УДК: 612.014.482+575+616-097.001.6 На правах рукописи
реклама
УДК: 612.014.482+575+616-097.001.6 На правах рукописи МАДИЕВА МАДИНА РАШИДОВНА Отдаленные цитогенетические и соматические последствия у населения, проживающего вблизи СИЯП, и состояние иммунного статуса под влиянием различных доз γ-излучения (клинико-экспериментальное исследование) 03.00.01 - Радиобиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Республика Казахстан Астана, 2010 Работа выполнена в Государственном медицинском университете г. Семей Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Жетписбаев Б.А. доктор медицинских наук, профессор Чайжунусова Н.Ж. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Каракулов Р.К. доктор медицинских наук, профессор Кауашев С.К. доктор медицинских наук, профессор Муксинова К.Н. Ведущая организация: Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медикобиологического агентства России, г. Челябинск Защита диссертации состоится «28» декабря 2010 г., в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 09.17.04. при АО «Медицинский университет Астана» по адресу: 010000, г. Астана, ул. Бейбитшилик, 49 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АО «Медицинский университет Астана» по адресу: 010000, г. Астана, ул. Бейбитшилик, 53. Автореферат разослан: « 24 » ноября 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Мустафина Р.Х. Введение Актуальность проблемы. Мировое сообщество многие годы волнует проблема последствий воздействия ионизирующего излучения на организм человека. Оценка возникающих при этом отдаленных результатов сопряжена с трудностью определения роли некоторых факторов (в частности, радиационного) в ухудшении здоровья облученных лиц и их потомства, поскольку нередко наблюдается как простая суммация их отрицательных эффектов, так и взаимное усиление негативных воздействий [Пилинская М.А., 2008; Вельтищев Ю.Е., 1998]. Последствия радиационного влияния могут быть не только результатом прямого действия ионизирующего излучения на организм, но и отсроченного, через поколения родителей и прародителей. Согласно принятой радиобиологической гипотезе, любой, сколь угодно малый уровень облучения представляет определенный риск возникновения отдаленных медицинских последствий у облученных людей и у их потомков первых двух поколений [Ярмоненко С.П., 2000; Гордеев В.В., 2002; Черкашина А.Г., 2007]. Несмотря на существование различных теорий биологического действия малых доз ионизирующих излучений, большинство авторов придает первостепенное значение повреждениям ДНК в проявлении генетических эффектов ионизирующего излучения [Абильдинова Г.Ж., 2003; Sevan’kaev A.V.et al, 2008]. В целом, закономерности выхода генетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости и определяется их чувствительность к внешним воздействиям [Tawn E.J. et al,, 2006]. Одним из подходов в оценке радиационных последствий является проведение биологической индикации, основанной на изучении цитогенетических эффектов в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в различных диапазонах доз. Культура лимфоцитов периферической крови человека представляет собой простую и вместе с тем уникальную по своим свойствам модель для исследований по индуцированному мутагенезу [Замулаева И.А., 2003]. На сегодняшний день цитогенетические исследования являются неотъемлемой частью практически всех международных эпидемиологических программ по изучению воздействия мутагенных факторов на популяцию человека [Бочков Н.П., 2001]. В настоящее время накоплены убедительные доказательства тому, что наиболее тонким и чувствительным индикатором внешнего, и в том числе экологического, влияния на организм человека является состояние иммунной системы [Хаитов Р.М. с соавт., 2005], которая поддерживает антигенный гомеостаз в организме и обеспечивает регуляцию процессов пролиферации и дифференцировки клеточных элементов в гемо- и иммунопоэзе [Жетписбаев Б.А. с соавт., 2006]. Радиационное воздействие вызывает ряд изменений в иммунной системе на клеточном и субклеточном уровнях, а формирующиеся дефекты лежат в основе патогенеза целого ряда заболеваний (рост онкологических заболеваний, увеличение частоты аллергических заболеваний, 3 числа хронических воспалительных заболеваний разной локализации) [Кулжанова Ш.А., 2009; Махамбетов К.О., 2009; Тахауов Р.М. с соавт., 2005]. Современные оценки радиационного риска заболеваемости, смертности, сокращения продолжительности жизни основаны на эпидемиологических исследованиях различных групп пострадавших, величине дозы облучения и условий реализации эффектов (возраст, образ жизни, характер производственной деятельности, состояние иммунитета, генетические особенности, прочие факторы риска). Без учета этих модифицирующих факторов перенос результатов исследования одной группы людей на другую, как с целью прогноза, так и разработки реабилитационно-профилактических программ может оказаться недостаточным. Поэтому научный комитет ООН по действию атомной радиации придает особое значение «любым исследованиям по влиянию облучения на человека, где это только возможно». Оценка отдаленных последствий для потомков лиц, подвергавшихся ионизирующему излучению от деятельности Семипалатинского испытательного ядерного полигона (СИЯП) не теряет своей актуальности по настоящее время. Естественно происходящая смена поколений привела к тому, что большинство населения, имеющего отношение к радиационным ситуациям в прошлом, составляют лица, рожденные от облученных родителей [Ким А.Л., 2009; Изатова А.Е., 2006]. Отсутствие научно разработанных критериев связи опосредованного влияния радиационного фактора на состояние здоровья лиц, родители которых подвергались прямому радиационному воздействию, обусловило актуальность проведения настоящего исследования. Цель работы: оценить отдаленные цитогенетические последствия хронического воздействия ионизирующего излучения, риски развития соматической заболеваемости у населения, проживающего вблизи СИЯП, и состояние иммунного статуса под влиянием различных доз γ-излучения в эксперименте. Задачи исследования: 1. Определить уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у населения, непосредственно подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения и на основе обнаруженных стабильных аберраций, провести расчет индивидуальных доз. 2. Определить уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у их потомков. 3. Провести анализ и рассчитать риски распространенности соматической заболеваемости у жителей изучаемых районов, и их потомков. 4. Провести сравнительную оценку нарушений иммунного статуса у населения, проживающего на «загрязненных» территориях. 5. Экспериментально изучить отдаленные последствия воздействия различных доз γ-излучения на клеточное звено иммунитета и на состояние центральных и периферических лимфоидных органов иммуногенеза белых крыс. 4 6. Экспериментально изучить влияние различных доз γ-излучения на гуморальное, неспецифическое фагоцитарное звено иммунитета и цитокиновый профиль в отдаленном периоде. 7. Провести анализ состояния иммунной системы у потомков облученных белых крыс. Научная новизна Впервые установлено, что в лимфоцитах периферической крови у жителей, проживающих вблизи СИЯП, в отдаленном пострадиационном периоде обнаружена высокая частота стабильных и нестабильных хромосомных аберраций, уровень которых превышает контрольный. Полученные данные по частоте стабильных хромосомных аберраций позволили провести индивидуальный расчет дозы хронического облучения. У потомков, рожденных от лиц, непосредственно подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения, выявлены хромосомные аберрации нестабильного типа, превышающие контрольные значения. На основании сформированных групп из населения изучаемых районов и их потомков, оценены риски развития соматической заболеваемости. Определено, что степень реализации соматических эффектов, вызываемых ионизирующим излучением, была выше в отношении болезней крови и кроветворных органов, эндокринной системы, системы кровообращения, органов дыхания, костно-мышечной системы. Проведена сравнительная оценка иммунного статуса у исследуемого населения и у лиц, подвергавшихся ионизирующему излучению. Доказано экспериментально, что в отдаленном периоде после воздействия разных доз гамма-излучения происходят неоднозначные изменения со стороны основных звеньев иммунной системы. После сублетальных и фракционированных доз гамма-излучения наблюдается: в клеточном звене активация функционального состояния, а малые дозы - вызывают супрессию, в гуморальном звене отмечается депрессия, после малых доз – повышение абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов, в сыворотке крови содержание провоспалительных цитокинов снижено и повышено после малых доз, происходит активация неспецифической фагоцитарной резистентности организма животного. Изучение состояния иммунного статуса у потомков облученных белых крыс показало, что иммунологические нарушения были обусловлены повышением содержания В-лимфоцитов, снижением количества субпопуляций общих Т-лимфоцитов, лимфоцитов с хелперной активностью и иммунорегуляторного индекса. 5 Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты доказывают, что учет хромосомных аберраций – один из наиболее чувствительных из всех биологических методов для людей, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения в прошлом, и, что стабильные аберрации продолжают существовать и после прекращения радиационного воздействия, и являются одним из достоверных способов реконструкции биологических доз, полученных населением при радиационных инцидентах прошлых лет. Результаты клинико-эпидемиологического исследования могут служить основанием для последующей разработки программ диагностики, лечения и реабилитации населения, пострадавшего от деятельности СИЯП. Выявленные особенности реагирования иммунной системы на различные дозовые нагрузки у экспериментальных животных и их потомства определяют важную роль в прогнозировании отдаленных радиационных эффектов, имеющих дозозависимый характер. Результаты работы позволяют экстраполировать основные закономерности формирования отдаленных эффектов воздействия ионизирующего излучения на популяции людей, проживающих в регионах с неблагополучной радиоэкологической обстановкой. Основные положения, выносимые на защиту: 1. У населения, проживающего вблизи СИЯП (Абралинский и Бескарагайский районы Восточно-Казахстанской области), на основании частоты стабильных хромосомных аберраций определен диапазон дозы: 0,1-2,6 Гр. Повышенный уровень аберраций по отношению к контрольному у потомков жителей названных районов представлен хроматидным типом. 2. Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения у исследуемого населения и их потомков, характеризуются повышенными по отношению к контрольному району уровнями распространенности и рисков общесоматических болезней. 