Медицинской технологии №ФС-2007/015У

Федеральное Государственное Учреждение
«Российский научный центр рентгенорадиологии
Федерального агентства по высокотехнологичной
медицинской помощи»
Институт Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
Биологическая индикация радиационного
воздействия на организм человека с
использованием цитогенетических методов
Медицинская технология №ФС-2007/015-У
Москва 2007
2
3
АННОТАЦИЯ
Представлена усовершенствованная медицинская технология цитогенетического
обследования лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в результате
профессиональной деятельности или радиационных аварий. Представлены возможности
использования цитогенетических методов для оценки уровня облучения людей, как в
ранние сроки, так и в отдаленном периоде после радиационного воздействия.
Медицинская технология предназначена для врачей-лаборантов, врачей-генетиков.
Медицинская технология может быть использована в центрах медицины катастроф
(федеральных, региональных, территориальных), в диагностических центрах, в центрах
государственного санитарно-эпидемиологического надзора в субъектах Российской
Федерации и Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем
Минздрава России.
Учреждение
разработчик
ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии
Росмедтехнологий», 117997, ГСП-7, Москва, ул. Профсоюзная, д.86
Соразработчик:
Институт Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.3
Разработчики:
Снигирева Г.П.
- ведущий научный сотрудник отдела радиационной медицины РНЦРР,
кандидат биологических наук
Богомазова А.Н. - биолог отдела радиационной медицины РНЦРР, кандидат биологических наук
Новицкая Н.Н.
- инженер-химик отдела радиационной медицины РНЦРР
Хазинс Е.Д.
- инженер-программист отдела радиационной медицины РНЦРР
Рубанович А.В. - заведующий лабораторией радиационной генетики ИОГен РАН,
доктор биологических наук
Рецензенты:
Домрачева Е.В. - руководитель кариологической лаборатории ФГУ ГНЦ РАМН,
доктор медицинских наук, профессор;
Федоренко Б.С. - руководитель лаборатории радиобиологии ФГУ ГНЦ РФ – ИМБП
РАН, доктор биологических наук
4
ВВЕДЕНИЕ
В профессиональных условиях работы с источниками ионизирующих излучений
возможно возникновение нештатных ситуаций, когда определение поглощенной дозы с
помощью физической дозиметрии может быть ограничено или невозможно. В этих
случаях могут быть применены биологические методы дозиметрии, которые позволяют
оценить суммарный эффект от воздействия радиации с учетом индивидуальных
особенностей облученного организма. Такая информация имеет, несомненно, большое
значение для оказания своевременной эффективной помощи в случае острого
радиационного воздействия, а также для прогностической оценки возможных отдаленных
последствий облучения.
Наибольшее распространение получили методы биодозиметрии, основанные на
анализе частоты радиационно-индуцированных генетических изменений в соматических
клетках – геномных, хромосомных или генных мутаций. Одним из самых разработанных
и
обоснованных
является
цитогенетический
метод,
при
котором
в
качестве
биологического маркера облучения используются хромосомные аберрации в лимфоцитах
периферической крови. Материалы многочисленных отечественных и зарубежных
цитогенетических исследований послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ,
МАГАТЭ, НКДАР ООН по практическому использованию данного метода при
определении доз облучения (WHO, 1976; UNSCEAR, 1982; IAEA, 1986).
Радиобиологической основой для применения цитогенетического метода в
дозиметрии является высокая чувствительность лимфоцитов периферической крови, а
также наличие специфичных для радиации хромосомных перестроек, дозовая зависимость
частоты которых для большинства видов ионизирующих излучений хорошо изучена. Под
воздействием радиации могут возникать два типа хромосомных аберраций: нестабильные
(дицентрики,
центрические
кольца,
ацентрические
фрагменты)
и
стабильные
(реципрокные и другие типы транслокаций). Чаще всего для оценки величины
поглощенной организмом дозы используют частоту возникновения обменных аберраций
нестабильного типа, а именно, дицентрических хромосом. Преимущество дицентриков
состоит в том, что аберрации данного типа являются специфичными для воздействия
ионизирующих излучений, их легко обнаружить в световом микроскопе без применения
сложных методов обработки и окрашивания хромосомных препаратов. Однако следует
иметь в виду, что клетки, несущие такие аберрации, образуют при делении генетически
несбалансированные клетки, что в дальнейшем приводит к их элиминации. Поэтому
успешное применение нестабильных аберраций для определения дозы облучения в
5
основном возможно в ранние (до 3 - 4 месяцев) сроки после однократного, относительно
равномерного радиационного воздействия. В случае хронического облучения и при
ретроспективной оценке дозы радиационного воздействия необходимо применение
различных математических моделей, учитывающих либо процесс элиминации подобных
клеток из кровотока, либо особенности распределения аберраций по клеткам
Определить степень радиационного поражения организма, а также оценить дозу
облучения спустя длительное время после радиационного воздействия или в случае
хронического облучения можно с помощью стабильных хромосомных аберраций
(транслокаций) в лимфоцитах периферической крови. Это возможно благодаря тому, что
такие повреждения хромосом не нарушают течения митоза и могут передаваться в ряду
клеточных поколений, то
есть
частота
транслокаций
не должна подвергаться
значительным изменениям со временем.
В последние годы для определения частоты стабильных хромосомных аберраций
(транслокаций) широко используют новый молекулярно-генетический метод – FISH
(fluorescence in situ hybridization), который позволяет визуализировать отдельные
хромосомы или участки хромосом. Он основан на флуоресцентном окрашивании
хромосом или отдельных участков хромосом после гибридизации in situ с использованием
хромосомо-специфичных ДНК-зондов. В препаратах метафазных хромосом, окрашенных
с помощью FISH метода, структурные нарушения легко распознаются, поэтому скорость
анализа препаратов значительно выше, чем при использовании дифференциального
окрашивания, и, кроме того, не требуется долгое обучение исследователя.
