НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК КАФЕДРА ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ Разработка метода определения аллелей гена DRB1 системы HLA Кечин Андрей Научный руководитель: к.б.н. Боярских У. А. Институт химической биологии и фундаментальной медицины 1 Введение: Что такое HLA? • HLA (MHC) – важнейшая роль в распознавании «свой-чужой» • Анализ обязателен перед трансплантациями и ЭКО • С некоторыми аллелями генов HLA ассоциированы c заболевания • 2 основных класса: I и II • MHC II класса: DR 2 Введение: Строение DR • • • • • Аллели DRB1 Из α- и β-цепей α кодируется геном DRA β – DRB1, DRB3, DRB4 и DRB5 DRB1 – 1094 аллеля DRB3, DRB4 и DRB5, а также псевдогены DRB2, DRB6, DRB7, DRB8 и DRB9 присутствуют в геноме только для некоторых гаплотипов * Дополнительные гены/псевдогены *01, *10 *08 *15, *16 DRB6, DRB9 DRB9 DRB5, DRB6, DRB9 *03, *11, *12, *13, *14 DRB3, DRB2, DRB9 *04, *07, *09 DRB4, DRB7, DRB8, DRB9 * Gongora, R., Figueroa, F. & Klein, J. The HLA-DRB9 gene and the origin of HLA-DR haplotypes. Human immunology 51, 23–31 (1996). 3 Введение: Методы типирования DRB1 • 3 основных метода: SSP, rSSO и SBT • SSP (аллель-специфические праймеры) – дешевый, трудозатратный и медленный (14 ПЦР: 19 праймеров+28 флуоресцентных зондов*) • rSSO (аллель-специфические олигонуклеотиды) – быстрый и дорогой • SBT (типирование, основанное на секвенировании) – требует специального оборудования, средний по стоимости • Метод SBT: 8 ПЦР -> 1-2 секвенирований *Method and kit for the genotypification of hla-drb based on real time pcr, EP1743946 A1, 2004 4 Введение: метод SBT Метод SBT: 8 ПЦР -> 1-2 секвенирований Название Последовательность * DRB1*01 CACGTTTCTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATGTCATTTCTTC AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTGCTGGAAAGATGCATCT ATAACCAAGAGGAGTCCGT CACGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCTGAGTGTCATTTCTTC AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTACCTGGACAGATACTTCC ATAACCAGGAGGAGAACGT CACGTTTCTTGKRGYASYYTAMGTYTGARTGTCATTTCTTC AATGGGACGGAGCGGGTGCGGTWSCTGGAMAGATRCWTC YATAACCARGAGGAGWMCGT DRB1*03 Гетерозигота *приведены только первые 100 нуклеотидов второго экзона гена DRB1 5 Введение: метод SBT Результат Blast IMGT/HLA, если не разбивать на 8 групп: Но на самом деле генотип DRB1*01/DRB1*03! 6 Цель и задачи работы Разработать новый метод определения аллелей гена DRB1 Задачи: 1.Разработка программы для анализа полученных в результате секвенировании последовательностей, позволяющей выявлять оптимальное сочетание аллелей. 2.Разработка метода специфичной амплификации второго экзона гена DRB1. 3.Сравнение результатов типирования DRB1 с использованием метода, разработанного нами, и референсного метода SBT. 7 Результаты: Разработана программа Интерфейс программы 8 Результаты: Разработана программа Алгоритм программы Последовательность Функция выравнивания Функция сравнения Генотип Выбор сочетания аллелей 9 Результаты: Разработана программа Алгоритм программы Номера аллелей в списке Введенная последовательность AGSTCCYCGCG AGCTCCTCGCG – 1й аллель AGGTCCCCGCG – теоретический аллель Число совпавших нуклеотидов между вторым аллелем и введенной последовательностью Число совпавших нуклеотидов между вторым аллелем и теоретическим аллелем 10 Результаты: Разработана программа Преимущества разработанной программы • Позволяет не разбивать аллели на несколько групп • Результат программы – не список нескольких аллелей, а конкретное сочетание 2х аллелей 11 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Попытка мультиплексной аллель-специфической ПЦР с восьмью прямыми праймерами и 1 обратным (подход № 1) 1 1/4 Генотип по разрабатываемому методу 1/DRB6*01, 4/DRB6*01 2 3/14 14/DRB3*02 3 7/10 7/10 4 8/16 16 5 3/9 3/9 6 11/13 11/DRB3*03, 13/DRB3*03 7 4/12 4/12, 13/DRB3*02 8 1/15 15 Образец Генотип по методу SBT 12 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Подходы Мультиплексная аллельспецифичная ПЦР (5 групп-специфичных реакций) 1 пара общих праймеров+ ингибирующие пробы Подход № 2 Подход № 3 В качестве референсного метода использовался SBT 13 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Конструирование праймеров для подхода № 2 Красный – 1й групп-специфичный праймер Фиолетовый – 2й групп-специфичный праймер Черный – 3 праймера для аллелей 4, 9 и 10 14 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Проблема «неспецифичности» ПЦР 328 242 328 242 Электрофореграмма амплифицированных ДНК-образцов, 8 %-ный ПААГ 1, 2, 3, 4 – образцы различных генотипов M – маркер pBlueScript Msp I Электрофореграмма амплифицированных ДНКобразцов, 12 %-ный денатурирующий ПААГ 15 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Проверка подхода №2 5 групп-специфичных прямых праймеров и 1 обратный – в одной ПЦР-смеси 1, 7, 15, 16 3, 8, 11-14 4 9 10 Общий обратный № Обр Генотип по методу SBT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 7/10 4/8 1/15 11/13 4/12 11/15 8/16 3/9 13/15 Генотип по разрабатываемому методу 7/10 4/8 1/15 11/13 4/12 11/15 8/16 3/9 13/15 16 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Конструирование праймеров для подхода № 3 Красный – общий для всех аллелей прямой праймер Фиолетовый, черный и желтый – ингибирующие пробы для DRB3, DRB4678 и DRB5, соответственно 17 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Проверка подхода №3 18 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Проверка подхода №3 * ** Генотип образца DRB1*13/DRB1*13 Сверху – без ингибирующей пробы Снизу – с ингибирующей пробой * - G – от DRB3*02, A – от DRB1*13; ** - C – от DRB3*02, G – от DRB1*13 * ** 19 Результаты: Разработан метод амплификации гена DRB1 Типирование образцов референсным методом SBT •Пациенты – доноры крови Областной клинической больницы г. Новосибирска •ДНК была выделена из лейкоцитарной массы 50 образцов стандартным методом и очищена экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждена этанолом •Типирование образцов методом SBT: проведение 8ми аллель-специфичных амплификаций с последующим секвенированием и анализом полученной последовательности с помощью Blast 20 Результаты: Сравнение результатов типирования ДНК-образцов методом, разработанным нами, и методом SBT • • • Сравнение подхода №2: при использовании мультиплексной аллель-специфичной амплификации с 5-ю прямыми праймерами Получено 100 % совпадение результатов Коамплификации генов-паралогов или псевдогенов не наблюдалось 21 Выводы 1. Разработана программа для анализа полученных в результате секвенирования последовательностей, позволяющая определять генотип образца по гену DRB1. 2. Наилучшим методом специфичной амплификации второго экзона гена DRB1 была выявлена мультиплексная аллельспецифичная ПЦР с использованием пяти прямых праймеров и одного обратного. 3. Результаты типирования DRB1 разработанного нами метода подтверждались референсным методом SBT, совпадение – 100%. 22 Образец Генотип по методу SBT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1/4 13/13 11/11 4/10 10/11 3/14 7/16 3/16 3/4 7/14 1/4 3/7 1/10 11/11 11/11 10/15 3/11 3/15 3/13 3/15 4/7 Генотип по разрабатываемому методу 1/4 13/13 11/11 4/10 10/11 3/14 7/16 3/16 3/4 7/14 1/4 3/7 1/10 11/11 11/11 10/15 3/11 3/15 3/13 3/15 4/7 23 Образец Генотип по методу SBT 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 7/15 9/11 1/15 1/11 8/14 1/11 7/7 3/12 7/12 15/15 7/8 13/15 1/7 3/7 4/15 14/15 1/7 4/13 4/7 10/16 Генотип по разрабатываемому методу 7/15 9/11 1/15 1/11 8/14 1/11 7/7 3/12 7/12 15/15 7/8 13/15 1/7 3/7 4/15 14/15 1/7 4/13 4/7 10/16 24 Введение: Какие классы? MHC • • • • MHC I класса У большинства клеток Тяжелая цепь + β2m Узнаются CD8+-T-клетками HLA-A, HLA-B* и HLA-C • • • • MHC II класса Только у АПК α+β Узнаются CD4+-T-клетками DP, DQ, DR* * Наиболее полиморфные антигены своего класса 25 Введение: Методы анализа DRB1 DRB1*03:01:01:01 Параметр Стоимость (руб., за 25 тестов) Число операций для 1 анализа Время анализа, ч Количество тестов за 1 прогон SSP rSSO SBT 6500 50000 7-10 13+13 2 8+8+2 3-4 1,5-2 2-6 1-10 До 96 До 96 26