3. У лиц, подвергавшихся радиационному воздействию в различных дозах, выявленная иммунологическая недостаточность проявляется снижением количественного состава показателей клеточного звена, фагоцитарной активности нейтрофилов и повышением гуморальных факторов иммунитета. 4. После воздействия различных доз гамма-излучения у экспериментальных животных в отдаленном периоде отмечается активация неспецифического фагоцитарного звена. Сублетальные и фракционированные дозы гамма-излучения активизируют клеточное звено иммунитета, вызывают депрессию гуморального звена, малые дозы активизируют гуморальное звено и вызывают нарушение хелперно-супрессорного соотношения. Состояние иммунного статуса у потомков облученных белых крыс, характеризуется иммунологической недостаточностью. 6 Апробация работы Результаты работы доложены и обсуждены на: Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (Томск, 2004); 10-м Международном симпозиуме «Dosimetry Workshop on the Semipalatinsk Nuclear Test Site Area» (Хиросима, 2005); III Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (Томск, 2005); II Международной научнопрактической конференции «Семипалатинский испытательный полигон. Радиационное наследие и проблемы нераспространения» (Курчатов, 2005); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии и пути их решения» (Семипалатинск, 2007); Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Семипалатинск, 2007); Международной научно-практической конференции «Эхо полигона и мир без ядерного оружия» (Семей, 2009). Реализация результатов исследования Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр физиологических и биофизических дисциплин, общей гигиены и эпидемиологии Государственного медицинского университета г. Семей. Практические рекомендации, вытекающие из результатов научных исследований, по оценке генетического риска у женщин, проживающих вблизи СИЯП, внедрены в клиническую работу КГКП «Перинатальный центр г. Семей» и применяются врачами-генетиками данного учреждения. Изданы методические рекомендации «Концептуальные принципы и новые компьютерные технологии создания Государственного научного автоматизированного медицинского регистра населения Казахстана, повергавшегося воздействию ионизирующей радиации». В процессе выполнения работы получено свидетельство о государственной регистрации права интеллектуальной собственности «Способ прогнозирования генетических последствий облучения малыми дозами» (№ 2010/1166.1 от 21.09.2010г.). Публикации: основные результаты отражены в 32 печатных работах, в том числе 13 в научных изданиях, рекомендованных Комитетом по надзору и аттестации в сфере образования и науки МОН РК и 8 в изданиях дальнего и ближнего зарубежья. Работа выполнена в рамках программы Государственного медицинского университета г. Семей «Состояние здоровья и реабилитация населения, проживающего в регионе Семипалатинского полигона», номер государственной регистрации: 0105РК0054, шифр 0.0344. Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 158 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций, указателя использованной литературы. 7 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования. В работе использован клинический и экспериментальный материал. Общая характеристика проведенных исследований представлена в таблице 1. Таблица 1- Характеристика проведенных исследований Методы исследования Эпидемиологический (оценка состояния здоровья: расчет показателей PR, RR, AR, EF) Клинический осмотр Цитогенетические исследования Рутинный метод FISH - метод Иммунологические исследования Гамма-облучение экспериментальных животных: Сублетальное - 6 Гр Фракционированное - 1,5 Гр*4 раза, с интервалом 7 дней Малыми дозами - 0,2 Гр Статистический Материалы исследования - Архивные данные -Регистрационные карты обследования взрослых и детей - База данных регистра - Данные скрининговых обследований Основная группа – жители Абралинского и Бескарагайского районов ВКО Контрольная группа – жители Кокпектинского района ВКО Лимфоциты периферической крови Препараты хромосом ДНК-пробы для хромосом 1,2 и 4 пары Кровь на иммунный статус Белые крысы обоего пола. Первое поколение потомков белых крыс Кровь из хвостовой вены на иммунный статус до облучения, через 30 дней (ближайший период) и 90 дней (отдаленный период) после облучения Исследование клеток в лимфоидных органах животных: костном мозге, тимусе, селезенке, лимфатических узлах тонкого кишечника до облучения, через 30 дней, 90 дней после облучения Результаты фактического материала, обработка полученных данных с использованием программ Microsoft Excel 2003, определением величины tкритерия, критерия χ2, коэффициента корреляции. Клинико-эпидемиологическое исследование состояло из нескольких этапов. На начальном этапе проведено определение территории и групп обследованных лиц для наблюдения. В качестве территорий наблюдения были выбраны Абралинский и Бескарагайский районы до 1996 года, относящиеся к Семипалатинской области. В данное время они находятся в составе ВосточноКазахстанской области на расстоянии 35-160 км от эпицентра взрывов и, следовательно, эти территории подвергались неоднократному загрязнению радионуклидами, а население получило высокие дозы как внешнего, так и внутреннего облучения. Величина эффективной дозы, полученная жителями в период проведения испытаний ядерного оружия, составляла более 100 сЗв. Группа контроля представлена населением, проживающим в Кокпектинском районе, который расположен на расстоянии нескольких сотен 8 километров юго-восточнее Семипалатинского испытательного полигона, а величина эффективной дозы составляла менее 7 сЗв [Гусев Б.И., 1996]. Выполнение следующего этапа исследований осуществлялось посредством метода диспансерного обследования сформированных групп бригадами врачей в составе терапевта, невропатолога, кардиолога, эндокринолога, гинеколога, генетика, врача УЗИ – диагностики. Общее число обследованных лиц показано в таблице 2. Таблица 2 - Общее количество обследованных лиц Группы обследованных лиц исследуемое население их потомки итого Основная группа (районы) Всего Абралинский Бескарагайский 307 313 108 415 180 493 Всего 620 Контрольная группа Кокпектинский 250 288 908 202 452 490 1360 870 При отнесении каждого конкретного лица к той или иной группе использовали факт проживания на данной территории в определенные временные периоды и обязательное наличие кровных родственных связей между поколениями. Так, к исследуемому населению отнесены лица, подвергавшиеся непосредственному облучению, которые родились и постоянно проживали в период 1949-1964 гг. на обозначенных территориях. Их потомки – родились и проживали в этих же районах с 1965-1980 гг. Выбранный контроль базировался на статистической информации о численности, половом и возрастном составе и был близок по нерадиационным факторам (в частности, этническим) к основной группе. Материалом для проведения цитогенетического обследования явилась культура лимфоцитов периферической крови 265 лиц. Забор крови производили из локтевой вены в пробирки с гепарином у 215 человек основной и 50 - контрольной группы и их потомков. В обследование включались практически здоровые лица, не подвергавшиеся рентген – исследованию в течение последних шести месяцев. Препараты хромосом готовились по стандартной методике (рутинный метод). От каждого обследованного анализировалось от 350-500 метафаз, содержащие по 23 пары хромосом. Изучались аберрации хромосомного и хроматидного типа: учитывались парные фрагменты, кольцевые, дицентрические хромосомы и хроматидные фрагменты. Изучение стабильных хромосомных аберраций проводили FISH-методом. Забор крови, культивирование, фиксация препаратов хромосом проведена в цитогенетической лаборатории Научно-исследовательского института радиационной медицины и экологии, г. Семей. Следующий этап - окраска специальными маркерами - в лаборатории ORISE (США) с использованием ДНК-проб для хромосом 1, 2 и 4 пары. Препараты хромосом анализировали на 9 флуоресцентном микроскопе, на каждого было проанализировано по 1000 метафаз. Изучение иммунного статуса у населения изучаемых районов проводили путем иммунофенотипирования с использованием набора моноклональных антител. Определяли абсолютное и относительное количество CD3+, CD4+, CD8+, CD21+ лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов и количество основных иммуноглобулинов сыворотки крови IgА, IgМ, IgG методом радиальной иммунодиффузии. Экспериментальные исследования выполнялись на 200 белых беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 180±20 г и их потомках. Влияния сублетального и фракционированного гамма-излучения на иммунологическую реактивность в отдаленном периоде изучалось совместно с соискателем Узбековой С.Е. Животные были предварительно подготовлены к облучению на рентгенсимуляторе «Terasix» в специальной клетке, с последующим облучением заданной дозой непосредственно на гамма-терапевтическом аппарате «Teragam» [Сандыбаев М.Н., с соавт. 2009]. Первая группа животных подвергалась общему гамма-облучению в дозе 6 Гр, вторая группа животных подвергалась общему фракционированному воздействию гамма-лучами по 1,5 Гр*4 раза, третья группа - в дозе 0,2 Гр. Основанием для выбора дозы облучения 6 Гр в качестве сублетальной послужил тот факт, что по данным ряда исследователей [Вершинина С.Ф., Маркочев А.Б., 1995], при однократном гамма-облучении она является LD50 для белых крыс, подвергнутых эксперименту. Для изучения влияния фракционированного гамма-облучения в суммарной дозе 6 Гр, животных облучали 4 раза с интервалом 7 дней дозой 1,5 Гр. Расчетным способом была определена малая доза - 0,2 Гр, для белых крыс. Облученных животных делили на две группы: первую группу забивали для исследования, вторую - отсаживали в отдельные клетки для получения приплода. При этом проведены следующие исследования: 1. Влияние общего гамма-излучения в дозе 6 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней. 2. Влияние общего фракционированного гамма-излучения в суммарной дозе 6 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней. 3. Влияние общего гамма-облучения в дозе 0,2 Гр на иммунологическую реактивность организма белых крыс через 30 (ближайший) и 90 (отдаленный период) дней. 4. Изучение иммунного статуса у потомков облученных белых крыс. Кровь для иммунологических исследований брали из хвостовой вены. Спектр изучаемых иммунологических показателей у экспериментальных животных включал: определение количества В- и Т-лимфоцитов и их субпопуляций методом иммунофлуоресцентного окрашивания клеток с использованием антител, конъюгированных с FITC; реакцию торможения миграции лейкоцитов 10 по методу Артемовой А.Г. (1973); циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) по методу Гринкевич Ю.А. (1981); фагоцитарной активности полинуклеаров по методу Кост Е.