Набор реагентов для типирования генов гистосовместимости

Регистрационное удостоверение
№ФСР 2008/03891
117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
Е-mail: [email protected]
www.dna-technology.ru
Набор реагентов для типирования генов гистосовместимости
человека (HLA) II класса методом амплификации ДНК
HLA-ДНК-ТЕХ
Комплект реагентов для типирования гена DRB1
Информация о комплекте
Назначение:
Комплект реагентов HLA DRB1 предназначен для одновременного определения 14 групп аллелей гена DRB1
главного комплекса тканевой совместимости человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме
реального времени.
Метод:
Полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени; качественный анализ.
Материал для исследования:
Периферическая кровь.
Выделение ДНК:
Рекомендуются комплекты реагентов для выделения ДНК ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА и ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА (ООО
«НПО ДНК-Технология»).
Особенности комплекта:
Одновременная детекция – в одной пробирке определяются несколько ДНК-мишеней.
Внутренний контрольный образец DRB1 (ВК DRB1) – позволяет программному обеспечению прибора произвести
оценку результатов ПЦР в каждой пробирке.
Внутренний контрольный образец (ВК) – необходим для контроля прохождения полимеразной цепной реакции.
Контроль взятия материала (КВМ) – позволяет определить, достаточно ли полученного количества ДНК для
анализа.
Маркер – используется прибором для определения положения стрипованных пробирок (стрипов) в плашке.
Приборное обеспечение:
Амплификаторы детектирующие (ООО «НПО ДНК-Технология») ДТлайт1, ДTпрайм2 и ДТ-96; версия программного
обеспечения не ниже 7.3.5.57.
Количество определений:
24
Состав комплекта:






1
2
Реактив
Смесь для амплификации, запечатанная парафином,
стрип A
Смесь для амплификации, запечатанная парафином,
стрип Б
Раствор Taq-полимеразы
Минеральное масло
Положительный контрольный образец «К+» DRB1
Положительный контрольный образец «К+» КВМ
Количество
20 мкл
24 стрипа по 8 пробирок
20 мкл
960 мкл
960 мкл
150 мкл
150 мкл
24 стрипа по 8 пробирок
4 пробирки
8 пробирок
2 пробирки
1 пробирка
– только модели 4S1; 4S2; 5S1; 5S2; 6S1; 6S2.
– только модели 4M1; 4M3; 4M6; 5M1; 5M3; 5M6; 6M1; 6M3; 6M6.
Состав стрипов, цветовая маркировка и каналы детекции продуктов амплификации
№
пробирки
в стрипе
Каналы детекции продуктов амплификации
Fam
Hex
Rox
1
2
3
4
5
6
7
8
01
03
04
07
08
09
10
11
ВК DRB1
ВК
ВК DRB1
ВК
Маркер
-
1
2
3
4
5
6
7
8
12
13а
13b
14
1403
15
16
КВМ
ВК DRB1
ВК DRB1
ВК
ВК DRB1
ВК
Маркер
Cy5
Стрип А
Стрип Б
-
Цвет смеси для
амплификации
Цвет парафина
Cy5.5
-
Голубой
Бесцветный
Белый
Голубой
Бесцветный
Голубой
Инструкция по применению
1.
Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции
1.1.
Промаркируйте по одному стрипу А и стрипу Б со смесями для амплификации для каждого исследуемого
образца, отрицательного контрольного образца, положительного контрольного образца.
Например, необходимо проанализировать 4 образца. Нужно промаркировать четыре стрипа А и четыре
стрипа Б для исследуемых образцов; один стрип А и один стрип Б для «K–»; один стрип А и один стрип
Б для «К+». Общее количество стрипов – 12.
Внимание! Рекомендуется проводить исследование отрицательного контрольного образца («K–»),
прошедшего пробоподготовку, и положительного контрольного образца не реже, чем один раз на
каждую серию реактивов.
1.2.
Встряхните пробирку с раствором Taq-полимеразы в течение 3–5 сек на микроцентрифуге/вортексе и
центрифугируйте в течение 1–3 сек.
1.3.
Добавьте в каждую пробирку стрипов, не повреждая слой парафина, по 10 мкл раствора Taqполимеразы.
1.4.