Показания к использованию медицинской технологии
Возможное радиационное воздействие на организм человека в результате различных
чрезвычайных и аварийных ситуаций.
Противопоказания к использованию медицинской технологии
Противопоказаний к применению метода нет.
Материально-техническое обеспечение медицинской технологии
Для осуществления медицинской технологии используется стандартный комплект
оборудования и реактивов для проведения цитогенетического обследования, согласно
приказу МЗ РФ № 316 от 30.12.1993 г.
6
Описание медицинской технологии
Цитогенетическое исследование включает следующие основные стадии:
1. Получение препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической
крови.
2. Окрашивание препаратов.
3. Микроскопический анализ и статистическая обработка результатов.
Получение препаратов хромосом из лимфоцитов периферической крови
В заранее приготовленные стерильные пробирки с гепарином (50 -100 ед.
гепарината лития в расчете на 1 мл крови) вносят 5 - 6 мл крови и закрывают стерильной
пробкой. Для постановки культуры обычно используют цельную кровь, можно также
использовать плазму, обогащенную лейкоцитами. Для этого применяют осторожное
центрифугирование крови (800-900 об/мин) в течение 40 - 50 мин, после чего стерильной
пипеткой собирают пленку лейкоцитов, располагающуюся на границе эритроцитов с
плазмой. Наилучшие результаты получаются при использовании свежей крови, тем не
менее, можно получить удовлетворительный митотический индекс и после хранения
стерильной крови при комнатной температуре в течение нескольких дней, при этом лучше
хранить плазму с лейкоцитами.
 Приготовление культуральной среды
Описанные ниже процедуры проводят, строго соблюдая условия стерильности.
Состав культуральной среды:

Питательная среда (типа RPMI-1640, Игла или 199);

15-17% сыворотки (крупного рогатого скота, телячьей или эмбриональной телячьей);

2 мМ глутамина;

антибиотики - пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (0,1 мкг/мл).
Стерильным шприцем или пипеткой разливают по 4.5 мл культуральной среды во
флаконы и закрывают крышками. В таком виде среда для культивирования при
о
необходимости может храниться при t = -20 С в течение месяца.
Во флаконы с культуральной средой (4,5 мл) стерильной пипеткой вносят по 0,5 мл
крови или плазмы, обогащенной лимфоцитами, добавляют 5-бромдезиксиуридин (БДУ) в
конечной концентрации 3-6 мкг/мл, 2 – 2,5% фитогемагглютинина
и помещают в
о
термостат при t=37 С.
Для накопления клеток на стадии метафазы митоза используют ингибиторы
образования веретена деления – колхицин или колцемид. Конечная концентрация
7
колхицина в культуральной среде должна быть не более 0,25 – 0,40 мкг/мл, колцемида –
0,1–0,2 мкг/мл. Такие количества блокирующего вещества позволяют получить
достаточное количество метафаз без заметного токсического эффекта, который может
иметь место при более высоких концентрациях. Удобным для использования является
раствор колцемида в физиологическом растворе с концентрацией 5 мкг/мл. Стерильно
о
приготовленный раствор колцемида можно хранить при t=4 С в течение нескольких
месяцев. Через 45 часов от начала культивирования 0.15 мл такого раствора добавляют в
о
каждый флакон, культуру клеток перемешивают и оставляют в термостате при t=37 С на 3
часа.
По окончании
инкубации с колцемидом (или колхицином) тщательно
перемешивают содержимое флаконов и переливают в 15 мл центрифужные пробирки.
Дальнейшая обработка клеточной суспензии проходит при комнатной температуре.
Пробирки центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5-8 мин для осаждения клеток.
Затем пастеровской пипеткой или при помощи водоструйного насоса отбирают
супернатант, оставляя около 0,5 мл надосадочной жидкости. Осадок из клеток
о
ресуспендируют в 8-10 мл гипотонического раствора, предварительно нагретого до 37 С.
В качестве гипотонического раствора можно использовать 0,56% раствор хлористого
калия; раствор, содержащий равные количества 0,56% раствора хлористого калия и 0,95%
раствора цитрата натрия; раствор Хенкса, разбавленный дистиллированной водой в
объемном соотношении 1 к 4. Пробирки с гипотоническим раствором на 15 мин
о
помещают в термостат при t=37 С, затем их снова центрифугируют при 1000 об/мин в
течение 5 мин, удаляют гипотонический раствор, оставляя 0,5 мл супернатанта. Общее
время
гипотонической
обработки
должно
быть
примерно
20-25
мин.
Точная
продолжительность гипотонической обработки подбирается опытным путем.
После гипотонии к клеточному осадку добавляют свежеприготовленный холодный
фиксатор (смесь метилового спирта с ледяной уксусной кислотой в объемном
соотношении 3 к 1). Фиксатор добавляют медленно, равномерной струйкой, постоянно
перемешивая при помощи вихревого смесителя или пастеровской пипетки для
предотвращения образования комков или агрегатов клеток. Через несколько минут (за это
время
происходит
полное
разрушение
центрифугированием при 1000 об/мин
эритроцитов)
клетки
осаждают
в течение 5 мин, отбирают супернатант и
добавляют к осадку 5 - 7 мл свежего фиксатора. Эту процедуру повторяют 3 - 4 раза, при
этом полная продолжительность фиксации клеток должна составлять не менее 30 - 40
мин. Замену фиксатора прекращают, когда клеточный осадок приобретает белый цвет.
8
При последней промывке удаляют супернатант, оставляя примерно 0,25 – 0,5 мл
клеточной суспензии.
 Приготовление препаратов хромосом
Одним из условий для получения качественных препаратов хромосом является
подготовка предметных стекол. Поверхность стекла должна быть идеально чистой!
