ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В КЛЕТКАХ

1
ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ СРЕДНЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН
БАШКИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ
Исследовательская работа
ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В КЛЕТКАХ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В РАЗЛИЧНЫХ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ГРУППАХ
Работа выполнена: студент 3 курса Р. Г. Фазылова
Научный руководитель: преподаватель методов клинических
лабораторных исследований Кудакаева Т.Г.
Научный консультант: ассистент кафедры биологии БГМУ Волкова А.Т.
г. Уфа, 2011
2
Введение
Изучение
влияния
вредных
факторов
окружающей
среды
на
генетический аппарат человека является одной из основных проблем
экологической генетики. Усилия многих исследователей направлены на
выявление мутагенов и оценку их потенциальной генетической опасности.
Хромосомы человека очень чутко реагируют на любое воздействие,
начиная от электрических приборов (особенно компьютеров), вирусной
инфекции (грипп, гепатит и т.п.) и заканчивая загрязнением окружающей
среды. Закономерности спонтанной хромосомной изменчивости в соматических
клетках
(хромосомные
аберрации,
анеуплоидии) используются
сестринские
хроматидные
обмены,
в качестве биологической популяционной
характеристики и при изучении влияния вредных факторов окружающей среды
(радиация, химические соединения) на генетический аппарат клеток [2,3], что
позволяет рассматривать их как одну из возможных причин ухудшения здоровья
в экологически неблагоприятных условиях [5]. Кроме того, повышенная
частота спонтанных хромосомных аберраций может являться причиной
бесплодия и развития онкологических заболеваний [5].
Цитогенетический
анализ
является
сегодня
одним
из
наиболее
разработанных методов биологической индикации и дозиметрии мутагенного
воздействия различной природы [8].
Цель исследования: изучить уровень хромосомных аберраций (ХА) в клетках
периферической крови в группе студентов 1 курса и двух бесплодных
супружеских пар.
Поставленная в работе цель может быть достигнута в результате решения
следующих задач:
1. Освоить методику приготовления хромосомных препаратов из клеток
периферической венозной крови.
2. Приготовить хромосомные препараты высокого качества для анализа
хромосомных аберраций.
3
3. Проанализировать от 50 до 100 метафазных пластин у каждого индивида
контрольной группы студентов и двух бесплодных супружеских пар.
4. Провести статистический анализ и интерпретировать полученные
результаты.
Обзор литературы
В обновляющихся тканях организма, как в нормальных условиях, так и
после
мутагенных
воздействия
осуществляется
эффективный
отбор
и
элиминация мутагенных клеток. Очень значительные генетические изменения не
являются препятствием для вступления части клеток в митотический цикл и
последующего деления. Однако клетки, имеющие множественные ХА (более
трех разрывов хромосом), как правило, могут пройти лишь один митотический
цикл, а длительность их жизни ограничена, примерно до 30 ч. Клетки с 1-2
разрывами хромосом способны сохранять жизнеспособность в течение
длительного времени после повреждения и проходить, по крайней мере, 4
митотических цикла. Тем не менее, их доля постепенно снижается, что связано с
преимущественным размножение клеток без аберраций и постепенным
замещением мутантных клеток [7].
Изменение среды существования человека находит свое отражение в
величине спонтанного уровня хромосомных аберраций. Цитогенетические
исследования населения г. Уфы были проведены Т.В.Викторовой и др. [4], где
описано
значительное
повышение
частоты
метафаз
с
аберрантными
хромосомами в опытной группе (5,3%), состоящей из рабочих производства
пиромеллитового
диангидрита
(применяется
в
нефтехимической
промышленности при получении высокотермостойких полимерных материалов),
по сравнению с контролем (2,9 %). Основная доля хромосомных нарушений в
обеих исследованных группах приходилась на одиночные и парные фрагменты
(90% и более).
Аналогичные данные были получены Л.М. Бердиной и др. [1] при изучении
частоты и спектра ХА у рабочих цеха высших жидких спиртов (ВЖС)
4
нефтеперерабатывающего завода г. Уфы. Средняя частота структурных
хромосомных перестроек в периферических лимфоцитах рабочих производства
составила в среднем 5,6. Преобладающее число нарушений приходится на
ацентрические одиночные и парные фрагменты, частота которых составила
несколько более 90 %, в то время как остальные аберрации, в частности
хроматидные и хромосомные обмены, встречаются менее, чем в 10 % случаев. В
контрольной группе лишь у 60, 98 % лиц частота структурных перестроек
оказалась не выше 3 %. У рабочих цеха ВЖС не более 3 % хромосомных
аберраций имели всего около 20 % обследуемых индивидов.
