротекторное
действие
митохондриально-направленного
антиоксиданта SkQR1 при аминогликозидной ОПН
Длительное введение крысам высоких доз гентамицина является наиболее
широко используемой моделью ОПН, возникающей при применении
аминогликозидных антибиотиков. В нашей работе мы наблюдали выраженную
нефротоксичность гентамицина после 6 сут в/б введения препарата в дозе 160
А
Б
В
контроль
АНГ II
Рис. 10. Увеличение содержания ангиотензина II (АНГ II) в ткани почки после
И/Р (А) и увеличение продукции АФК интимой сосуда под действием АНГ II
(Б,В) ex vivo. Иммуноблоттинг гомогенатов почечной ткани через 24 ч после И/Р
(А). Продукция активных форм кислорода в интиме брюшной аорты через 1 ч
инкубации изолированного сегмента сосуда с АНГ II (100 нг/мл) (Б,В). DCF – 2',7'дихлофлуоресцина диацетат; * - р<0,05
16
мг/кг/сут. Через 24 ч после
последней
инъекции
А
гентамицина
концентрация
мочевины в крови животных
возрастала более чем в 4 раза,
а содержание эритропоэтина в
почке уменьшалось почти
наполовину. К 20-му дню
эксперимента погибало около
40% животных. Введение
SkQR1 (100 нмоль/кг/сут) за 3
ч
до
каждой
инъекции
Б
гентамицина приводило к
смягчению
токсичного
действия антибиотика – мы
наблюдали
уменьшение
концентрации мочевины в
В
полтора раза и нормализацию
уровня
эритропоэтина.
Использование
митохондриальнонаправленного антиоксиданта
также увеличивало выживание
животных с 61% до 83% (рис.
11).
Таким
образом,
предварительное
введение
митохондриальнонаправленного антиоксиданта
уменьшало
токсическое
действием гентамицина на
Рис. 11. SkQR1 предотвращает развитие
почку. Анализ литературы
почечной недостаточности (А,Б) и
показывает, что важную роль в
увеличивает выживание (В) после 6 сут
механизме
токсического
введения гентамицина (160 мг/кг/сут).
действия гентамицина играет
Концентрация мочевины в крови (А) и
иммуноблотинг гомогенатов
почечной
гиперпродукция АФК. При
ткани (Б) через 24 ч после последней
этом источником этих форм
инъекции гентамицина. SkQR1 (в/б 100
является митохондрия (Walker
нмоль/кг/сут) вводили в течение 6 сут, за 3
P.D., Shah S.V., 1987). В
ч до инъекции гентамицина. «Контроль»
первую
очередь
именно
n=5; «гент» n=23; «гент+SkQR1» n=17.
нейтрализацией
ЭПО – эритропоэтин; * - р<0,05; ** - р<0,1.
образовавшихся кислородных
радикалов может быть объяснёно терапевтическое действие SkQR1 при
введении аминогликозидного антибиотика.
17
Нефропротекторное
действие
агентов
фармакологического
прекондиционирования при аминогликозидной ОПН
Также как и при И/Р, защита почки от аминогликозидной токсичности
может осуществляться через увеличение толерантности ткани к окислительному
стрессу через активацию механизмов ИПК.
Поэтому мы провели серию опытов с агонистом -опиоидных рецепторов
даларгином и хлоридом лития. Данные литературы позволили предположить,
что оба эти вещества, воздействуя на разные сигнальные каскады в конечном
итоге ингибируют GSK-3, предотвращая открытие митохондриальной поры.
Наши опыты подтвердили это предположение – уже через 1 ч после в/б
инъекции даларгина (50 мкг/кг) и хлорида лития (30 мг/кг) мы наблюдали
увеличение уровня фосфорилированности GSK-3 в ткани почки (рис. 12А).
Далее мы исследовали
нефропротекторный
А
потенциал
активации
сигнальных путей ИПК. Мы
вводили
даларгин
(50
мкг/кг/сут) или хлорид лития
(30 мг/кг/сут) за 3 ч до
каждой
инъекции
Б
гентамицина (160 мг/кг/сут).
Через сутки после последней
инъекции гентамицина мы
наблюдали
уменьшение
концентрации мочевины в
крови животных получавших
вместе
с
гентамицином
агонисты ИПК по сравнению
с животным, получавшими
только
аминогликозидный
антибиотик (рис. 12Б).
Одновременно
мы
провели
гистологическое Рис. 12. Даларгин и LiCl увеличивают
GSK-3β
(А)
и
исследование,
показавшее, фосфорилирование
развитие
почечной
что
почечная предотвращают
недостаточности после 6 сут введения
недостаточность,
гентамицина
(160
мг/кг/сут)
(Б).
развивающаяся
на
фоне
Иммуноблоттинг гомогенатов почечной ткани
приёма гентамицина является через 1 ч после инъекций даларгина (в/б 25 или
следствием
повреждения 50 мкг/кг) или LiCl (в/б 30 мг/кг) (А).