А и Стенко М.И. (1962); НСТ-тест по методу, разработанному в институте иммунологии МЗ РФ (Москва). Для изучения клеток в лимфоидных органах животных готовили клеточные суспензии из костного мозга, тимуса, селезенки, лимфатических узлов тонкого кишечника. Определяли общее количество лимфоидных клеток, лимфоидного индекса и массу органа [Гольдберг Е.Д., 1972; Жетписбаев Б.А., 1995]. Результаты собственных исследований Частота хромосомных аберраций у населения, подвергавшегося радиационному воздействию. Не имея сведений относительно частоты спонтанных хромосомных аберраций в исследуемых нами районах – Абралинском и Бескарагайском, в качестве контрольного был выбран Кокпектинский район. Для изучения частоты спонтанных хромосомных аберраций проанализировано 12250 метафаз из культуры лимфоцитов периферической крови 35 практически здоровых лиц обоего пола, проживающих в Кокпектинском районе (таблица 3). Всего проанализировано 57416 метафаз из культуры лимфоцитов периферической крови, из них 29495 - у жителей Бескарагайского и 27921 – Абралинского районов. У жителей Бескарагайского района было выявлено 524 хромосомных аберраций в 508 клетках, у жителей Абралинского района – 480 аберраций в 475 аберрантных клетках и в контроле - 165 нарушений хромосом в 156 клетках. В общем, в двух изучаемых районах частота хромосомных аберраций превышала показатели контроля в 1,3 раза. Не наблюдалось значимых различий между показателями в двух районах – Бескарагайском и Абралинском. Известно, что парные фрагменты, как и дицентрические хромосомы и центрические кольца, являются нестабильными и специфичными для радиационного воздействия. Так частота парных фрагментов достоверно превышает в исследуемых группах частоту в группе контроля: в Бескарагайском районе – 2,59±0,25, в Абралинском – 2,24±0,22 и в контрольном – 1,76±0,21 на 500 клеток соответственно (p<0,05). Частота дицентриков и центрических колец в Бескарагайском районе составила – 0,81±0,09 и 0,54±0,05, в Абралинском районе – 0,57±0,050 и 0,48±0,04, что выше, чем в контроле - 0,33±0,05 и 0,25±0,04 на 500 клеток соответственно. Частота хроматидных аберраций была представлена преимущественно одиночными фрагментами. Их частота в Бескарагайском районе составила 4,93±0,13, в Абралинском – 5,30±0,13, и превышала показатели контроля 4,41±0,12 на 500 клеток соответственно (p<0,05). 11 Таблица 3 - Частота хромосомных аберраций у населения, проживающего вблизи СИЯП Показатели Бескарагайский район (85 чел) n на 500 клеток Изучено метафаз 29495 85 чел Частота аберрантных 508 8,61±1,16 клеток Частота хромосомных 524 8,88±1,17 аберраций Парные фрагменты 153 2,59±0,25* Дицентрики 48 0,81±0,09* Кольца 32 0,54±0,05* Всего аберраций 233 3,95±0,44* хромосомного типа Одиночные 269 4,56±0,22** фрагменты Обмены 22 0,37±0,04* Всего аберраций 291 4,93±0,13* хроматидного типа Абралинский район (80 чел) n на 500 клеток 27921 80 чел 475 8,51±1,17* Контрольный район (35 чел) n на 500 клеток 12250 35 чел 156 6,36±0,92 480 8,6±1,16 165 6,74±0,93 125 32 27 184 2,24±0,22* 0,57±0,05* 0,48±0,04* 3,29±0,41 43 8 6 57 1,76±0,21 0,33±0,05 0,25±0,04 2,33±0,24 278 4,98±0,23* 103 4,2±0,18 18 296 0,32±0,04* 5,30±0,13* 5 108 0,2±0,04 4,41±0,12 Примечания 1 *- достоверность к контрольной группе, p<0,05; 2 ** - достоверность к контрольной группе, p<0,01. Проведенный анализ хромосомных аберраций показал, что частота аберраций нестабильного типа у лиц тестируемых групп превышает показатели контроля. Было обнаружено суммарное превышение частоты аберраций хромосомного типа в 1,5 раз и аберраций хроматидного типа в 1,2 раза показателей контроля. Основываясь на результаты собственного цитогенетического исследования, была предпринята попытка реконструкции эффективной дозы, полученной жителями исследуемых районов. Формула расчета эффективной дозы, основанной на частоте дицентрических хромосом, была предложена Lloyd D.C. (1990) для хронического облучения. Дицентрические хромосомы наиболее специфичны для радиационного воздействия и учитываемые. Формула имеет следующий вид: Д=у/0,022, где Д – доза в сГр; у – частота дицентрических хромосом. Частота дицентриков в собственном исследовании составила 0,162 и 0,114 на 100 клеток, и получили: Д=7,36 сГр для Бескарагайского района, Д=5,18 сГр для Абралинского района. Характер распределения аберраций по клеткам имеет непосредственное отношение к биологической дозиметрии [Бочков Н.П., 2001]. Как известно, при тотальном равномерном облучении распределение аберраций по клеткам соответствует распределению Пуассона. При этом образование хромосомных перестроек происходит более или менее независимо друг от друга и средняя 12 частота их появления постоянна. Отклонения от распределения Пуассона возможно при воздействии плотноионизирующего излучения. Данный феномен объясняется как результат неравномерного распределения поглощенной энергии в веществе [Edwards E.E., 1997]. Помимо распределения Пуассона о равномерности облучения свидетельствует количество аберраций на одну аберрантную клетку. Под аберрантной клеткой в этом случае понимается клетка, имеющая одну и более аберраций хромосомного типа. В эксперименте было показано, что облучение в дозах до 50 сГр индуцирует не более одной аберрации на клетку, а затем, в зависимости от дозы, число аберраций на одну клетку возрастает [Бочков Н.П., 1993]. В собственном исследовании частота аберраций на клетку в исследуемых районах составила 0,46 и 0,39 соответственно. Сравнивая полученные результаты с экспериментальными данными, получили, что население исследуемых районов подверглось неравномерному облучению. Соотношение между количеством парных фрагментов и обменных аберраций (сумма дицентриков и колец) при равномерном облучении закономерно меняется от больших величин к меньшим. Согласно экспериментальным данным при дозе 50 сГр количество парных фрагментов и дицентриков-колец почти равно, а дальше это соотношение уменьшается из-за экспоненциального возрастания числа дицентриков. В случае, если такое соотношение отклоняется от 0,87, то можно говорить о неравномерном облучении. В нашем исследовании соотношение парных фрагментов к дицентрикам-кольцам равно 0,53 и 0,47 в исследуемых районах, в контрольном0,33, что еще раз подтверждает неравномерность облучения населения изучаемых районов (таблица 4). Таблица 4 – Соотношение между парными фрагментами и обменными аберрациями у населения, проживающего вблизи СИЯП Район Число клеток Кокпектинский Бескарагайский Абралинский 156 508 475 Парные фрагменты 43 153 125 Дицентрики+кольца Соотношение 14 80 59 0,33 0,53 0,47 Известно, что уровень стабильных повреждений после облучения остается относительно постоянным и варьирует вокруг небольших значений, однако достоверно превышает их спонтанный фон [Salassidis K. et al, 1995; G.Littlefield, 2005]. FISH-методом проведено цитогенетическое обследование 25 женщин 50-54 лет, которые родились и постоянно проживали вблизи СИЯП. Для сравнения полученных результатов использовались данные цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови 118 ликвидаторов ЧАЭС. В качестве их контрольных групп послужили: 29 жителей Эстонии и 21 житель Oak Ridge (США), для их исследования также использовалась FISH – методика. Выбор 13 контрольных групп и обсуждение результатов были согласованы с независимыми экспертами (США) и учтено влияние только радиационного фактора [McFee A.F., 2005; G.Littlefield, 2005]. Так, среднегрупповая частота транслокаций достоверно превышала средний контрольный уровень в 2 раза: 12,3 – у женщин исследуемой группы; 6,99 – у ликвидаторов ЧАЭС; 7,03 – у жителей Эстонии и 6,84 – у жителей Oak Ridge. Аналогичная картина наблюдалась по средней частоте дицентриков: 1,77; 1,18; 1,33; 0,52 на 1000 клеток соответственно (рисунок 1). Результаты исследования по частоте транслокаций у женщин исследуемой группы были достоверны со сравниваемыми тремя группами контроля: р=0,017; р=0,021; р=0,018 соответственно. 14 12,26 12 частота 10 8 7,03 6,99 6,84 6 4 2 1,77 1,18 1,33 0,52 0 исследуемая группа ликвидаторы ЧАЭС жители Эстонии жители Oak Ridge Транслокации Дицентрики Рисунок 1 – Сравнительная характеристика частоты хромосомных аберраций у жителей основной и контрольных групп (на 1000 клеток) Опираясь на результаты, полученные при исследовании транслокаций, используя калибровочные кривые, был произведен расчет доз (острой и хронической) по методу Lucas J.N. et al (1997). При хроническом внешнем облучении доза на полученное число транслокаций могла составлять от 0,1 Гр до 2,6 Гр, при остром - до 1,04 Гр. Отношение между уровнем частоты транслокаций и дозой облучения представлено в соответствии с рисунком 2. Наблюдалась линейная зависимость между уровнем числа транслокаций и дозой облучения в Гр. 14 3 2,5 Гр 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 частота транслокаций Хроническое Острое Рисунок 2 – Зависимость между числом хромосомных аберраций, подсчитанных на 1000 клеток и дозой в Гр Следуя поставленным задачам, был проведен цитогенетический анализ хромосомных нарушений у потомков лиц, проживающих на исследуемых территориях. Всего было обследовано 50 человек основной группы и 15 – контрольной. В исследованиях принимали участие практически здоровые мужчины и женщины. Количественную и качественную оценку хромосомных аберраций группы контроля провели на 6150 метафазных препаратах из культуры лимфоцитов периферической крови 15 человек. Всего выявлено 71 хромосомные аберрации, что составило 5,77±0,22, из них 23 - хромосомного типа и 48 – хроматидного типа, что составило 1,87±0,17 и 3,90±0,18 на 500 клеток соответственно. В тестируемой группе проанализировано 20056 метафаз из культуры лимфоцитов периферической крови, из них 9950 метафаз у потомков Бескарагайского и 10106 метафаз – Абралинского районов. У потомков лиц, проживающих в исследуемых районах, частота аберраций хромосомного типа превышает контрольные значения. Она составляет: 2,16±0,15 - в Бескарагайском и 2,37±0,15 - в Абралинском районе, тогда как в контроле 1,87±0,17 на 500 клеток (p<0,05). Среди данного вида аберраций была изучена частота дицентрических и кольцевых хромосом. Так, средняя частота дицентриков в тестируемой группе составила 0,35±0,05 и 0,29±0,05, в контроле – 0,16±0,04 на 500 клеток соответственно. Среднегрупповая частота кольцевых хромосом – 0,20±0,04 и 0,29±0,05, в контроле – 0,16±0,01 на 500 клеток соответственно (таблица 5). 