Материал и методика исследования
Изучены цитогенетические показатели у 5 студентов в возрасте 18- 20 лет (3
– мужского пола, 2 – женского пола) и двух бесплодных супружеских пар
(первая пара: ♂ 35 лет, ♀ 36 лет, вторая пара: ♂ 42 лет, ♀ 36 лет). На каждого
человека заполняли анкету, включавшую данные о возрасте, вредных привычках
(курение, алкоголь), болезнях, приеме лекарств, рентгенодиагностических
процедурах в течение полугода, предшествовавшего цитогенетическому
обследованию. Венозную кровь медперсонал лаборатории забирал из
локтевой вены в шприцы, предварительно промытые раствором гепарина.
Для всех обследованных лиц проведен стандартный цитогенетический
анализ лимфоцитов венозной крови. Кровь культивировали в питательной
среде, содержащей 85 % среды F-12, 15 % эмбриональной телячьей
сыворотки и фитогемагглютинина («Sigma», США) при температуре 37 С.
Фиксацию культур проводили на 72-м ч культивирования. За 2 ч до
окончания культивирования вводили 100 мкл колхицина в концентрации
0,05
мкг/мл.
Дальнейшую
обработку
лимфоцитов
проводили
по
общепринятой методике: гипотонизация 0,55 %-м раствором КCl, фиксация
смесью этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1,
раскапывание
клеточной
суспензии
на
охлажденные
обезжиренные
5
предметные стекла. Рутинную окраску хромосом проводили красителем
Гимза, приготовленным на фосфатном буфере.
Хромосомный анализ проводили с помощью микроскопа марки PZO
warszawa при малом
(10х20) и большом (10х100) увеличении. Отбор
метафазных пластинок осуществляли с учетом следующих требований:
цельность метафазной пластинки, четкость окраски (пробелы
в окраске не
считали хромосомной аберрацией [6], отсутствие или 1-2 поперечных наложений
хромосом, средняя степень конденсации, обособленность метафазных пластинок
друг от друга. У каждого индивида было исследовано от 50 до 100 метафазных
пластинок. Всего было изучено 593 метафазных пластинок, из которых для
анализа были отобраны 506 клеток. При анализе регистрировали все аберрации
хроматидного и хромосомного типа согласно рекомендациям Н.П.Бочкова и др.
[2] и М.Б. Фрейдину и др. [8]. Все метафазные пластины с хромосомными
аберрациями были сфотографированы.
Для
сравнительного
анализа
частоты
аберрантных
клеток
в
экспериментальных группах использовался критерий хи-квадрат (χ2).
Результаты исследования и их интерпретация
В табл. 1 показано распределение индивидов по числу метафаз с
аберрациями. Только двое среди исследованных лиц имеет частоту хромосомных
аберраций до 3%., что является средне-статистической нормой, согласно
литературным данным [4] при анализе спонтанных хромосомных аберраций в
ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов периферической крови человека
в 96,8% случаев выявляется 0 – 3% клеток с аберрациями хромосом.
Двое студентов, которые приехали из г. Норильска имеют уровень хромосомных
аберраций до 7 %. Норильск относится к десятке самых загрязненных городов
мира с металлургической промышленностью.
Один студент имеет уровень ХА равным 7%, который родом из
Салаватского района из населенного пункта, где идет добыча минерального
сырья.
6
Таблица 1.
Распределение индивидов по частоте метафаз с хромосомными аберрациями
Уровень клеток с хромосомными
Число обследованных
индивидов
абберациями, %%
0,0-3,0
3,1-6,9
7,0
2
2
1
Студенты - 5 чел.
Супружеские пары 4 чел.
>10,0
4
Бесплодные супружеские пары имеют самый высокий уровень ХА 0,12+0,011, а у студентов – 0,052+0,007 (табл.2). Эти различия статистически
достоверны χ2=7,81 при р=0,005.
Супружеские пары характеризуются достоверно высокой частотой встреч
одиночных фрагментов (табл.2) χ2=6,92 при р=0,009.
Сравнительный спектральный анализ хромосомных аберраций показал, что
основная доля хромосомных нарушений у супружеских пар приходится на
одиночные фрагменты – 41,6%, у студентов – на группу ХА, которая включает
транслокации, делеции – 46,7%. Доля анеуплоидных клеток среди супружеских
пар составляет 29,16%, среди студентов – 6,6 %.
Таблица 2.