Клетки тщательно ресуспендируют в оставшемся фиксаторе с помощью пастеровской
пипетки, наносят 3 капли клеточной суспензии с высоты около 10 см на предметное
о
стекло и высушивают его на термоплате при t = 45 – 48 С. Качество препарата оценивают
под микроскопом. Хороший препарат должен содержать при малом увеличении (200) в
поле зрения не менее 1 - 2 метафазных пластин с расправленными хромосомами без
взаимных наложений. При необходимости, если клеток очень много, можно разбавить
суспензию
фиксатором
или
наоборот,
если
их
мало,
можно
осадить
клетки
центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и затем отобрать некоторое
количество супернатанта.
Препараты метафазных хромосом, предназначенные для анализа нестабильных
хромосомных аберраций, перед окрашиванием выдерживают в темноте при комнатной
температуре
в
течение
3-5
дней.
Препараты
метафазных
хромосом,
которые
предназначены для анализа стабильных хромосомных аберраций, рекомендуется
использовать для окрашивания в течение первых двух недель после приготовления,
оптимальным сроком хранения считается неделя. Для более длительного хранения
препараты метафазных хромосом помещают в герметично запаянные полиэтиленовые
о
пакеты, заполненные газообразным азотом, и хранят в холодильнике при –20 С.
о
Возможно также хранение клеток в виде фиксированной клеточной суспензии при –20 С.
Анализ нестабильных хромосомных аберраций
Окрашивание методом «флуоресценция плюс краситель Гимза» (FPG метод)
1. Поместить стекла в ванночку с раствором красителя Hoechst 33258 в PBS
(конечная концентрация 0,25 мкг/мл) и выдерживать при комнатной температуре
в темноте в течение 15 мин.
2. Поместить ванночку со стеклами на термоплату (t = 60оС) под ультрафиолетовую
лампу (265 нм) на 20 мин.
3. Вынуть стекла из раствора красителя, промыть проточной дистиллированной
водой.
9
4. Опустить стекла на 5 мин в 5% раствор красителя Гимза в фосфатном буфере (pH
6,8).
5. Промыть стекла в дистиллированной воде и высушить на воздухе.
Препараты просматривают в световом микроскопе при малом увеличении (160
или 200) и выбирают для анализа хорошо окрашенные метафазные пластинки, без
наложений хромосом. Затем при увеличении 1000 под масляной иммерсией анализируют
только метафазы I митоза, хромосомы которых равномерно окрашены (метафазы II митоза
имеют «арлекинную» окраску) и имеют в сумме 46 центромер. Учитывают все типы
хромосомных аберраций и заносят их в специальный протокол. При биодозиметрических
исследованиях особое внимание уделяют дицентрическим и кольцевым хромосомам,
которые являются маркерами радиационного воздействия.
Анализ стабильных хромосомных аберраций
Для обнаружения транслокаций применяют метод окрашивания, основанный на
гибридизации in situ с использованием ДНК проб, специфичных к отдельным хромосомам
человека, т. н. FISH метод. Метод FISH основан на способности хромосомной ДНК (ДНКмишень) связываться в определенных условиях с фрагментами меченной ДНК (ДНКзонд), включающими нуклеотидные последовательности, комплементарные ДНК-мишени.
Ниже описана модифицированная методика гибридизации in situ Пинкеля (Pinkel et
al.,1986)
с
использованием
в
качестве
зондов
биотинилированных
ДНК_проб,
специфичных к отдельным хромосомам человека, а также панцентромерных ДНК-проб,
меченных дигоксигенином.
Можно использовать готовые наборы для анализа транслокаций фирмы
MetaSystems
(http://www.metasystems.de).
При
работе
следует
руководствоваться
инструкцией, прилагаемой к набору.
 Предварительная обработка препаратов метафазных хромосом
Хорошее качество препаратов метафазных хромосом является залогом успешной
гибридизации in situ. Важно, чтобы хромосомы на стекле располагались относительно
свободно, без взаимных наложений, чтобы количество окружающей их цитоплазмы было
минимальным. При большой плотности клеточного материала на стекле реакция
гибридизации может быть неэффективной и /или может наблюдаться интенсивный фон
вследствие неспецифического связывания ДНК-зонда. Существуют разные способы
предварительной обработки препаратов, позволяющие избавиться от нежелательных
10
эффектов. Ниже приведены описания процедур, с помощью которых можно улучшить
качество метафазных препаратов.
 Обработка пепсином
Предварительная обработка препаратов пепсином позволяет в некоторых случаях
избавиться от нежелательного фона. Данная процедура не является обязательной.
Поместить сосуд Коплина со 100 мл дистиллированной воды в водяную баню при
о
t=37 С. За 15 мин до работы со стеклом в воду добавить 100 мкл 10 N HCl, за 10 мин до
обработки пепсином добавить 50 мкл 10% пепсина.
1.
Поместить стекло на 2 мин в PBS при комнатной температуре.
2.
Поместить стекло в 10% раствор пепсина на 10 мин, t= 37 С.
3.
Перенести стекло в сосуд Коплина с PBS на 2 мин при комнатной температуре.
4.
Промыть стекло в течение 2 мин в растворе PBS/MgCl2 при комнатной
о
температуре на шейкере.
 Обработка параформальдегидом
Обработка параформальдегидом позволяет лучше сохранить структуру хромосом в
процессе их окрашивания.Эта процедура также не является обязательной.
1. Погрузить стекло на 1 мин при комнатной температуре в 0,25% раствор
параформальдегида.
2.
Промыть стекло в течение 2 мин в PBS при комнатной температуре.
Использовать шейкер.
3.
Провести стекло через серию спиртов - 70%, 90% и 100% растворы по 2 мин
при комнатной температуре.
4.
Просушить стекла на воздухе или струей газообразного азота.
 Денатурация и гибридизация.