15 Таблица 5 - Частота хромосомных аберраций у потомков лиц, проживающих вблизи СИЯП Показатели Изучено метафаз Частота аберрантных клеток Частота хромосомных аберраций Парные фрагменты Бескарагайский район (25 чел) n на 500 клеток 9950 Абралинский район (25 чел) n на 500 клеток 10106 Контрольный район (15 чел) n на 500 клеток 6150 118 5,92±0,24 125 6,18±0,24 73 5,93±0,30 124 6,23±0,24 138 6,82±0,25 71 5,77±0,22 32 1,62±0,12 36 1,78±0,13 19 1,54±0,16 Дицентрики 7 0,35±0,05* 6 0,29±0,05* 2 0,16±0,04 Кольца 4 0,2±0,04 6 0,29±0,05* 2 0,16±0,01 Всего аберраций хромосомного типа Одиночные фрагменты Обмены 43 2,16±0,15* 48 2,37±0,15* 23 1,87±0,17 79 3,96±0,21* 88 4,35±0,21* 46 3,74±0,17 2 0,10±0,03 2 0,10±0,03 2 0,16±0,05 Всего аберраций хроматидного типа 81 4,07±0,19* 90 4,45±0,21* 48 3,9±0,18 Примечание *- достоверность к контрольной группе, p<0,05. Изучена частота встречаемости аберраций хроматидного типа. Аберрации хроматидного типа у потомков представлены преимущественно хроматидными фрагментами. Их частота составляет 3,96±0,21 - у жителей Бескарагайского района и 4,35±0,21 - у жителей Абралинского, в контроле - 3,74±0,17 на 500 клеток. Хроматидные обмены в исследуемых группах встречались с одинаковой частотой 0,10±0,03 на 500 клеток, а в контроле - 0,16±0,05 на 500 клеток соответственно. Известно, что рост аберраций хроматидного типа обусловлен воздействием на организм факторов окружающей среды (химические, бактериальные мутагены, вирусы), но может быть и результатом действия радиационного фактора [Севанькаев А.В., 2005]. Согласно классическому представлению о спонтанном мутагенезе, отношение количества аберраций хромосомного типа к хроматидному составляет 1:2. В нашем исследовании такое соотношение было равным в группах исследования и составило 1:1,9 (контроль – 1:2). Результаты собственных исследований согласуются с результатами других исследователей [Неронова Е.Г. с соавт., 2002; Пилинская М.А. с соавт., 1992], где превалирует доля аберраций хроматидного типа над хромосомным типом. Однако абсолютного сравнения с 16 другими районами радиоэкологического неблагополучия не может быть в виду того, что жители, пострадавшие от деятельности СИЯП, до сих пор находятся в условиях воздействия ионизирующего излучения за счет длительного периода полураспада радионуклидов и имеет место индукция хромосомных аберраций. Таким образом, комплексный цитогенетический анализ показал, что у жителей, проживающих вблизи СИЯП, частота хромосомных аберраций достоверно превышает контрольные показатели. У их потомков частота аберраций хроматидного типа превышает показатели частоты хромосомного типа. Тенденция к накоплению стабильных и нестабильных маркеров радиационного воздействия позволяет сделать вывод о преимущественном влиянии радиационного фактора на хромосомный аппарат соматических клеток, возможной причиной которого является инкорпорирование радионуклидов. Распространенность соматических болезней у населения, подвергавшегося радиационному воздействию. Была изучена распространенность болезней внутренних органов у жителей, проживающих вблизи СИЯП, по 8 классам [классы III, IV, VI, IX-XI, XIII, XIV по МКБ-10]. В Абралинском и Бескарагайском районах общая распространенность болезней (PR) эндокринной системы, крови и кроветворных органов, системы кровообращения, костно-мышечной системы и соединительной ткани превышала уровни контрольных значений. Показатели распространенности болезней нервной системы, органов дыхания, пищеварения и мочеполовой системы незначительно превышали показатели контроля, либо имели одинаковые значения (таблица 6). Так, общая совокупность болезней внутренних органов в двух исследуемых районах составила: 1626,3 (1455,81743,9) - в Бескарагайском районе и 1615,5 (1569,9-1771,9) – в Абралинском, в контроле – 1114,0 (971,4-1442,5). Относительный риск (RR) в двух районах был равным 1,5 (1,1-2,5); абсолютный риск (AR) – 51,2 (35,6-98,0) % и 50,2 (27,191,4) % соответственно; атрибутивный риск (EF) - 33,3 (27,7-59,2) % и 33,3 (27,7-59,9) % соответственно. Из приведенных данных видно, что значимых различий между показателями распространенности в двух исследуемых районах не наблюдается. Распространенность болезней крови и кроветворных органов [класс III] составила - 124,6 (87,3-161,9) и 107,5 (72,1-142,9) на 103 против контрольных значений - 44,0 (18,1-69,9) на 103 соответственно, при этом RR=2,8 и 2,4; AR=8,1 % и 6,4 %; EF=64,2 % и 58,3 % соответственно. Распространенность болезней эндокринной системы [класс IV] преобладала у лиц основной группы по сравнению с контролем, при этом RR=1,9 и 1,8; AR=12,5 % и 11,0 %; EF=47,4 % и 44,4 % соответственно. Распространенность болезней системы кровообращения [класс IX] у лиц основной группы в целом составила – 456,9 (400,5-513,1) и 371,3 (316,2-426,5) на 103 и была выше, чем в контроле – 240,0 на 103, при этом RR=1,9 и 1,5; AR=21,7 % и 13,1 %; EF=47,5 % и 33,3 % соответственно. 17 Распространенность болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани [класс XIII] в исследуемых районах также была выше, чем в контроле: 95,8 (62,5-129,1); 130,3 (91,9-168,7) и 68,0 (36,2-99,8) на 103 соответственно. RR=1,4 и 1,9. Относительный риск развития болезней органов дыхания [класс X] в исследуемых районах незначительно превышал контрольные значения и составил в Бескарагайском районе - 1,1, в Абралинском районе - 1,2. Аналогичную ситуацию мы наблюдали в отношении болезней мочеполовой системы [класс XIV], где относительный риск был равным 1,2 и 1,0 соответственно. Показатели распространенности болезней органов пищеварения [класс XI] превышали контрольные в 1,1 раза только в Абралинском районе, при этом AR=2,5 %; EF=9,1 %. В Бескарагайском районе риск распространенности болезней данного класса был равен 1,0. Отсутствие риска констатировали по болезням нервной системы, так в Бескарагайском районе - RR=1,0 и в Абралинском - RR=0,9. Полученные данные свидетельствуют, что из 8 изученных классов соматических болезней у лиц, проживающих в Бескарагайском и Абралинском районе, наблюдали повышенные показатели распространенности болезней по 6 классам (кроме болезней нервной системы и органов пищеварения). Наибольшие риски развития болезней были зарегистрированы по следующим классам: болезни крови и кроветворных органов, эндокринной системы, системы кровообращения, костно-мышечной системы и соединительной ткани. Анализ корреляционной зависимости распространенности соматических болезней и частоты хромосомных аберраций в группе жителей Бескарагайского и Абралинского районов показал положительную связь: r=0,48 и r=0,56 (p<0,1; р<0,1) соответственно. В таблице 7 представлены данные по распространенности болезней внутренних органов у потомков лиц, проживающих в Абралинском и Бескарагайском районах. Изучение частоты болезней внутренних органов у потомков жителей изучаемых районов показало превышение показателей контрольного района в 1,2 раза. Абсолютный риск составил 17,3 % и 19 %; атрибутивный риск – 16,7 % и 16,7 % соответственно. Распространенность болезней крови и кроветворных органов [класс III] в двух изучаемых районах не имела существенных различий и составила – 88,9 (46,5-131,3) и 92,6 (36,8-148,4) на 103 против контрольных значений - 64,0 (29,898,9) на 103 . Показатели относительного, абсолютного и атрибутивного рисков также существенно не отличались у потомков, проживающих в Бескарагайском и Абралинском районах: при этом RR=1,4 и 1,4; AR=2,5 % и 2,8 %; EF=27,6 % и 30,5 % соответственно. Распространенность болезней эндокринной системы [класс IV] в целом в 1,5 раза а преобладала у лиц исследуемых районов по сравнению с контролем, при этом AR=5,8 % и 4,9 %; EF=34,7 % и 30,2 % соответственно 18 Таблица 6 – Распространенность болезней у населения, проживающего вблизи СИЯП (на 1000 человек) Классы болезней [МКБ-10] Болезни внутренних органов [класс III, IV, VI, IX-XI, XIII, XIV] Б-ни крови, кроветворных органов [класс III (D50 – D89)] Б-ни эндокр. сист., рас-ва пит-я и наруш. обмена в-в [класс IV (E00 - E90)] Б-ни нервной системы [класс VI (G00 – G99)] PR К 1114,0 (971,41442,5) 44,0 (18,05– 69,94) 144,0 (99,6– 188,4) 60,0 (29,9-90,0) Б-ни системы кровообращения [класс IX (I00 – I99)] Б-ни органов дыхания [класс X (J00 – J99)] 240,0 (186,0294,0) 272,0 (215,7328,3) 212,0 (160,3263,7) 68,0 (36,2-99,8) Б-ни органов пищеварения [класс XI (K00 – K93)] Б-ни костно-мышечной системы и соединит. ткани [класс XIII (M00 – M99)] Б-ни мочеполовой системы 74,0 [класс XIV (N00 –N99)] (55,2-94,8) Примечания 1 1- Бескарагайский район; 2 2- Абралинский район; 3 К – Кокпектинский район; 4 * - достоверность p<0,05; 1 1626,3* (1455,8 1743,9) 124,6* (87,3-161,9) PR 2 RR 1 AR 2 1 2 1615,5* (1569,81771,9) 107,5* (72,1-142,9) 1,5 (1,1-2,5) 1,5 (1,1-2,4) 51,2 (35,6-98,0) 2,8 (2,3-3,4) 2,4 (1,9-3,0) 254,1* (194,1-302,9) 1,9 (1,5-2,2) 1,8 (1,4-2,1) 55,4 (29,3-81,5) 1,0 (0,0-2,1) 0,9 (0,0-2,4) 456,9* (400,5-513,1) 371,3* (316,2-426,5) 1,9 (1,1-2,7) 309,9* (257,6-362,2) 332,2* (276,6-407,6) 220,4* (173,5-267,3) EF % 2 1 33,3 (27,7-59,2) 33,3 (27,7-59,9) 8,1 (6,5-9,6) 50,2 (27,191,4) 6,4 (4,9-7,8) 64,2 (52,4-76,9) 58,3 (45,5-72,6) 12,5 (10,3-14,7) 11,0 (8,8-13,1) 47,4 (38,2-54,6) 44,4 (34,7-51,7) - - - - 1,5 (1,3-1,8) 21,7 (12,1-31,3) 47,5 (26,5-68,4) 33,3 (28,6-42,1) 1,1 (0,4-1,9) 1,2 (0,7-1,7) 3,8 (1,4-6,2) 13,1 (11,216,8) 6,0 (3,5-8,5) 9,1 (4,4-20,1) 16,7 (10,6-25,5) 236,6* (204,9-288,2) 1,0 (0,2-1,9) 1,1 (0,9-1,8) 0,8 (0,1-1,5) 2,5 (1,1-5,8) - 9,1 (7,9-14,2) 95,8* (62,5-129,1) 130,3* (91,9-168,7) 1,4 (0,7-2,2) 1,9 (0,3-3,5) 2,8 (1,3-4,3) 6,2 (1,0-11,4) 28,5 (13,6-44,5) 47,4 (8,2-87,5) 89,5* (57,3-121,8) 78,1* (47,5-108,7) 1,2 (0,6-1,8) 1,0 (0,3-1,6) 1,6 (1,0-2,3) 0,4 (0,1-1,1) 16,7 (10,3-30,4) - 268,5* (218,4-318,6) 60,7 (33,7-87,7) 5 – в скобках 95 % доверительный интервал. Таблица 7 – Распространенность болезней у потомков лиц, проживающих вблизи СИЯП (на 1000) Классы болезней [МКБ-10] Болезни внутренних органов [класс III, IV, VI, IX-XI, XIII, XIV] Б-ни крови и кров-х органов [класс III (D50 – D89)] Б-ни эндокр. сист., рас-ва пит-я и наруш. обмена в-в [класс IV (E00 - E90)] Б-ни нервной системы [класс VI (G00 – G99)] Б-ни системы кровообращения [класс IX (I00 – I99)] Б-ни органов дыхания [класс X (J00 – J99)] Б-ни органов пищеварения [класс XI (K00 – K93)] Б-ни костно-мышечной системы и соединит. ткани [класс XIII (M00 – M99)] Б-ни мочеполовой системы [класс XIV (N00 –N99)] Примечания 1 1- Бескарагайский район; 2 2- Абралинский район; 3 К – Кокпектинский район; 4 * - достоверность p<0,05; PR К 771,5 (712,4-830,6) PR 2 1 1 RR 2 AR 1 2 EF % 2 1 944,5* (910,3-978,6) 962,4* (925,2-998,8) 1,2 (0,7-1,8) 1,2 (0,5-2,0) 17,3 (9,6-24,9) 19,0 (7,5-30,6) 16,7 (10,2-26,4) 16,7 (7,9-31,8) 64,4 (29,8-98,9) 108,9 (65,1-152,8) 88,9* (46,5-131,3) 166,7** (111,2-222,2) 92,6* (36,8-148,4) 157,4* (82,3-227,5) 1,4 (0,7-2,1) 1,5 (1,1-1,8) 1,4 (0,4-2,5) 1,5 (0,8-2,1) 2,5 (1,1-3,8) 5,8 (4,2-7,4) 2,8 (1,8-4,8) 4,9 (2,8-6,9) 27,6 (12,2-38,7) 34,7 (21,1-41,9) 30,5 (8,7-52,3) 30,2 (17,9-43,6) 79,5 (41,4-117,5) 132,5 (84,8-180,2) 83,3* (42,1-124,5) 138,9* (87,3-190,4) 91,9* (36,3-147,5) 148,2* (79,8-216,5) 1,0 (0,7-1,4) 1,0 (0,6-1,5) 1,1 (0,9-1,4) 1,1 (0,7-1,5) 3,8 (2,5-5,1) 0,6 (0,4-0,9) 1,3 (1,0-1,5) 1,6 (1,0-2,1) - 9,1 (7,5-16,5) 9,1 (7,0-14,2) 163,4 (111,3-215,4) 