ткани почки (рис. 13А,Б,В). Концентрация мочевины в крови через 24 ч после
Через сутки после 6 дней последней инъекции гентамицина (Б). Даларгин
введения
препарата (в/б 50 мкг/кг /сут) или LiCl (в/б 30 мг/кг/сут)
нормальная структура органа вводился в течение 6 сут, за 3 ч до инъекции
была нарушена. В корковом гентамицина. «Контроль» n=5; «гент» n=8; «гент
веществе почки наблюдали +даларгин» n=7; «гент + LiCl» n=8.
* - р<0,05 ; ** - р<0,1
18
А
В
Б
Г
некроз инфильтрация
контроль
–
–
гентамицин
3,5
2
гентамицин
+ даларгин
гент + LiCl
2,5
1
2
0,5
Рис. 13. Патоморфологические изменения ткани почки через 24 ч 6 сут введения
гентамицина (160 мг/кг/сут). Микрофотографии коркового вещества почки
животных, получавших гентамицин (А), и животных, получавших за 3 ч до каждой
инъекции гентамицина даларгин (в/б 50 мкг/кг/сут) (Б) или LiСl (30 мг/кг/сут) (В).
Полуколичественная оценка выраженности патоморфологических изменений (Г).
некроз канальцев (белые стрелки), их дилатация, обструкция гиалиновыми
цилиндрами, инфильтрация лейкоцитами (чёрные стрелки). Используя
полуколичественный метод оценки выраженности патоморфологических
изменений, мы оценили изменения частоты встречаемости некроза и
лейкоцитарной инфильтрации – двух признаков, играющих наибольшую роль в
патофизиологии аминогликозидной ОПН (рис 13Г). Лечение животных и
даларгином, и хлоридом лития сопровождалось уменьшением и частоты
встречаемости погибших канальцев и выраженности инфильтрации. При этом
защитный эффект хлорида лития был более выраженным, чем у даларгина.
Далее мы исследовали процессы образования АФК под действием
гентамицина. Через 1 ч после в/б гентамицина (160 мг/кг) мы не наблюдали
увеличения интенсивности флуоресценции DCF в коре почки (данные не
приведены). При этом через 3 ч после инъекции антибиотика продукция АФК
возрастала примерно в 8 раз по сравнению с контрольными животными.
Введение хлорида лития и даларгина за 3 ч до гентамицина приводило к
уменьшению интенсивности DCF, а следовательно и продукции кислородных
радикалов (рис. 14). Также мы оценили выраженность окислительного стресса
после 5 дней введения животным гентамицина по суммарному уровню
19
карбонилирования белков почки. Введение животным гентамицина приводило к
увеличению данного показателя по сравнению с контрольными животными, а
лечение животных агонистами ИПК снижало данный показатель (данные не
приведены).
контроль
гент
гент + LiCl
гент + даларгин
Рис. 14. Продукция активных форм кислорода в коре почки через 3 ч после
инъекции гентамицина (в/б 160 мг/кг). Даларгин (в/б 50 мкг/кг) или LiCl (в/б
30 мг/кг)
вводили за 3 ч до инъекции гентамицина. DCF – 2',7'дихлорфлуоресцин диацетат; * - р<0,01 ; ** - р<0,05
Таким образом, вещества, активирующие сигнальные пути ИПК, не
только уменьшали нефротоксичность гентамицина, но и уменьшали уровень
окислительного стресса, вызываемого антибиотиком. Известно, что индукция
неспецифической проницаемости митохондрии приводит к увеличению
образования АФК митохондриями. Поэтому антиоксидантное действие
даларгина и хлорида лития, не способных напрямую нейтрализовать
кислородные радикалы, может быть объяснено их ингибирующим действием на
митохондриальную пору, которое в свою очередь реализуется, через
ингибирование активности GSK-3.
20
Выводы:
1. Митохондриально-направленный антиоксидант 10-(6'-пластолхинонил)
децил-родамин (SkQR1) предотвращает развитие почечной недостаточности
после ишемии/реперфузии почки, уменьшает повреждение ткани почки и
снижает выраженность окислительного стресса.
2. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 активирует в
почке сигнальные пути ишемического прекондициоинрования, в частности,
увеличивает содержание в почке фосфорилированной формы фермента GSK-3
и эритрпоэтина.
3. Ишемическое прекондицинирование короткими периодами ишемии и
реперфузии предотвращает развитие почечной недостаточности при
ишемии/реперфузии почки у молодых животных, но не оказывает влияния на
старых животных.
4. Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования при
помощи классического разобщителя 2,4-динитрофенола и митохондриальнонаправленного разобщителя додецилродамина защищает от развития почечной
недостаточности после ишемии/реперфузии.
5. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 снижает
выраженность нарушений почечного кровообращения, возникающих после
ишемии/реперфузии почки, предотвращает уменьшение почечного кровотока и
снижает почечное сосудистое сопротивление на ранних сроках реперфузии.
Защитный эффект SkQR1 на почечный кровоток исчезает при ингибировании
синтеза оксида азота.