Необходимо заранее приготовить 70% раствор формамид/2*SSC в сосуде Коплина
о
и нагреть его до 72 С на водяной бане.
Обработанное с помощью параформальдегида стекло помещают в 70% раствор
формамида
на
4
мин
при
о
t=72 С.
Для
стекол,
не
прошедших
обработку
параформальдегидом, время денатурации сокращается до 2 мин.
о
Из 70% раствора формамида стекла перенести в охлажденный до t=-20 С 70%
этанол на 2 мин, далее инкубировать по 2 мин в 90% и 100% этаноле при комнатной
температуре. Просушить стекла на воздухе или струей газообразного азота.
11
о
Поместить стекла на термоплату, t=37 С, нанести гибридизационную смесь,
покрыть покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырей воздуха и заклеить края
покровного стекла резиновым клеем. Дождаться, пока клей высохнет, положить стекла в
о
предварительно прогретую влажную камеру и поместить ее в термостат t=37 С. Для
успешной гибридизации достаточно 12 – 18 часов, в случае необходимости можно
продлить срок гибридизации до 3 суток.
 Состав и приготовление гибридизационной смеси
При приготовлении гибридизационной смеси необходимо работать только в
перчатках, желательно проавтоклавировать используемую одноразовую пластиковую
посуду и бидистиллированную воду при 1 атм 120 мин.
Гибридизационную смесь с хромосомными пробами для одного стекла готовят в
одной микропробирке (конечный объем гибридизационной смеси для 3-х хромосом – 30
мкл). Гибридизационную смесь с панцентромерной пробой готовят в отдельной
микропробирке.
Перед
нанесением
на
стекло
содержимое
микропробирок
с
хромосомными пробами и панцентромерной пробой объединяют. Когда качество проб
неизвестно и требуется определить наиболее оптимальные для конкретных проб
концентрации, используется стандартный состав проб (Таблица 1). В случае недостаточно
хорошего окрашивания хромосом-мишеней при стандартном составе гибридизационной
смеси следует увеличить количества проб тех хромосом, которые плохо окрашиваются,
при
этом
следует,
соответственно,
уменьшить
количество
добавляемой
бидистиллированной воды (вплоть до 0 мкл) и/или Cot-1 ДНК (общее конечное
количество можно уменьшить до 4 мкл). Количество Master Mix 1.0 и конечный объем
гибридизационной смеси менять нельзя!
Таблица 1. Стандартный состав гибридизационной смеси для окрашивания
хромосом по методу FISH с использованием ДНК-проб для хромосом 1, 4 и 12 и
панцентромерных проб
Исходные реагенты
ДНК-проба (150 мкг/мл)
Master Mix 1,0
Cot-1 ДНК человека (1 мг/мл)
H20 бидистилл.
Конечный объем
#1 *
мкл
1,0
7,0
2,0
10,0
#4 *
мкл
1,0
7,0
2,0
10,0
#12 *
мкл
1,0
7,0
1,0
1,0
10,0
Панцентромерная
проба **, мкл
3,0
7,0
10,0
* Биотинилированные ДНК пробы, специфичные к хромосомам 1, 4 и 12, получают при
помощи ник-трансляции Hind III библиотек pBS-1, pBS-4 и pBS-12. Концентрация ДНК-проб
варьирует от 150 до 200 мкг/мл.
** Меченные при помощи digoxigenin-dUTP панцентромерные пробы получают с
использованием полимеразной цепной реакции. Концентрация панцентромерных проб варьирует
от 100 до 250 мкг/мл.
12
1.
Пробирки с хромосомными пробами, Cot-1 ДНК и Master Mix 1.0 достать из
холодильника. Разморозить, отцентрифугировать на миницентрифуге в течение
нескольких секунд, затем желательно поставить в лед.
2.
Компоненты гибридизационной смеси с помощью автоматической микропипетки
перенести в микропробирку (каждый компонент своим носиком, носик не
использовать вторично даже в случае, когда отбирается один и тот же компонент
смеси). Отцентрифугировать на микроцентрифуге в течение 2 - 3 сек, перемешать на
шейкере и снова отцентрифугировать.
3.
Поместить микропробирку с гибридизационной смесью на 5 мин в водяную баню, t
о
= 72 С.
4.
Поместить микропробирку с гибридизационной смесью для быстрого охлаждения на
лед на несколько секунд.
5.
Микропробирку с гибридизационной смесью и хромосомными пробами поместить в
о
термостат (37 С) на 30 – 60 мин.
6.
Денатурация панцентромерной ДНК-пробы также проводится на водяной бане при t
о
= 72 С в течение 5 мин. и затем переносится в лед для быстрого охлаждения на 1 – 5
мин.
7.
Содержимое двух микропробирок (с гибридизационной смесью, хромосомными
пробами и с панцентромерной пробой) смешать непосредственно перед нанесением
гибридизационного коктейля на стекло.
8.
Для этого следует отцентрифугировать микропробирку с панцентромерной пробой
на микроцентрифуге, перенести ее содержимое в микропробирку с хромосомными
пробами и гибридизационной смесью, отцентрифугировать, тщательно перемешать
на шейкере и снова отцентрифугировать.
9.
Нанести гибридизационный коктейль на препарат, покрыть покровным стеклом
(24*50 мм2), заклеить края покровного стекла резиновым клеем. После засыхания
клея препарат поместить в предварительно прогретую влажную камеру, и поместить
о
на ночь в термостат, t = 37 С.
 Послегибридизационные отмывки и флуоресцентное окрашивание.
1.
о
Поместить 4 сосуда Коплина с 50% раствором формамида в водяную баню, t=42 C.
Приготовить 300 мл раствора 0,1*SSC, разлить по трем сосудам Коплина, поместить
о
их в водяную баню, t = 60 C.
13
2.