128,7 (81,5-175,8) 24,8 (19,8-31,4) 211,1* (150,3-271,9) 150,0* (98,8-203,2) 27,8* (19,85-55,65) 222,2* (142,2 -302,2) 148,2* (79,8-216,5) 27,8* (15,6-47,6) 1,3 (0,2-2,3) 1,2 (0,2-2,2) 1,1 (0,9-2,8) 1,4 (0,9-1,9) 1,2 (0,7-1,6) 1,1 (0,9-4,2) 4,8 (0,9-8,7) 2,1 (1,9-3,9) 0,3 (0-0,9) 5,9 (3,7-8,1) 1,9 (1,1-2,7) 0,3 (0-0,9) 23,0 (4,3-40,9) 14,2 (2,0-26,4) 9,1 (7,5-18,9) 28,5 (16,7-36,2) 13,1 (8,1-18,4) 9,1 (3,7-17,4) 69,3 (53,7-81,9) 77,8* (45,63-97,43) 74,1* (46,7-102,3) 1,1 (0,8-2,1) 1,0 (0,4-2,4) 0,9 (0,6-1,2) 0,5 (0-1,1) 9,1 (8,4-17,2) - 5 – в скобках 95 % доверительный интервал. - Повышенные показатели распространенности и рисков болезней по сравнению с контрольными значениями наблюдали по болезням органов дыхания [класс X]: в Бескарагайском районе - RR=1,3; AR=4,8 %; EF=23,0 % и в Абралинском - RR=1,4; AR=5,9 %; EF=28,5 %. Относительный риск распространенности болезней органов пищеварения [класс XI] не имел существенных различий в районах исследования и превышал контрольные показатели в 1,2 раза. Распространенность болезней нервной системы, системы кровообращения, костно-мышечной и мочеполовой системы у потомков, проживающих в Бескарагайском и Абралинском районах, незначительно превышала показатели контрольного района. Проведенный корреляционный анализ связи риска распространенности соматических болезней и частоты хромосомных аберраций у потомков жителей исследуемых районов выявил положительную зависимость: r=0,67, r=0,69 (p<0,01; p<0,01) соответственно. Таким образом, у населения, подвергавшегося воздействию ионизирующего излучения, при испытаниях ядерного оружия на Семипалатинском полигоне, распространенность болезней крови и кроветворных органов, системы кровообращения, эндокринной и костномышечной системы превышала уровни контрольной группы. Распространенность болезней у их потомков была выше контрольных значений по болезням крови и кроветворных органов, эндокринной системы и органов дыхания. Состояние иммунного статуса у различных контингентов, подвергавшихся радиационному воздействию. В группе лиц основной группы отмечено статистически значимое снижение абсолютного и относительного количества лимфоцитов, по отношению к контрольной группе - 1,68*109/л и 29,5 %, 2,10*109/л и 36,9 % соответственно. Наблюдается достоверное снижение, по сравнению с контролем, абсолютного количества CD3+ лимфоцитов (0,58*109/л), CD4+ лимфоцитов (0,47*109/л) при отсутствии различий в их относительном содержании. Выявлено статистически значимое увеличение относительного количества CD8+ (20,6 % - в основной группе и 16,7 % - в контрольной). Абсолютное значение CD8+ в обеих группах не различается. Достоверно снижен CD4+/CD8+ индекс - 1,38 против 1,61 – в контрольной группе. Отмечается увеличение относительного количества нейтрофилов до 62,3 % – в основной группе и 56,1 % – в контрольной, снижение активности фагоцитоза до 26,3 % – в основной группе и 32,5 % – в группе контроля. Показатели гуморального звена характеризовались снижением концентрации IgG 9,33*109/л – в основной группе и 9,82*109/л - в контрольной, увеличением концентрации IgM до 1,11*109/л и 1,07*109/л соответственно, IgA до 1,88*109/л и 1,83*109/л соответственно, а также относительного количества CD21+ клеток до 13,7 % и 11,9 % соответственно (таблица 8). 21 Таблица 8 - Иммунологические радиационному воздействию Показатели Лейкоциты, 109/л Лимфоциты, 109/л Лимфоциты, % Нейтрофилы, 109/л Нейтрофилы, % CD3+, 109/л CD3+, % CD4+, 109/л CD4+, % CD8+, 109/л CD8+, % CD21+, 109/л CD21+, % Ig A, г/л Ig G, г/л Ig M, г/л CD4+/CD8+ ЦИК, еоп Фагоцитоз, % показатели Основная группа (Бескарагайский район) n=48 5,18±0,10 1,68±0,05 29,5±0,85 3,9±0,2 62,3±0,78 0,58±0,04 32,2±1,37 0,47±0,02 28,5±1,04 0,58±0,02 20,6±0,72 0,24±0,01 13,7±0,51 1,88±0,012 9,33±0,1 1,11±0,01 1,38±0,05 0,013±0,0011 25,3±1,8 у лиц, подвергавшихся Контрольная группа (Кокпектинский район) n=34 5,98±0,25 2,10±0,07 36,9±1,38 3,5±0,1 51,6±1,35 0,73±0,05 33,53±1,41 0,62±0,04 26,9±1,32 0,56±0,02 16,7±0,79 0,26±0,02 11,9±0,43 1,83±0,01 9,82±0,19 1,07±0,01 1,61±0,06 0,011±0,001 32,5±1,9 р <0,01 <0,05 <0,01 >0,05 <0,01 <0,01 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,01 >0,05 <0,05 >0,05 >0,01 <0,05 <0,01 <0,05 <0,05 Приведенный материал показывает, что у лиц основной группы в периферической крови отмечается снижение абсолютного содержания СD3+, СD4+лимфоцитов, и CD4+/CD8+ индекса, фагоцитарной активности лейкоцитов и повышение относительного количества СD8+ лимфоцитов. Изменения в гуморальном звене иммунитета проявляется в повышении абсолютного числа СD21+ лимфоцитов, концентрации IgM и ЦИК в сыворотке крови. Был проведен сравнительный анализ иммунологических показателей жителей, проживающих в регионе влияния ракетно-ядерного полигона «Азгыр» [Битанова Э.Ж., 2005], в Карагандинской области, часть территории которой прилегают к Семипалатинскому полигону [Гальстер И.К., 1998], а также граждан Республики Казахстан, принимавших участие в ликвидации последствий аварии в Чернобыле [Бисембина Г.Ж., 2001]. Сравнивая результаты собственных основной и контрольной групп с данными других исследователей, не было выявлено значительных различий по многим иммунологическим показателям, что подтверждает схожесть реагирования иммунной системы у лиц, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения в различных дозах. В тоже время, повышение относительного количества нейтрофилов и IgA, снижение относительного числа лимфоцитов и IgМ у жителей Кокпектинского района по отношению к сравниваемым группам, предполагает иммунодефицитное состояние и у лиц 22 собственной контрольной группы, население которой подвергалось радиационному воздействию в минимальных дозах [Гусев Б.И., 1996]. Иммунологическая реактивность организма после воздействия различных доз гамма-излучения в отдаленном периоде. Проведенные исследования по изучению иммунного статуса у жителей, подвергшихся радиационному воздействию в различных дозах, выявили различные дисфункции, что обусловило проведение эксперимента для определения особенностей иммунного реагирования на различные дозы ионизирующего излучения. Состояние Т-системы иммунитета после воздействия гамма-излучения в различных дозах. Сублетальное гамма-излучение в дозе 6 Гр вызывало в ближайшем периоде снижение в 1,3 раза количество лейкоцитов, повышение абсолютного числа лимфоцитов в 1,5 раз, снижение относительного числа СD3+, СD4+ и СD8+ клеток на 55 %, 64 % и 60 % соответственно. Данные изменения в клеточном составе проявлялись снижением ИРИ и повышением РТМЛ на ФГА до 1,12. В отдаленном периоде относительное содержание общих лимфоцитов выше контрольного уровня, достоверно возрастают содержание СD3+, СD4+ лимфоцитов до уровня контрольных величин (p<0,05). Достоверное низкое содержание СD8+ лимфоцитов сопровождалось повышением ИРИ до 2,6. Индекс миграции в РТМЛ на ФГА снижался до уровня контрольной группы (рисунок 3). 60 56 58 50 41 40 32,5 % 31 ` 30 25 20,5 20 14 10,2 7,4 10 7,8 4,1 0,8 1,1 0,8 0 Лимфоциты СD3+ Интактные CD4+ через 30 дней CD8+ РТМЛ через 90 дней Рисунок 3 -Т-звено иммунитета после облучения 6 Гр в ближайшем и отдаленном периоде В ближайшем периоде после фракционированного гамма-излучения в суммарной дозе 6 Гр, в периферической крови отмечается лимфоцитоз, снижение числа СD8+ лимфоцитов на 56 % (p<0,01) и повышение ИРИ на 71 % (p<0,01). В отдаленном периоде в периферической крови со стороны количества лейкоцитов существенных изменений не наблюдалось. 23 Достоверно снижалось относительное количество общих лимфоцитов (на 60 % в сравнении с контрольной группой, p<0,05). Повышалось абсолютное и относительное содержание СD4+клеток на 17 %. Повышение в этот период числа СD8+клеток недостаточное, его значение достоверно ниже контрольной величины на 32 % (p<0,01). ИРИ достоверно снижался (3,2), но при этом не достигал контрольного уровня (1,9). Индекс миграции лейкоцитов повышался до уровня контрольной величины (рисунок 4). 60 52,6 50 41 40 % 32,7 30 31 29,4 20,5 20 22,8 24,7 12,6 10,2 10 7,4 4,4 0,8 0,6 0,8 0 Лимфоциты CD3+ Интактные CD4+ через 30 дней CD8+ РТМЛ через 90 дней Рисунок 4 – Т-звено иммунитета после фракционированной дозы гаммаизлучения в ближайшем и отдаленном периоде В ближайшем периоде после действия малых доз гамма-излучения (0,2 Гр) в периферической крови облученных крыс на фоне лимфоцитоза регистрируется снижение количества Т-общих и субпопуляции Т-лимфоцитов с хелперной и супрессорной активностью. В отдаленном периоде после действия малой дозы гамма-излучения отмечалось достоверное повышение числа лимфоцитов. Статистически сниженными по отношению к интактной группе оставалось количество как относительного, так и абсолютного количества общих Т-лимфоцитов. При этом разнонаправлено вели себя субпопуляции Тлимфоцитов: количество Т-лимфоцитов с хелперной активностью снижалось на 12 %, а Т-лимфоцитов с супрессорной активностью, напротив, повышалось на 8 % (р<0.05). Данное изменение вызывало снижение ИРИ (1,6) приближаясь к контрольному уровню (1,9), а лимфокинпродуцирующая способность лейкоцитов возрастала до контрольных значений (рисунок 5). 24 60 55,3 57 50 41 40 % 31 30 22 20,5 18 20 18 11 10,2 10 10 2,2 0,8 0,2 0,73 0 Лимфоциты CD3+ CD4+ Интактные через 30 дней CD8+ РТМЛ через 90 дней Рисунок 5 – Т-звено иммунитета после облучения 0,2 Гр в ближайшем и отдаленном периоде Состояние гуморального звена иммунитета после воздействия гаммаизлучения в различных дозах. После гамма-излучения в дозе 6 Гр наблюдались следующие изменения: в ближайшем периоде уровень СD19+клеток достоверно высокий (повышение на 46 %), снижены антителообразующая функция (АОК) в селезенке (на 64 %). В отдаленном периоде индекс супрессии снижен в 2,7 раз по сравнению с показателями ближайшего периода, концентрация ЦИК в сыворотке крови составила 0,3 г/л, а в контроле – 1,26 г/л (р<0,01), количество СD19+ лимфоцитов повышено, АОК в селезенке снижено на 22 % по отношению к интактной группе. Данные изменения свидетельствуют об иммунодепрессии гуморального звена иммунитета (рисунок 6). 70 64 60 56 58 52,8 50 41 41 % 40 30 24 19 20 12,7 10 15,3 6,9 0 0 Лимфоциты CD19+ Интактные АОК через 30 дней ИС через 90 дней Рисунок 6 – Гуморальное звено иммунитета после облучения 6 Гр в ближайшем и отдаленном периоде 25 В отдаленном периоде после фракционированного гамма-облучения (1,5 Гр×4) в гуморальном звене отмечалось высокое содержание абсолютного и относительного количества СD19+лимфоцитов, нормализация АОК в селезенке по отношению к ближайшему периоду, снижение индекса супрессии в 4,4 раза также по сравнению с ближайшим периодом (рисунок 7). В отдаленном периоде после воздействия малых доз гамма-излучения по отношению к ближайшему периоду и интактной группе отмечался рост абсолютного и относительного количества СD19+лимфоцитов. Повышалось до контрольного уровня число АОК в селезенке. Индекс супрессии, в сравнении с ближайшим периодом, снижен на 26 %. Концентрация ЦИК в сыворотке крови (0,8±0,05) г/л возрастала по отношению к ближайшему периоду (0,55±0,003) г/л, но при этом не достигало контрольного уровня (1,26±0,028) г/л (рисунок 8). 