Добавьте в каждую пробирку стрипов по 1 капле (около 20 мкл) минерального масла. Закройте крышки
стрипов.
1.5.
Примечание. Для предотвращения контаминации следует перед внесением ДНК открывать крышки
только тех стрипов, в которые будет вноситься данный образец, и закрывать их перед внесением
следующего. Препараты ДНК следует вносить наконечниками с аэрозольным барьером.
Внесите в каждую пробирку стрипов для исследуемых образцов, не повреждая слой парафина, по 5,0
мкл выделенного из образцов препарата ДНК.
1.6.
Внесите, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего
все этапы пробоподготовки, в пробирки стрипов, маркированных «K–». Внесите, не повреждая слой
парафина, по 5,0 мкл положительного контрольного образца в соответствующие пробирки стрипов,
маркированных «K+»:
«К+» DRB1 вносится во все пробирки стрипа A и в пробирки 1 – 7 стрипа Б;
«К+» КВМ вносится в пробирку 8 стрипа Б.
1.7.
Центрифугируйте пробирки на микроцентрифуге/вортексе в течение 1–3 сек.
1.8.
Установите все пробирки в блок амплификатора детектирующего.
1.9.
Запустите программное обеспечение RealTime_PCR в режиме «Работа с прибором». При первом
проведении ПЦР загрузите файл «HLA.ini». При последующих постановках добавьте в протокол тест
«DRB1», укажите количество и идентификаторы образцов, в том числе отрицательного и
положительного контрольного образцов, отметьте расположение пробирок на матрице термоблока в
соответствии с их установкой (п.1.8) и проведите ПЦР.
2.
Регистрация и учёт результатов ПЦР проводится автоматически программным обеспечением для
амплификаторов детектирующих. Специфичности гена HLA DRB1 для каждого образца определяются
программным обеспечением с учетом совокупности результатов по каждой пробирке для этого образца.
При этом у исследуемых образцов может определяться как одна специфичность, так и сочетания
специфичностей (Приложение, таблица 1).
Внимание! Cp для КВМ должен быть ≤32,0. В случае, если Cp КВМ более 32,0, недостоверные или
сомнительные результаты генотипирования трактуются оператором как недостаточное для анализа
количество ДНК.
Если у исследуемого образца определяются специфичности в пробирке 2 стрипа А (*03) и в пробирке 5
стрипа Б (*1403), а Cp КВМ ≤29, то будет получен сомнительный результат генотипирования. В этом
случае образец необходимо развести в 10 раз и повторно провести ПЦР для этого образца. Для
разведения можно использовать элюирующий буфер из комплекта реагентов для выделения ДНК (при
использовании для выделения ДНК комплекта ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА допускается разведение
образца отрицательным контрольным образцом, прошедшим пробоподготовку).
Условия хранения и эксплуатации
Комплект следует хранить при температуре 2–8°С в течение всего срока годности.
Срок годности комплекта – 6 месяцев с даты изготовления.
По вопросам, касающимся качества набора реагентов для типирования генов гистосовместимости человека (HLA)
II класса методом амплификации ДНК (HLA-ДНК-ТЕХ), следует обращаться к официальному представителю
производителя по адресу:
ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
E-mail: [email protected], www.dna-technology.ru
Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
Приложение.
Таблица 1
Интерпретация результатов ПЦР для типирования гена DRB1
Специфичность гена HLA DRB1
№
стрипа
А
Б
№
пробирки
Смесь
1
01
2
03
3
04
4
07
5
08
6
09
7
10
8
11
1
12
2
13а
3
13b
4
14
5
1403
6
15
7
16
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
DRB1
*01
*03
*04
*07
*08
*09
*10
*11
*12
*13
*14
*1403
*15
*16
+
+/-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/-
+
+
+
?1
+2
+
+
Условные обозначения:
+ - работает всегда;
+/- - может как работать, так и не работать.
1
– если у исследуемого образца определяются специфичности в пробирке 2 стрипа А (*03) и в пробирке 5 стрипа Б (*1403), а Cp КВМ ≤29, то будет получен
сомнительный результат генотипирования. В этом случае образец необходимо развести в 10 раз и повторно провести ПЦР для этого образца;
2
– если образец гомозиготен по *1403, то генотип образца определяется как *13,*1403.
Номер:208
16.12.11