Снять пинцетом резиновый клей со стекла. Для того, чтобы смыть покровное стекло,
о
препарат погрузить на 5 мин в 50% раствор формамида, t=42 C. После удаления
покровного стекла препарат должен оставаться в первом растворе формамида 5 мин.
о
3.
Повторить трижды по 5 мин отмывку в 50% растворе формамида, t= 42 C.
4.
Трижды по 5 мин отмывать в 0,1*SSC при t=60 C. При проведении окрашивания на
о
вторые митозы на этой стадии удобно провести обработку стекол раствором Hoeсhst
(как описано выше).
5.
Поместить стекло в PN-буфер на 5 мин при комнатной температуре.
6.
Нанести на стекло 100 мкл PNM буфера, покрыть пленкой из плотного полиэтилена и
о
поместить стекло во влажную камеру. Поставить влажную камеру в термостат t=37 C
на 20 мин.
7.
После обработки PNM буфером пленку аккуратно снять, препарат поставить
вертикально, чтобы стекли остатки PNM буфера, при этом стекло не должно
высыхать.
8.
На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов
антидигоксигенина
и
стрептавидина-FITC,
покрыть
полиэтиленовой
пленкой,
поместить стекло во влажную камеру. Окрашивание происходит в темноте в течение
20 мин при комнатной температуре.
9.
Промыть дважды по 2 мин в PN-буфере. Использованный буфер выливается.
10. На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов
биотинилированного антистрептавидина и антител IgG Rat-anti-Mouse-AMCA,
покрыть полиэтиленовым покровным стеклом, поместить стекло во влажную камеру,
окрашивание вести в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре.
11. Промыть дважды по 2 мин в PN-буфере.
12. На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов
стрептавидина-FITC и антител IgG Mouse-anti-Rat-AMCA, покрыть полиэтиленовым
покровным стеклом, поместить стекло во влажную камеру, окрашивание вести в
темноте в течение 20 мин при комнатной температуре.
13. Стекло промыть дважды по 2 мин в PN-буфере.
14. Поставить стекло на несколько секунд вертикально для того, чтобы стекли излишки
PN-буфера. Нанести на стекло 22 мкл раствора пропидия иодида в Antifade (PI),
покрыть покровным стеклом (24*50мм2), под микроскопом оценить качество окраски.
Если требуется дополнительное окрашивание, то следует аккуратно смыть покровное
стекло в PN-буфере и повторить последовательно стадии 10, 11, 12, 13. Готовые
14
о
окрашенные препараты хранят при 4 С. Если в процессе микроскопирования и/или
хранения выцвел FITC, то можно «освежить» окраску, вновь проделав стадии 10, 11,
12, 13 флуоресцентного окрашивания.
 Микроскопический анализ хромосомных аберраций
Готовые препараты анализируют на флуоресцентном микроскопе с помощью
набора фильтров, один из которых позволяет наблюдать одновременную флуоресценцию
FITC и PI, второй - АМСА-флуоресценцию, третий фильтр обеспечивает флуоресценцию
только PI.
При использовании ДНК-проб для хромосом 1, 4, 12 и флуорохромов FITC, PI и
AMCA две пары хромосом (4 и 12) полностью окрашиваются в желтый цвет. Хромосомы
1 окрашены в желтый цвет, исключая небольшую дистальную часть короткого плеча и
околоцентромерную область, которые окрашены в красный цвет, так же как и другие
хромосомы после окрашивания пропидий иодидом. Центромеры после гибридизации с
панцентромерными пробами окрашены в голубой цвет. Если все шесть окрашенных
хромосом в клетке являются интактными, клетку признают «нормальной». При наличии в
клетке аберрации с участием окрашенной желтой хромосомы, по возможности,
учитывают, какая именно хромосома участвовала в данной аберрации. Конфигурацию,
при которой в клетке имеются две двуцветные хромосомы, взаимно обменявшиеся своими
частями, расценивают как «полную» транслокацию Если в клетке одна двуцветная
хромосома, а все остальные 45 хромосом красные, транслокацию считают «неполной».
Классификация
дицентриков,
центрических
колец
и
ацентрических
фрагментов
принципиально не отличается от принятой в рутинном анализе.
Для анализа частоты транслокаций FISH методом могут быть использованы ДНКзонды для самых разных комбинаций хромосом:1, 4 и 12; 1, 4 и 8; 1, 2 и 4 и т.д. Для того,
чтобы сравнивать результаты таких исследований удобно использовать значения
геномной частоты транслокаций (FG) и клеточного эквивалента (Neq). Для их определения
используют следующие формулы (Lucаs et al., 1992):
FG=FP/2,05*fP*(1-fP),
Neq=2,05*fP*(1-fP)*N,
где FP – наблюдаемая частота транслокаций с участием «окрашенных» хромосом;
N – число проанализированных метафаз, а fP- доля генома, которую составляют
«окрашенные»
хромосомы
(т.е.
относительное
содержание
ДНК
«окрашенных»
хромосом). Для хромосом 1, 4 и 12 эта величина составляет 0,19 (Mendelson et al., 1973).
15
Реконструкция дозовой нагрузки по частоте хромосомных аберраций
Для оценки доз в случае острого радиационного воздействия в ранние сроки после
облучения проводят анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах
периферической крови классическим цитогенетическим методом. При ретроспективном
обследовании, а также в случаях хронического или пролонгированного облучения
необходимо проводить анализ стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови
FISH методом. При реконструкции дозовой нагрузки в первую очередь необходимо
оценить уровень значимости различий между спонтанной частотой аберраций и частотой
аберраций у облученного пациента (группы пациентов). Если различия являются
статистически
значимыми,
то
оценивают
дозу
облучения
с
использованием
калибровочных кривых «доза-эффект».