57,6 60 52,8 52,6 50 45 41 40 % 32,7 30 22 20 14,2 10 13 12,3 6,9 0 0 Лимфоциты CD19+ Интактные АОК через 30 дней ИС через 90 дней Рисунок 7- Гуморальное звено иммунитета после фракционированного облучения в ближайшем и отдаленном периоде 60 53,5 52 50 44 40 40 40 % 32,3 30 20,2 20 16 15 12,3 10 7 0 0 Лимфоциты CD19+ Интактные АОК через 30 дней ИС через 90 дней Рисунок 8 – Гуморальное звено иммунитета после облучения 0,2 Гр в ближайшем и отдаленном периоде 26 Исследование роли цитокинов в патогенезе различных заболеваний является одним из новейших направлений современной медицины. Одной из важных функций системы цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем в ответ на стресс (в данном случае, ионизирующая радиация). В зависимости от природы стимула повышается синтез цитокинов, обладающих провоспалительными или противовоспалительными свойствами. Нарушения содержания цитокинов после радиационного воздействия можно считать защитным механизмом, ограничивающим повреждение тканей. Было изучено содержание цитокинов в крови экспериментальных животных после различных дозовых нагрузок в отдаленном периоде (таблица 9). Таблица 9 – Цитокиновый профиль после влияния различных доз гаммаизлучения в отдаленном периоде Показатели (pg/ml) 1. Интактные (n=10) Группы облученных животных 2. 6 Гр 3. 1,5*4 Гр (n=20) (n=20) IL-2 59,3±6,7 46,2±5,3 IL-6 29,6±2,1 14,1±2,9** TNF-α 61,7±3,1 50,1±3,9* IFN-γ 14,1±1,5 27,6±4,7* Примечания 1 * - достоверно к интактной группе (р<0,05); 2 ** - достоверно к интактной группе (p<0,01); 3 n - количество опытов 52,4±7.3 36,1±4,3 52,1±3,0* 10,2±1,3* 4. 0,2 Гр (n=20) 49,1±6,1 57,7±7,0* 69,3±4,2 9,8±1,4* Из таблицы 9 видно, что при действии сублетальной дозы гамма-излучения в отдаленном периоде наблюдалось снижение содержаний IL-6 и TNF-α и повышение содержания IFN-γ. Фракционированные дозы гамма-излучения в отдаленном периоде вызывают снижение в 1,2 раза TNF-α и в 1,4 раза IFN-γ. Со стороны IL-2 и IL-6 существенных изменений не наблюдалось. При действии малых доз гамма-излучения происходило повышение содержания в 1,9 раз IL-6 и снижение содержания в 1,4 раз IFN-γ. Со стороны IL-2 и TNF-α значимых изменений в отдаленном периоде после действия малых доз гамма-изучения не обнаружено. Неспецифическая фагоцитарная резистентность организма после воздействия гамма-излучения в различных дозах. В отдаленном периоде после сублетального гамма-облучения отмечалось усиление неспецифического фагоцитарного звена иммунитета, проявившегося в достоверном повышении на 36 % фагоцитарной активности лейкоцитов и повышении на 35 % фагоцитарного числа, а также НСТ - теста (р<0,01) (таблица 10). В отдаленном периоде после фракционированного гамма-облучения по отношению к интактной группе наблюдалось достоверное повышение 27 фагоцитоза - 51 % против 34 % соответственно, фагоцитарного числа - 2,6±0,1 и 1,6±0,2 соответственно, показателя НСТ-теста почти в 3 раза – 12,1±4,1 и 4,6±1,5 соответственно (р<0,05). В отдаленном периоде после воздействия малых доз гамма-излучения фагоцитарная активность лейкоцитов достоверно повышена на 32 % в сравнении с показателями контроля. Происходила нормализация фагоцитарного числа 1,77±0,06 (в интактной группе – 1,6±0,2), НСТ-теста – 6,0±1,1 (в интактной группе – 4,6±1,5). Таблица 10 – Показатели неспецифического звена иммунитета после влияния различных доз гамма-излучения в отдаленном периоде Показатели Группы облученных животных 1. интактные 2. 6 Гр 3. 1,5*4Гр 4. 0,2 Гр (n=20) (n=10) (n=20) (n=20) Фагоцитоз, % 34,0±2,3 52,8±1,5** ф/ч 1,6±0,2 2,5±0,2* НСТ-тест 4,6±1,5 10,9±1,8** Примечания 1 * - достоверно к интактной группе (р<0,05); 2 ** - достоверно к интактной группе (p<0,01); 3 n - количество опытов 51,0±1,8* 2,6±0,1* 12,1±4,1* 49,5±2,7* 1,77±0,06* 6,0±1,1 Исследования, посвященные отдаленным эффектам ионизирующего излучения, проявляющихся на потомстве, не теряют своей актуальности, так как многие вопросы, в частности, состояние иммунитета, остаются открытыми и оценка таких последствий требует тщательного анализа. Поэтому было изучено состояние иммунного статуса у потомков облученных животных. Работу проводили на 20 потомках белых крыс, в возрасте 3 месяцев, родители которых были подвергнуты тотальному гамма-облучению и в последующем, содержались в стандартных условиях вивария до рождения приплода. Исследовали те же параметры основных звеньев иммунитета, что и у их родителей, стандартными методами. Сравнение полученных результатов проводили с группой их родителей и интактных животных (таблица 11). На фоне абсолютного лейко- и лимфоцитоза в клеточном звене заметно снижено количество субпопуляций СD4+лимфоцитов, по отношению к интактной группе и к группе родителей, что привело к нарушению хелперносупрессорного соотношения и снижению ИРИ в 1,8 раз соответственно (p<0,05). Известно, что хелперно-супрессорный индекс является одним из наиболее важных показателей. При снижении данного показателя за счет хелперной популяции до 1:1 следует ожидать развитие синдрома иммунологического дефицита. В нашем исследовании данное соотношение приближается к 1:1. Следовательно, у потомков облученных животных имеется иммунологическая недостаточность. Изменения, затрагивающие гуморальное звено иммунной системы, характеризовались повышением количества В28 лимфоцитов в 2,7 раз по отношению к интактной группе и в 1,4 раза по отношению к родителям; нормализацией АОК в селезенке и снижением концентрации ЦИК в сыворотке крови, как по отношению к интактной группе животных, так и по отношению к родительской группе, что свидетельствовало об активации данного звена. Таблица 11 – Иммунологические показатели у потомков облученных белых крыс Показатели № Лейкоциты в 1 мкл Лимфоциты в 1 мкл 1. 1. 2. 1. 2. 1. 2. 1. 2. 1. 1. 1. 2. 1. 1. СD3+ СD4+ СD8+ 1 группа интактные крысы (n=15) 6600±122 2914±117 41±1,6 1462±91,2 31±1,43 678±65 20,5±1,2 473±35,5 10,2±0,8 1,9±0,2 0,78±0,02 319±12,5 6,9±0,7 52,8±4,87 - 2 группа облученные крысы (n=20) 6016±109 3385±106 58±1,69* 1049±307 31,5±2,3 855±62,5 25±1,31 312±38,8* 7,8±1,62 2,59±0,36* 0,75±0,019 620,5±16,85** 15,3±0,86** 41±4,42* 24±1,09 ИРИ РТМЛ (индекс) СD19+ в 1 мкл АОК в % ИС (индекс супрессии, в %) ЦИК (г/л) 1. 1,26±0,028 0,3±0,012** Примечания 1 1-абсолютное число; 2 2-относительное в %; 3 * - достоверность к интактным (р<0,05), ** - достоверность (p<0,01); 4 0 – достоверность к 2 группе (р<0,05), 00 – достоверность (p<0,01) 3 группа потомки крыс (n=20) 7490±127*00 7766±132*0 58,2±1,8* 976±146* 22,5±2,7*0 482±52,3*0 11,5±0,75*00 494,5±42,5* 11±0,7 1,03±0,18*0 0,59±0,015*0 869,2±16,5*0 20±1,5*0 57±6,20 9,6±0,8* 0,011±0,0010 В неспецифическом звене у потомков облученных крыс было обнаружено достоверное снижение фагоцитарной активности лейкоцитов на 12 %, фагоцитарного числа на 5,2 % по отношению к группе облученных родителей и повышение всех показателей неспецифического звена иммунитета по отношению к интактной группе (таблица 12). Сравнить собственные результаты иммунного статуса у потомков облученных крыс нам не представлялось возможным, так как, подобных работ в доступной литературе не обнаружили. 29 Таблица 12 - Показатели неспецифического звена иммунитета у потомков облученных белых крыс Показатели 1 группа (n=15) интактные крысы 2 группа (n=20) облученные крысы Фагоцитоз (%) 34,0±2,3 52,8±1,5** Ф/Ч 1,62±0,23 2,5±0,22* НСТ-тест 4,57±1,56 10,9±2,78** Примечания 1 * - достоверность к 1 группе (р<0,05), ** - достоверность (p<0,01); 2 0 – достоверность к 2 группе (р<0,05). 3 группа (n=20) потомки 44,9±3,4*0 2,37±0,2* 5,45±1,78 Таким образом, клинико-эпидемиологический анализ позволил выявить цитогенетические, соматические эффекты и иммунологические нарушения у жителей и их потомков, проживающих вблизи СИЯП. В работе заложена основа для дальнейших клинико-экспериментальных исследований по влиянию различных доз ионизирующего излучения на состояние иммунного статуса у потомства облученных организмов. Заключение Проведенные исследования и совокупность полученных результатов позволили прийти к следующим выводам: 1. У населения, проживающего в Абралинском и Бескарагайском районах Восточно-Казахстанской области, выявлены стабильные (транслокации) и нестабильные (дицентрические и кольцевые хромосомы) хромосомные аберрации. Интервал дозы хронического облучения у населения, проживающего вблизи СИЯП, составил 0,1-2,6 Гр. 2. Потомки, рожденные от родителей, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения, и проживающие в исследуемых районах, имеют повышенную частоту аберраций по сравнению с контролем. Основной их спектр представлен хроматидным типом. 3. Отдаленные соматические эффекты ионизирующего излучения у жителей изучаемых районов и их потомков характеризуются высокими показателями распространенности и риска болезней основных классов (болезней крови и кроветворных органов, эндокринной системы, системы кровообращения, болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани и органов дыхания). Частота соматических заболеваний положительно коррелирует с частотой хромосомных аберраций: r=0,52 - у лиц, подвергавшихся радиационному воздействию и r=0,68 - у их потомков. 4. Состояние иммунного статуса характеризуется формированием иммунологической недостаточности, что проявляется угнетением клеточных факторов, напряжением гуморального звена и функциональной недостаточностью фагоцитарного звена иммунитета. 30 5. В эксперименте у белых крыс сублетальные и фракционированные дозы гамма-излучения в клеточном звене иммунитета вызывают снижение числа СD8+ лимфоцитов на 24 % и 27 %, повышение СD4+ на 18 % и 17 % соответственно; малые дозы - на фоне лимфоцитоза вызывают снижение уровня СD3+ и СD4+ лимфоцитов на 29 % и 12 % и повышение числа СD8+ клеток на 8 %. В тимусе и лимфатических узлах тонкого кишечника происходит снижение количества лимфоидных клеток и лимфоидного индекса, атрофия тимуса и селезенки. 6. Cублетальные и фракционированные дозы гамма-излучения вызывают напряжение гуморального звена и активацию неспецифического фагоцитарного звена иммунитета у белых крыс. В сыворотке крови снижается концентрация ЦИК, уровень IL-2, TNF-α, увеличивается фагоцитоз, фагоцитарное число и НСТ-тест. Воздействие малых доз приводит к повышению СD19+лимфоцитов на 57 %, IL-6 в 1,9 раз, фагоцитарной активности лейкоцитов на 32 %, снижению концентрации ЦИК в сыворотке крови и уровня IFN-γ в 1,4 раза, и нормализует функциональную способность нейтрофилов. 