6. Активация сигнальных каскадов ишемического прекондиционирования
при помощи митохондриально-направленного антиоксиданта SkQR1 или
ингибиторов фермента GSK-3 (агонист -опиодных рецепторов даларгин и
хлорид лития) защищает почку от токсического действия аминогликозидного
антибиотика гентамицина.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1. Янкаускас С.С., Мациевский Д.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.
Использование высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники для
исследования почечного кровотока при ишемии/реперфузии почки. Нефрология и
диализ, 2014, 16, 1, с. 169-173.
2. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Силачёв Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер
И.Б., Моросанова М.А., Янкаускас С.С., Зоров С.Д., Бабенко В.А. Перспективы
митохондриальной медицины. Биохимия, 2013, 78, 9, с. 1251-1264.
3. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Янкаускас С.С., Рокицкая Т.И., Чупыркина
А.А., Певзнер И.Б., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Антоненко Ю.Н., Скулачев В.П., Зоров
Д.Б. Частичное разобщение дыхания и фосфорилирования как один из путей
реализации нефро- и нейропротекторного действия проникающих катионов семейства
SkQ. Биохимия, 2012, с. 1240-1250.
4. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю., Янкаускас С.С., Исаев Н.К., Силачев Д.Н.,
Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Пулькова Н.В., Зоров С.Д., Моросанова М.А. Феноптозная
проблема: от чего гибнет организм? Уроки по почечной недостаточности. Биохимия,
2012, 77, 7, с. 893-906.
5. Янкаускас С.С., Плотников Е.Ю., Моросанова М.А., Певзнер И.Б., Зорова
Л.Д., Скулачёв В.П., Зоров Д.Б. Митохондриально-адресованный антиоксидант
SkQR1 предотвращает вызванную гентамицином почечную недостаточность и потерю
слуха. Биохимия, 2012, 77, 6, с. 818-823.
6. Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Jankauskas S.S., Pevzner I.B., Silachev D.N.,
Skulachev V.P., Zorov D.B. Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondriatargeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion. Biochimica et
Biophysica Acta, 2011, 1812, 77-86.
7. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Чупыркина А.А., Даньшина М.И.,
Янкаускас С.С., Моросанова М.А., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Горячева Е.С.,
Пирогов Ю.А., Исаев Н.К., Зоров Д.Б. Новое поколение Скулачев-ионов обладающих
выраженным нефро- и нейропротекторным действием. Биохимия, 2010, 75, 2, с. 177 –
184.
Избранные тезисы конференций:
1. Янкаускас С.С., Певзнер И.Б., Бабенко В.А., Зорова Л.Д., Плотников Е.Ю.,
Зоров Д.Б.Митохондриально-направленные подходы к предотвращению
гентамициновой токсичности. Международная конференция «Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация», 2013, Пущино, с.631-635.
2. Jankauskas S.S., Pevzner I.B., Zorova L.D., Babenko V.A., Morosanova M.A.,
Plotnikov E.Y., Zorov D.B.. Mitochondria-targeted approaches to prevent gentamycin
toxicity. 50th ERA-EDTA Congress, 2013, Turkey, Istanbul, Nephrology Dialysis
Transplantation, 28 (S1), SP068.
3. Jankauskas S.S., Plotnikov E.Y., Pevzner I.B., Chupyrkina A.A., Kirpatovsky
V.I., Zorov D.B. Mitochondria-targeted antioxidant SkQR1 prevents acute kidney injury
after ischemia/reperfusion, rhabdomyolysis and gentamicin toxicity. 22nd IUBMB & 37th
FEBS Congress, 2012, Spain, Sevilla, FEBS Journal Volume 279 (Suppl 1), 205
4. Янкаускас С.С., Мациевский Д.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.
Использование высокочастотной ультразвуковой доплеровской техники для
исследования почечного кровотока при ишемии/реперфузии почки. 5-я Всероссийская
с международным участием школа-конференция «Физиология кровообращения»,
2012, Москва, с. 197-198.
5. Янкаускас С.С., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Эффекты митохондриальноадресованного антиоксиданта SkQR1 на почечную недостаточность после
ишемии/реперфузии. 21-й съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова,2010,
Калуга, с.720-721.
6. Jankauskas S.S., Plotnikov E.Y., I.B. Pevzner, V.P. Skulachev, D.B. Zorov.
Mitochondria-targeted antioxidants prevented ischemic injury of kidney. 16th European
Bioenergetics Conference, 2010, Poland, Warsaw, Biochimica et Biophysica Acta, 2010,
1797 (Suppl.), р. 59-60.
7. Янкаускас С.С. Окислительный стресс и повреждение почечной ткани
предотвращаются митохондриально-адресованным антиоксидантом SkQR1.
Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных
«Ломоносов-2010», 2010, Москва, с. 1-2.
8. Jankauskas S.S., A.A. Chupyrkina E.Y. Plotnikov, A.V. Kazachenko, I.V.
Kirpatovsky, D.B. Zorov. Effects of mitochondria-targeted antioxidants on acute renal
failure. EuroNanoMedicine 2009, 2009, Slovenia, Bled, p. 96.
22