Определение статистической значимости наблюдаемых различий
частот аберраций
Как уже указывалось выше, статистический анализ цитогенетических данных
следует начинать с выяснения вопроса о достоверности повышения частоты аберраций у
облученного пациента (группы). Эта стандартная процедура в случае обработки
результатов цитогенетического анализа имеет ряд специфических особенностей, что
связано с трудностями, возникающими при сравнении частот редких событий. Следует
отметить,
что
многочисленные
дискуссии
вокруг
методов
биодозиметрии
и
радиобиологии малых доз в большинстве случаев связаны со статистической обработкой
полученных результатов. При сравнении частот хромосомных перестроек наиболее
адекватно
использование
точного
критерия
Фишера,
поскольку
стандартные
параметрические критерии (различные модификации t-критерия Стьюдента) являются
слишком консервативными в данной ситуации, а для применения непараметрического
теста 2 необходимо выявить не менее 5 аберраций как в опыте, так и в контроле. Суть
точного критерия Фишера заключается в точном вычислении вероятности Р в
предположении, что облученная и контрольная группы неразличимы по частоте
аберраций. При анализе цитогенетических данных число проанализированных клеток Ni
значительно превышает число выявленных аберраций ni (Ni>>ni). В этом случае значение
Р приблизительно равно:
n
0
P   C n q k (1  q ) n  k ,
k
k 0
где q=N0/N1, N0 и N1 – число просмотренных клеток в контроле и опыте соответственно,
N=N0+N1, n0 и n1 – число обнаруженных хромосомных перестроек, n=n0+n1, C Nn – число
16
сочетаний из N элементов по n. В формуле для вычисления Р член с номером k=n0
превосходит остальные приблизительно на порядок. Его можно использовать для
первичных оценок значимости различий на калькуляторе:
n
n
n!  N0  0  N1  1
P
n ! n !  N   N 
0 1
Если эта вероятность Р выше 0,05, то различия между контролем и опытом нельзя считать
достоверными.
В состав некоторых стандартных статистических пакетов входят программы для
вычисления точного критерия Фишера, однако, при их применении следует иметь в виду,
что большинство таких программ (например, Statistiсa, SPSS и многие другие, кроме SPlus и Mathematica) не позволяют сравнивать случаи с большим количеством
просмотренных клеток.
В таблице 2 и 3 приведены значения вероятности Р, вычисленные согласно
точному критерию Фишера для некоторых конкретных количеств просмотренных клеток
и выявленных нестабильных и стабильных обменных аберраций соответственно. В
качестве контрольной группы была использована группа жителей Московского региона,
обследованных авторами, частота дицентриков и колец у которых составила 0,02  0,01%
(просмотрено 48124 метафазы), частота транслокаций – 0,15  0,03% (просмотрено 21953
метафазы).
Таблица 2. Значимость отличия P (согласно точному критерию Фишера) частоты
дицентриков от контрольного уровня (0,02  0,01% для жителей Московского региона)
Количество
выявленных
дицентриков
1
Посчитано клеток
200
300
500
1000
1500
0,045
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,002
0,007
0,024
0,049
<<0,001
<<0,001
0,002
0,006
-4
6*10-4
-3
2
1*10
3
<<0,001
4
<<0,001
<<0,001
<<0,001
1*10
5
<<0,001
<<0,001
<<0,001
<<0,001
<<0,001
н.д. – значение Р больше 0,05, т.е. различия с контролем не достоверны
<<0,001 – значение Р как минимум на порядок меньше 0,001
Для корректных заключений о наличии в анамнезе факта радиационного
воздействия и о дозовой нагрузке необходимо, прежде всего, проанализировать
достаточное количество метафаз. Для детекции облучения по частоте дицентриков и
колец, то есть для обнаружения статистически значимых различий с контролем,
17
необходимо выявить не менее, чем 2 нестабильных маркера радиационного воздействия
(см. таблицу 2). Единичные наблюдения дицентриков и колец или транслокаций в сколь
угодно малых количествах просмотренных клеток не могут служить основой ни для
каких-либо заключений о наличии - отсутствии облучения, ни, тем более, для оценок доз.
Таблица 3. Значимость отличия P (согласно точному критерию Фишера) частоты
транслокаций, выявленных при помощи ДНК-зондов к 1, 4 и 12 хромосомам, от
контрольного уровня (0,15  0,03% для жителей Московского региона)
Количество
выявленных
транслокаций
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Посчитано клеток
100
250
500
1000
1500
2000
н.д.
0,01
6*10-4
<<0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
н.д.
н.д.
8*10-3
8*10-4
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
н.д.
н.д.
0,045
0,009
0,001
2*10-4
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
<< 0,001
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,024
0,006
0,002
3*10-4
<< 0,001
<< 0,001
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,036
0,013
0,004
0,001
3*10-4
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,046
0,019
0,007
0,002
н.д. – значение Р больше 0,05, т.е. различия с контролем не достоверны
<<0,001 – значение Р как минимум на порядок меньше 0,001
Оценка дозовых нагрузок по частоте хромосомных аберраций в
лимфоцитах периферической крови
Оценка доз облучения по частоте хромосомных аберраций проводится с помощью
калибровочных кривых «доза-эффект», которые можно получить в лабораторных
условиях при облучении цельной крови in vitro. Необходимо использовать калибровочные
кривые, полученные в той же лаборатории, где проводится анализ цитогенетических
препаратов. Это обусловлено тем, что на количественную оценку частоты хромосомных
нарушений могут оказывать влияние некоторые факторы: условия облучения крови,
особенности
приготовления
препаратов
метафазных
хромосом,
особенности
интерпретации цитогенетических данных, выбор определенной комбинации ДНК-проб
для FISH метода.
В настоящей работе представлены калибровочные кривые дозовой зависимости для
частоты дицентриков и транслокаций, полученные авторами.