7. У потомков облученных белых крыс, в клеточном звене иммунитета снижено количество CD3+ и CD4+лимфоцитов при нормальном содержании CD8+, активация гуморального и неспецифического фагоцитарного звена иммунной системы проявляется повышением количества CD19+клеток, АОК в селезенке и фагоцитарной активности нейтрофилов. Практические рекомендации по использованию результатов - Медико-генетической службе КГКП «Перинатальный центр г. Семей» рекомендуется формировать группы повышенного риска среди женщин фертильного возраста, родители которых подвергались прямому облучению в дозе 0,1-2,6 Гр. - Органам здравоохранения на местах совместно с медицинскими подразделениями Медицинского центра Государственного медицинского университета г. Семей и НИИ радиационной медицины и экологии проводить диспансеризацию групп радиационного риска, имеющих соматические заболевания различных органов и систем у лиц, и их потомков, проживающих на территориях, прилегающих к Семипалатинскому ядерному полигону. - Примененная экспериментальная модель облучения животных и их потомков может быть использована при изучении функционального состояния иммунной системы организма в отдаленном периоде после воздействия различных доз гамма-излучения. - Рекомендуется оценка показателей всех звеньев иммунитета при различных дозовых нагрузках гамма-излучения. В качестве отдаленных признаков радиационного воздействия на организм могут быть рекомендованы следующие показатели: фагоцитарная активность нейтрофилов, содержание Тлимфоцитов и их субпопуляций, АОК в селезенке, лимфокинпродуцирующая способность лейкоцитов, концентрация ЦИК, содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. 31 Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Апсаликов К.Н., Мадиева М.Р., Гусев Б.И., Абдыкаримова А.Г., Кошпесова Г.К., Берекенова Г.А. К вопросу о создании регистра лиц, подвергавшихся облучению в районе испытаний ядерного оружия на Семипалатинском ядерном полигоне. //Материалы Международной конф. по актуальным проблемам биологии, медицины и экологии.- Томск 5-8 февр., 2004.- № 1-3.- С. 367-368. 2. Гусев Б.И., Апсаликов К.Н., Пивина Л.М., Щербакова С.В., Рыженкова О.Н., Мансарина А.Е., Берекенова Г.А., Мадиева М.Р. Закономерности и особенности формирования групп радиационного риска среди населения районов Семипалатинской области Казахстана, подвергавшихся облучению в районе испытаний ядерного оружия. //Материалы II Межд. конф. «Radioactiviti and Radioactive Elements in Environmen». – Томск 18-22 октября, 2004.- С. 177180. 3. Мадиева М.Р., Турдунова Г.А., Абдыкаримова А.Г., Аргембаева Р.М., Адылканова А.М., Байбусинова Ж.Т. Разработка и внедрение новых технологий регистрации, анализа и реабилитации населения, пострадавшего в результате испытаний ядерного оружия на Семипалатинском ядерном полигоне //Труды молодых ученых Семипалатинской медицинской академии. - Семипалатинск 21-22 декабря, 2004. – С. 91-92. 4. K. Apsalikov, R. Rozenson, M. Madiyeva. Registry for radiation exposed near the SNTS //3rd Dosimetry Workshop on the Semipalatinsk Nuclear Test Site Area 10th Hiroshima Internаtional Symposium, 03.09. – 03.11.2005.- 41 р. 5. H. Katayama, K. Apsalikov, B. Gusev, M. Madiyeva, G. Koshpessova, A. Abdikarimova, H. Hoshi. Development of the Database for Epidemiological Research. //3rd Dosimetry Workshop on the Semipalatinsk Nuclear Test Site Area. 10th Hiroshima International Symposium, 03.09. – 03.11.2005.- 40 р. 6. Апсаликов К., Чайжунусова Н., Гусев Б., Жакупова С., Кокорина Л. Мадиева М. Предварительные данные по использованию биологической дозиметрии при реконструкции эффективных доз облучения населения // Материалы II Межд. научно-практической конф. «Семипалатинский испытательный полигон. Радиационное наследие и проблемы нераспространения».- Курчатов 6-8 сент., 2005. – Т. 2. - С. 126-132. 7. Апсаликов К. Мадиева М., Гусев Б., Чайжунусова Н., Исадилова М., Бейсенова Ш., Аргембаева Р. Методы и технологии формирования регистра облучавшегося населения Казахстана //Материалы II Международной научнопрактической конференции «Семипалатинский испытательный полигон. Радиационное наследие и проблемы нераспространения».- Курчатов 6-8 сент., 2005. - С.152-154. 8. Чайжунусова Н.Ж., Апсаликов К.Н., Гусев Б.И., Галич Б.В., Берекенова Г.Ф., Мадиева М.Р., Жакупова С.С. Биологическая дозиметрия у лиц, проживающих на территориях Семипалатинского ядерного полигона // Материалы III Международной научно-практической конференции 32 «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения».Северск-Томск 20-21 апреля, 2005. – 218 с. 9. Апсаликов К.Н., Гусев Б.И., Мадиева М.Р., Абдыкаримова А.Г., Бейсенова Ш.О., Аргембаева Р.М., Исадилова М.К. Концептуальные принципы и новые компьютерные технологии создания Государственного научного автоматизированного медицинского регистра населения Казахстана, подвергавшегося воздействию ионизирующей радиации. Методические рекомендации.- Семипалатинск, 2005.- 30 с. 10. Апсаликов К.Н., Гусев Б.И., Пивина Л.М., Мадиева М.Р. Формирование радиационных рисков заболеваемости раком пищевода и желудка среди населения южных районов Восточно-Казахстанской области, подвергшегося облучению в результате испытаний ядерного оружия в Китае //Наука и здравоохранение.- 2005.- № 4.- С.95-98. 11. H. Katayama, K. Apsalikov, B. Gusev, B. Galich, M. Madieva, G. Koshpessova, A. Abdikarimova and H. Hoshi. An Attempt to Develop a Database for Epidemiological Research in Semipalatinsk //Journal of Radiation Research.2006.-Vol. 47, Supplement A, February - P.189-197. 12. N. Chaizhunusova, T.C.Yang, C.Land, N. Luckyanov, H. Wu, K.N. Apsalikov and M. Madieva. Biodosimetry Study in Dolon and Chekoman Villages in the Vicinity of Semipalatinsk Nuclear Test Site //Journal of Radiation Research.2006.-Vol. 47, Supplement A, February.- P. 165-169. 13. Мадиева М.Р., Чайжунусова Н.Ж., Жетписбаев Б.А., Апсаликов К.Н. Методологические подходы, применяемые для оценки отдаленных последствий воздействия радиации на население Семипалатинского региона //Материалы Межд. научно-практической конф. «Актуальные проблемы экологии и пути их решения».- Семипалатинск 26-27 окт., 2006. - C. 275-277. 14. Жетписбаев Б.А., Узбекова С.Е., Сайдахметова А.С., Уразалина Н.М., Мадиева М.Р., Ильдербаев О.З. Система крови и отдаленные последствия радиации //Материалы Межд. научно-практической конф. «Актуальные проблемы экологии и пути их решения».- Семипалатинск 26-27 окт., 2006. - C. 246-253. 15. N. Chaizhunusova N., Madieva M., Zhakupova S., Galich B., Kerimbaeva G., Adilkanova A., Apsalikov K. Radiation Effects and Chromosome Aberration // Radiation Effects in Semihalaninsk. 12th Hiroshima International Symposium.- 03.09. – 02.03.2007.- P. 6-9. 16. Мадиева М.Р. Экологическая оценка биологического действия низких уровней ионизирующих излучений //Материалы Межд. научно-практической конф. «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии».Семипалатинск 19-20 окт., 2007.- С. 116-119. 17. Мадиева М.Р. Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения на здоровье потомков облученного населения (обзор) //Гигиена, эпидемиология және иммунобиология. - 2007.- № 3. - С.15-18. 18. Мадиева М.Р. Отдаленные последствия воздействия ионизирующего излучения: генетические эффекты (обзор) //Наука и здравоохранение.- 2007.- № 4.- С.13-16. 33 19. Мадиева М.Р. Медицинские последствия облучения населения малыми дозами (краткий обзор литературы) //Медицина и экология.- 2008.- № 1.- С.711. 20. Мадиева М.Р. Оценка нарушений здоровья лиц, являющихся потомками первого поколения облученного населения //Вестник СГУ им. Шакарима.- 2008.- № 3.- С. 55-57. 21. Мадиева М.Р. Распространенность болезней у первого поколения потомков лиц, проживающих в Бескарагайском и Абралинском районах ВКО // Наука и здравоохранение.-2008.- № 3.- С. 78-80. 22. Мадиева М.Р. Распространенность и риск болезней у потомков жителей некоторых районов Восточно-Казахстанской области, прилегающих к Семипалатинскому ядерному полигону //Гигиена, эпидемиология және имуннобиология.-2009.- № 2.- С.44-47. 23. Мадиева М.Р. Оценка нарушений здоровья лиц, являющихся потомками второго поколения облученного населения //Астана медициналық журналы.- 2009.- № 4.- С.51-53. 24. Мадиева М.Р. Принципы генетического мониторинга экологически неблагоприятных регионов //Материалы Межд. научно-практической конф.Семей 26-27 окт., 2009.- С.43-44. 25. Жетписбаев Б.А., Сайдахметова А.С., Танатова З.А., Оразбаева А.К., Мадиева М.Р. Состояние перекисного окисления липидов в легких и миокарде после фракционированного гамма-облучения //Наука и здравоохранение.-2009.Т.2, № 4.- С. 127-128. 26. Жетписбаев Б.А., Сайдахметова А.С., Танатова З.А., Оразбаева А.К., Мадиева М.Р. Нарушение метаболизма в легких и миокарде при радиационном поражении организма в эксперименте //Наука и здравоохранение.-2009.- Т.2, № 4.- С.153-154. 27. Сайдахметов А., Оразбаева А., Жумамбаева С., Узбеков Д., Мадиева М.Р. Состояние активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромосидазы в ближайшем и отдаленном периодах постлучевого воздействия // Институциональная аккредитация как фактор повышения качества образовательных услуг в МЕДВУЗЕ.- 2009.- С.89-90. 28. Сайдахметов А., Оразбаева А., Жумамбаева С., Узбеков Д., Мадиева М.Р. Обмен пуриновых нуклеотидов в ближайшем и отдаленном периодах постлучевого воздействия //Институциональная аккредитация как фактор повышения качества образовательных услуг в МЕДВУЗЕ.- 2009.- С.96-97. 29. Мадиева М.Р., Жетписбаев Б.А., Узбекова С.Е., Жетписбаева Х.С., Сайдахметова А.С., Рахыжанова С.О., Токешева Г.М. Состояние Т-системы иммунитета в отдаленном периоде после воздействия различных дозовых нагрузок гамма-излучения //Валеология, Здоровье, Болезнь, Выздоровление.2010.- № 2.- С.207-211. 30. Мадиева М.Р., Жетписбаев Б.А., Узбекова С.Е., Жетписбаева Х.С. Влияние различных дозовых нагрузок гамма-излучения на гуморальное звено иммунитета в отдаленном периоде //Валеология, Здоровье, Болезнь, Выздоровление.- 2010.- № 2.- С.211-214. 34 31. Мадиева М.Р., Жетписбаев Б.А., Узбекова С.Е., Жетписбаева Х.С., Сайдахметова А.С., Токешева Г.М., Рахыжанова С.О. Неспецифическая фагоцитарная резистентность в отдаленном периоде после воздействия различных доз гамма-излучения //Астана медициналық журналы.- 2010.- № 2 (60).- С. 162-165. 32. Свидетельство о государственной регистрации права интеллектуальной собственности «Способ прогнозирования генетических последствий облучения малыми дозами» /Мадиева М.Р., Чайжунусова Н.Ж., Жетписбаев Б.А., Манамбаева З.А. от 21.09.2010г, № 2010/1166.1.