Средняя частота (с ошибкой) цитогенетических показателей в различных
экспериментальных группах с разным уровнем ХА
Цитогенетический показатель
Частота аберрантных клеток (%)
Частота парных фрагментов на 100 клеток
Частота одиночных фрагментов на 100 клеток
Частота дицентрических и кольцевых
хромосом на 100 клеток
Частота анеуплоидных клеток на 100 клеток
Частота других видов хромосомных аберраций
на 100 клеток
Частота полиплоидных клеток на 100 клеток
M+m
Супружеские
Студенты
пары
0,12+0,011
0,052+0,0073
0,02+0
0,029+0
0,05+0,12
0,01+0,004
0
0,014+0
0,02+0,008
0,01+0
0,01+0,006
0,02+0,007
0,02+0
0
7
0,0900
0,0800
0,0700
0,0600
0,0500
Супружеские пары
Студенты
0,0400
0,0300
0,0200
0,0100
Частота
полиплоидных
клеток
Частота
дицентрических
хромасом
Частота парных
фрагментов
Частота
одиночных
фрагментов
Частота
аберрантных
клеток
0,0000
Рис.1. Средняя частота цитогенетических показателей в экспериментальных
группах с разным уровнем ХА (относительно общего числа исследованных
клеток)
Заключение
В целом результаты проведенного цитогенетического анализа хромосомных
аберраций позволяют сделать заключение о том, что комплекс вредных
факторов
окружающей
среды
оказывает
генотоксическое
влияние
на
генетический аппарат человека, что выражается в существенном повышении
уровня цитогенетической нестабильности хромосом обследованных индивидов и
бесплодные супружеские пары имеют высокий уровень ХА.
Выводы:
1. Средняя частота аберрантных клеток у обследованных супружеских пар
составила 8,0%, а у студентов –1,97% (рис. 1).
2. Сравнительный спектральный анализ хромосомных аберраций показал,
что основная доля хромосомных нарушений у супружеских пар приходится на
одиночные фрагменты –62%, у студентов – также на одиночные фрагменты –
58%.
3. Бесплодные супружеские пары по сравнению с контрольной группой
студентов имеют высокий уровень ХА и частоту встреч одиночных фрагментов.
8
Эти различия показывают статистически достоверный характер, т.к. уровень
значимости по критерию χ2 значительно меньше 0,05.
Литература
1. Бердина Л.М., Хуснутдинова Э.К. Цитогенетический мониторинг рабочих
нефтеперерабатывающего завода. – Медицинская генетика, 2005, № 4, с.158
2. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. Классификация и методы учета
хромосомных
аберраций в соматических
клетках // Генетика . 1972. Т.
8. № 5. С. 133-141
3. Бочков Н.П., Н.А. Попова, Л.Д. Катосова, Ю.С. Яковлева, С.А. Назаренко, Е.О.
Васильева, В.И. Платонова, А.Н. Чеботарев Необычайно высокий уровень
хромосомной
изменчивости в культуре лимфоцитов периферической крови
человека. – Генетика, 1999, т. 35, №6, с. 838-841
4. Викторова Т.В., Хуснутдинова Э.К., Викторов В.В., Ляпунова Н.А., Рафиков
Х.С. Анализ хромосомных аберраций и ядрышкообразующих районов хромосом
у рабочих производства пиромеллитового диангидрида: о возможной адаптивной
роли вариантов Ag-ЯОР. – Генетика, 1994, т. 30, №7 с. 992-998
5. Воробцова И.Е., Тимофеева Н.М., Богомазова А.Н. Возрастная зависимость
частоты стабильных хромосомных аберраций, определяемых методом FISH, в
лимфоцитах здоровых доноров и лиц, подвергшихся неконтролируемому
облучению в малых дозах. - Российский биомедицинский журнал Medline. ru, т.4,
ст.79 (с. 125-127) // Март, 2003 г.
6. Захаров А.Ф. Хромосомы человека. – М., Медицина, 1977
7.
Кузин
С.М.
Критерии
и
факторы
отбора
мутагенных
клеток
с
цитогенетическими нарушениями в обновляющихся тканях организма. –
Медицинская генетика, 2005, № 5, с.213
8. Фрейдин М.Б., Васильева Е.О., Скобельская Е.В., Гончарова И.А., Карпов
А.Б., Тахауов Р.М. Частота и спектр хромосомных аберраций у работников
Сибирского химического комбината.- Бюллетень сибирской медицины, 2005,
№2, с. 75-82
9
Приложение
10
11
12