Для построения калибровочной кривой «доза-эффект» кровь от 5 здоровых
доноров облучали (-излучение
60
Co с мощностью дозы 0,1 Гр/мин) в диапазоне доз от 0
до 4 Гр. Дозиметрический контроль режима облучения осуществляли с помощью
18
термолюминесцентных дозиметров. В процессе проведения эксперимента строго
о
соблюдали температурный режим (облучение проб крови проводили при t= 30  5 С).

Оценка уровня облучения пациентов по частоте дицентриков в лимфоцитах
периферической крови
В таблице 4 представлены данные по частоте дицентриков, полученные при разных
дозах облучения крови in vitro.
Таблица 4. Частота дицентриков после -облучения цельной крови in vitro
Количество дицентриков
Количество посчитанных
клеток
5020
4738
4280
3970
4414
3779
4500
4250
2838
2310
3422
1500
1877
1517
1500
250
Доза. Гр
0
0,05
0,07
0,10
0,15
0,25
0,30
0,50
0,75
0,85
1,00
1,35
1,50
2,00
3,00
4,00
4
9
13
10
21
44
50
98
141
145
242
231
281
442
941
135
Частота дицентриков
на 100 клеток (М  m)
0,08  0,04
0,19  0,06
0,30  0,08
0,25  0,08
0,48  0,10
1,16  0,18
1,11  0,16
2,31  0,23
4,97  0,42
6,28  0,52
7,07  0,45
15,40  1,01
14,97  0,89
29,14  1,39
62,73  2,04
54,00  4,65
60,00
Частота dic, %
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
Доза, Гр
Рисунок 1. Калибровочная кривая для частоты дицентриков
Пунктирными линиями указан 95% доверительный интервал для линии регрессии. Для
каждой дозовой точки приведено наблюдаемое значение частоты с 95%
доверительным интервалом.
19
Соответствующая регрессионная зависимость имеет вид:
y  0.001  0.015 x  0.063x 2 ,
где y - частота аберраций на одну клетку,
x - доза облучения (Гр). Это уравнение
получено методом наименьших квадратов с использованием в качестве весов величин N/y
, где N - число метафаз, просмотренных при данной дозе. Значимость модели высокая: Р =
6*10-14. График этой зависимости приведен на рисунке 1. При реконструкции дозы по
частоте аберраций необходимо произвести обратную операцию согласно уравнению:
x  3.97( y  7 10 5  0.03)
Ошибка прогноза дозы складывается из ошибки регрессионной кривой и ошибки
определения частоты аберраций у пациента:
s дозы 
2
s 2регрессия  s пациент
Дисперсия оценки частоты аберраций у пациента зависит от числа просмотренных
метафаз (N):
2
s пациент

1
y (1  y )
4

0.253( y  0.00007)
N
N
Дисперсия, связанная с регрессией зависит только от частоты аберраций у пациента (y)
имеет вид:
s 2регрессия 
0.002( y  0.0016)( y  0.1626)  0.0024( y  0.0174) 0.2533 y  2 10 5
0.2533 y  2 10 5
В диапазоне доз 0,1 – 1,4 Гр величина s регрессия слабо зависит от прогнозируемой дозы и
равна примерно 0,014 Гр, что соответствует дисперсии 0,0002 Гр2. Таким образом,
суммарная ошибка прогноза определяется в основном дисперсией частоты дицентриков у
2
пациента s пациент
, которая как минимум на порядок больше, чем s 2регрессия .
В реальной ситуации для оценки дозы по частоте дицентриков вполне достаточно
приближения
D  (4 y  0.12) 
4
 0.0002
N
,
где y – частота аберраций у пациента при анализе N клеток, D - доза в Гр.
Для практических нужд можно использовать таблицу 5, в которой приведены
оценки доз облучения с 95% доверительным интервалом, соответствующие различным
количествам дицентриков и числу просмотренных клеток.
Таблица 5. Оценка дозы с 95% доверительным интервалом (Гр), определенная по частоте
дицентриков при различных количествах посчитанных клеток
Количество
выявленных
дицентриков
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Посчитано клеток
100
200
300
500
1000
0,44 (0,06 – 0,83)
0,57 (0,18 – 0,95)
0,68 (0,29 – 1,06)
0,77 (0,39 – 1,15)
0,85 (0,48 – 1,23)
0,93 (0,56 – 1,31)
1,01 (0,63 – 1,38)
1,07 (0,70 – 1,45)
1,14 (0,77 – 1,51)
0,28 (0 – 0,55)
0,37 (0,09 – 0,64)
0,44 (0,17 – 0,72)
0,51 (0,24 – 0,78)
0,57 (0,30 – 0,84)
0,62 (0,35 – 0,90)
0,68 (0,40 – 0,95)
0,72 (0,45 – 1,00)
0,77 (0,50 – 1,02)
0,20 (0 – 0,43)
0,28 (0,05 – 0,50)
0,34 (0,11 – 0,57)
0,39 (0,17 – 0,62)
0,44 (0,22 – 0,67)
0,49 (0,26 – 0,71)
0,53 (0,31 – 0,75)
0,57 (0,35 – 0,79)
0,61 (0,38 – 0,83)
0,13 (0 – 0,31)
0,19 (0,01 – 0,36)
0,24 (0,06 – 0,41)
0,28 (0,10 – 0,45)
0,32 (0,14 – 0,49)
0,35 (0,18 – 0,53)
0,38 (0,21 – 0,56)
0,41 (0,24 – 0,59)
0,44 (0,27 – 0,62)
0,06 (0 – 0,18)
0,10 (0 – 0,22)
0,13 (0 – 0,26)
0,16 (0,03 – 0,29)
0,19 (0,06 – 0,31)
0,21 (0,09 – 0,34)
0,24 (0,11 – 0,36)
0,26 (0,13 – 0,38)
0,28 (0,15 - 0,40)
Оценка уровня облучения пациентов по частоте транслокаций в лимфоцитах
периферической крови
При построении калибровочной кривой учитывали как «полные», так и
«неполные» транслокации. В таблице 6 представлены данные по частоте транслокаций с
участием хромосом 1, 4 и 12, полученные при разных дозах облучения крови in vitro. На
основании этих данных было получено уравнение регрессии, которое имеет следующий
вид:
y = 0,00236 + 0,00698 x +0,00144 x2,
где y - частота транслокаций с участием хромосом 1, 4 и 12 на одну клетку, x - доза
облучения (Гр). График этой зависимости представлен на рисунке 2. При реконструкции
дозы по частоте аберраций необходимо произвести обратную операцию согласно
уравнению (вычисление x по y):
D  8.34( y  0.0015  0.029)
Ошибка прогноза дозы будет складываться из ошибки регрессионной кривой и ошибки
определения частоты транслокаций у пациента:
2
2
sдозы  s регресси
 sпац
я
иент
Дисперсия оценки частоты аберраций у пациента зависит от числа просмотренных
метафаз (N):
2
 пациент

1
y (1  y )
0.0575( y  0.0015) N
21
Как
и
в
случае
дицентриков,
ошибка,
определяемая
вариабельностью
2
калибровочной регрессии ( s регрессия ) в диапазоне прогнозируемых доз 0.11.8 Гр, слабо
зависит от величины дозы. По нашим вычислениям s регрессия  0.01 Гр2.