- 6 с. 35 Мәдиева Мәдина Рашидқызы Семей ядролық сынақ полигоны (СЯСП) маңындағы тұрғындардың кейінгі цитогенетикалық және соматикалық зардаптары, әр түрлі мөлшердегі γ - сәуленің әсерінен иммунологиялық статустың жағдайы (клиникалық-эсперименталдық зерттеу) Медицина ғылымының докторы дәрежесіне іздену диссертациясы 03.00.01 - радиобиология Тұжырым Жұмыста СЯСП зардап шеккен адамдардың және олардың ұрпақтарының денсаулық күйін иондаушы сәулелерден туындаған цитогенетикалық әсерлерді зерделеуді және иммундық жүйенің реакциясы механизмін анықтауды негізге ала отырып кешенді талдау ұсынылған. Зерттеу мақсаты: СЯСП маңында тұратын тұрғындарға иондаушы сәулелердің созылмалы әсерінің кейінгі цитогенетикалық зардаптарын, соматикалық аурулардың даму қаупін және γ–сәулелердің әр түрлі мөлшері әсерінен иммунды статусының жағдайын бағалау. Материалдар мен әдістер: жұмыс барысында клиникалық және эксперименттік материалдар қолданылған. Клинико–эпидемиялогиялық зерттеу диспансерлік бақылау әдісімен, ары қарай жалпы соматикалық аурулардың даму қаупін есептеу: негізгі топ Шығыс Қазақстан облысының Бесқарағай және Абралы аудандарында тұратын 908 адамнан және олардың ұрпақтарынан және бақылау тобы – Көкпекті ауданында тұратын 452 тұрғын алынды. Цитогенетикалық тексеру материалы ретінде 215 негізгі және 50 бақылау тобынан алынған адамдар мен олардың ұрпақтарының перифериялық қанының лимфоциттері алынды. Эксперименттік зерттеулер 200 жыныстық жетілген, дене массасы 180±20 г ақ егеуқұйрықтарға және олардың ұрпақтарына жүргізілді. Хромосомды аберрацияны-радиациялық зақымдалудың маркерлерін зерделеу стандартты және FISH - әдістерімен жүргізілді. 6 Гр, 1,5 Гр*4, 0,2 Гр мөлшердегі жалпы γ–сәулеленудің жануарлар ағзасының иммунологиялық жауабына әсері 30 күннен кейін (жақын арадағы) және 90 күннен кейін (кейінгі) зерттелді. Транслокация жиілігі негізінде СЯСП маңында тұратын тұрғындардың созылмалы сәулеленуінің 0,1-2,6 Гр мөлшер интервалы есептелді. Иондаушы сәуленің цитогенетикалық әсерлері радиационды – индуцирленген маркерлерде жоғары жиілікте көрінді: хромосомды аберрациялар 8,88±1,17 және 8,6±1,16 (бақылау – 6,74±0,93); дицентриялық және сақиналы хромосомалар саны 1,35±0,07 және 1,05±0,05 (бақылау – 0,58±0,05) сәйкесінше 500 жасушаға, транслокациялар 12,26±0,46 1000 жасушаға, оны радиациялық әсердің ретроспективті биоиндикациясына және биодозиметриясына қолдануға болады. Ұрпақта хромосомды типті аберрациялар жиілігі 2,16±0,15 және 2,37±0,15 36 құрады (бақылау – 1,87±0,17), хроматид типті аберрациялар жиілігі – 4,07±0,19 және 4,45±0,21 (бақылау–3,9±0,18) 500 жасушаға сәйкесінше, олардың қатынасы екі зерттелетін ауданда 1:1,9 (бақылауда – 1:2). СЯСП маңы тұрғындарының жалпы соматикалық ауруларға ұшырау қаупі мен тіркелген хромосомды аберрациялар жиілігі арасында жоғары корреляциялық тәуелділік байқалды (г=0,52; р<0,1). Ұрпақта ішкі мүшелер ауруларының таралуы бақылау топқа қарағанда 1,2 есе жоғарылады және хромосомды бұзылыстардың жиілігі жоғары деңгейде ауытқыды (г=0,68; р<0,01). Әр түрлі деңгейде радиациялық ластанған аумақтарда тұратын тұрғындардың иммунологиялық көрсеткіштері ұқсас өзгерістермен: иммунитеттің жасушалық тізбегінің көрсеткіштері төмендеуімен және фагоцитарлық тізбек қызметінің жеткіліксіздігімен сипатталды. Эксперименттік зерттеулер нәтижесінде иондаушы сәуленің 6 Гр; 1,5 Гр*4; 0,2 Гр мөлшердегі әсеріне иммундық жүйенің әр түрлі деңгейде жауап беретіндігі анықталды. Кейінгі кезеңде 6 Гр мөлшердегі γ–сәулелену (сублетальді) және 1,5 Гр*4 (фракционды) иммунитеттің жасушалық тізбегінде СD8+ жасушалардың төмендеуіне әкелді, ал аз мөлшер (0,2 Гр) лимфоцитоз фонында – СD3+ және СD4+ жасушалардың төмендеуін және СD8+ жасушалардың жоғарылауына әкелді. Иммунитеттің гуморальді тізбегінде сублетальді мөлшер көкбауырдағы АОК санының, қан сарысуындағы ЦИК концентрациясының, IL–6, TNF- төмендеуіне, супрессия индексінің және IFN- жоғарылауына әкелді. 0,2 Гр мөлшерде – СD19+ лимфоциттер және IL–6 жоғарылауына және қан сарысуының IFN- деңгейінің төмендеуіне әкелді. Фракцияланған мөлшердің әсері иммунитеттің гуморальді тізбегінде супрессия шақырды, ол СD19+ және бауырдағы АОК жоғарылауымен, супрессия индексінің, ЦИК концентрациясының және қан сарысуындағы TNF- мен IFN- төмендеуімен көрінді. Сублетальді және фракцияланған γ–сәулелену мөлшері арнайы емес фагоцитарлы иммунитет жүйесінің белсенділігін арттырды, ол фагоцитоздың, фагоцитарлық санның және НСТ–тесттің жоғарылауымен көрінді. Аз мөлшер лейкоциттердің фагоцитарлы белсенділігін жоғарлатты және нейтрофильдер қызметін қалпына келтірді. Сәулелендірілген ақ егеуқұйрықтардың ұрпағында, жасушалық тізбектің лимфоциттер субпопуляциясының саны СD3+ және СD4+ азайды, қалыпты жағдайда СD8+. Гуморальді және арнайы емес фагоцитарлы тізбекте СD19+ лимфоциттердің және нейтрофильдердің фагоцитарлық белсенділігінің абсолютті лейкоцитоз және лимфоцитоз фонында жоғарылауы байқалды, ол иммундық жүйенің белсенділігінің артқанын көрсетеді. СЯСП маңы тұрғындары арасында жүргізілген зерттеулер және негізі Қазақстанның басқа өңірлеріндегі халқы экологиялық жағымсыз аз иондаушы сәуле әсері жағдайында тұратын медициналық мекемелерде қолданылуы мүмкін. Жануарлар мен олардың ұрпақтарына жүргізілген эксперименттік модель әр түрлі γ–сәулелену мөлшеріне иммунды жүйенің жауап беруін зерделеуде қолданылуы мүмкін. 37 Madina Madiyeva The remote cytogenetic and somatic consequences at the population living close to Semipalatinsk Nuclear Test Site (SNTS), and a condition of the immune status under the influence of different doses γ - radiations (clinical-experimental research) Dissertation for competition of an academic degree of Doctor of Medicine 03.00.01-radiobiology Summary The complex analysis of people’s health and their progeny that were suffered from Semipalatinsk Nuclear Test Sites is shown in work on the basis of cytogenetic effects studying caused by ionizing radiation, and definition of reaction of mechanisms of immune system. Aim of the research: to value remote cytogenetic effects of chronic influence of ionizing radiation, risks of development of somatic diseases rate of population living close to SNTS, and condition of immune status under the influence of γ-radiation in experiment. Materials and methods: The clinical and experimental material is used in work. Clinical-epidemiological researches were fulfilled by pertaining to the dispensary observation method with the following calculation of risks of somatic diseases rate development: the basic group consisted of 908 people and their progeny, living in Beskaragaiskii and Abralinskii areas of East Kazakhstan, and group of control – of 452 inhabitants of Kokpekty area of East Kazakhstan. Material for cytogenetic inspection realization was the culture of peripheral blood lymphocytes of 215 people of the main and 50 people of control groups and their progeny. Experimental researches were realized on 200 white not thoroughbred adult rats of both sexes in weight of 180±20 gr and their progeny. Studying of chromosomal aberrations markers radiating damage were fulfilled by standard and FISH-methods. Influence of the general γ-radiation in a dose of 6 Gy; 1,5 Gy*4; 0,2 Gy on immunology reactance of an animals’ organism studied in 30 days (the nearest period) and 90 days (the remote period) after an irradiation. On the basis of translocations frequency, the interval of a dose of a chronic irradiation of population living close to SNTS is calculated: 0,1-2,6 Gy. Cytogenetic effects of ionizing radiation were shown by high frequency of the radiation-induced markers: chromosomal aberrations 8,88±1,17 and 8,6±1,16 (control - 6,74±0,93); the sums dysenteric and ring chromosomes 1,35±0,07 and 1,05±0,05 (control 0,58±0,05) accordingly for 500 cells, translocations 12,26±0,46 on 1000 cells that can be used for retrospective bioindication and biodosimetry of radiating influence. At the generation of persons frequency of chromosomal type aberrations has made 2,16±0,15 and 2,37±0,15 (control–1,87±0,17), frequency of aberrations chromotyde 38 type - 4,07±0,19 and 4,45±0,21 (control - 3,9±0,18) on 500 cells, accordingly, their parity 1:1,9 in two investigated areas (in control - 1:2). High correlation dependence has been revealed between frequency of registered chromosomal aberrations and risks of development of somatic diseases rate at the population living close to SNTS (r=0,52; p<0,1). Prevalence of internal illnesses at the generation of persons exceeded the data of control group in 1,2 times and also with high degree correlated with frequency of chromosomal infringements (r=0,68; p <0,01). Immunological indicators at the population, living in territories with various degree of radioactive pollution, were characterized by similar changes: decrease of indicators of cellular link of immunity and functional insufficiency of phagocyte link. Results of experimental researches have revealed various degree of reaction of immune system on ionizing radiation influence in doses of 6 Gy; 1,5 Gy*4; 0,2 Gy. In the remote period γ-irradiation in doses of 6 Gy (sublethal) and 1,5 Gy*4 (fractional) in a cellular link of immunity caused to decrease in number СD8+ cells, and a small dose (0,2 Gy) against lymphocytes’- to decrease in quantity СD3 + and СD4 + cells and to increase of number СD8 + cells. In a humoral link of immunity the sublethal dose led to decrease in number АFC in a spleen, concentration of the CIC in serum of blood, maintenance IL-2, TNF-α, to increase of index of suppression and maintenances IFN-γ. In a dose of 0,2 Gy led to increase СD19+ lymphocytes and IL-6, to decrease in concentration of the CIC and level IFN-γ in serum blood. Influence fractional doses is made suppression in a humoral link of the immunity, shown by increase СD19+ and normalization of АFC in a spleen, index decrease suppression, concentration of the CIC and maintenances TNF-α and IFN-γ in serum blood. Sublethal and fractional γ-irradiation dose made active nonspecific phagocyte section of immunity shown by increase phagocytos, phagocyte number and the NBTtest. The small dose caused increase phagocyte activity of leukocytes and normalization of functional ability of neutrophiles. In generations of the white rats, were irradiated, in a cellular link the quantity of subpopulations of lymphocytes CD3+ and CD4+ is lowered at normal maintenance CD8+cells. In humoral and nonspecific phagocyte components of immune system was observed increase CD19+ lymphocytes and phagocyte activity of neutrophiles against absolute leucocytoses and lymphocytoses is testified about activation of immune system. Substantive provisions and results of the conducted research among the population living close SNTS can be used by medical institutions of other regions of Kazakhstan, which population lives in ecologically adverse conditions of influence of small doses of ionizing irradiation. The experimental model of an irradiation of animals and their generations can be used for studying of reaction of immune system on various doses of γ-irradiation. 39 Подписано в печать 2.11.2010 г. Формат 60x84/16 Усл. печатные листы 2,5 Тираж 100 экз. Заказ № 3764 071400, г. Семей Полиграфический центр «PRINTMASTER» ул. Б. Момышулы,20 тел. 52-22-11 40