2
Для оценки дозы облучения по частоте транслокаций можно использовать таблицу
7 и 8. Таблицу 7 можно применять в случае использования ДНК проб для хромосом 1, 4 и
12. При использовании другого набора ДНК-проб следует применять таблицу 8, для этого
необходимо вычислить количество посчитанных клеток-эквивалентов Neq согласно
формуле, приведенной выше.
Таблица 6.Частота транслокаций после -облучения 60Со цельной крови in vitro
Доза, Гр
0
0,30
0,50
0,75
1,00
2,00
3,00
4,00
Количество посчитанных
клеток
7090
6147
5221
1378
1333
2309
1145
776
Количество
транслокаций
16
45
40
20
37
203
131
241
Частота транслокаций
на 100 клеток (М  m)
0,230,06
0,730,11
0,770,12
1,450,32
2,780,45
8,790,59
11,440,94
31,061,66
Таблица 7. Оценка дозы с 95% доверительным интервалом (Гр), определенная по частоте
транслокаций, выявленных при использовании ДНК-проб для 1, 4 и 12 хромосом, при
различных количествах посчитанных клеток
Количество
транслокаций
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
250
0,43 (0 – 1,03)
0,61 (0,03 – 1,20)
0,76 (0,19 – 1,33)
0,89 (0,32 – 1,46)
1,01 (0,44 – 1,57)
1,11 (0,55 – 1,68)
1,21 (0,66 – 1,77)
1,31 (0,75 – 1,86)
1,39 (0,84 – 1,95)
1,48 (0,92 – 2,03)
1,56 (1,00 – 2,11)
1,63 (1,08 – 2,18)
1,70 (1,11 –2,25)
1,74 (1,23 – 2,32)
500
н.д.
0,32 (0 – 0,78)
0,43 (0 – 0,87)
0,53 (0,09 – 0,97)
0,61 (0,18 – 1,05)
0,69 (0,26 – 1,12)
0,82 (0,40 – 1,26)
0,78 (0,43 – 1,12)
0,89 (0,46 – 1,32)
0,95 (0,53 – 1,38)
1,01 (0,59 – 1,43)
1,06(0,64 – 1,48)
1,11 (0,69 – 1,53)
1,16 (0,75 – 1,58)
Посчитано клеток
1000
н.д.
н.д.
н.д.
0,25 (0 – 0,61)
0,32 (0– 0,67)
0,37 (0,03 – 0,72)
0,43 (0,09 – 0,77)
0,48 (0,14 – 0,82)
0,53 (0,18 – 0,86)
0,57 (0,23 – 0,91)
0,61 (0,27 – 0,95)
0,65 (0,31 – 0,99)
0,69 (0,35 – 1,02)
0,72 (0,39 – 1,06)
1500
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,17 (0 – 0,50
0,23( 0 – 0,54)
0,27 (0– 0,58)
0,32 (0,01 – 0,62)
0,36 (0,05 – 0,66)
0,39 (0,09 – 0,69)
0,43 (0,13 – 0,73)
0,46 (0,16 – 0,76)
0,49 (0,19 – 0,79)
0,52 (0,23 – 0,82)
2000
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,13 (0 – 0,45)
0,17 (0 – 0,47)
0,21 (0 – 0,42)
0,25 (0 – 0,53)
0,28 (0– 0,56)
0,31 (0,04 – 0,59)
0,35 (0,07 – 0,62)
0,37 (0,10 – 0,65)
0,40 (0,13 – 0,68)
н.д. – выявленная частота транслокаций не отличается достоверно от контрольного значения, p<0.05
(точный критерий Фишера)
22
20,00
18,00
Частота транслокаций на 100 клеток
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
Доза, Гр
Рисунок 2. Калибровочная кривая для частоты транслокаций с 95%
доверительным интервалом
Таблица 8. Оценка дозы с 95% доверительным интервалом (Гр), определенная по частоте
транслокаций, при различных количествах посчитанных клеток-эквивалентов Neq
Кол-во
транслокаций
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
100
н.д.
0,51 (0 – 1,04)
0,64 (0,12 – 1,17)
0,76 (0,24 – 1,28)
0,87 (0,35 – 1,38)
0,96 (0,45 – 1,48)
1,05 (0,54 – 1,56)
1,13 (0,63 – 1,64)
1,21 (0,71 – 1,72)
1,28 (0,78 - 1,79)
1,36 (0,86 – 1,86)
1,42 (0,92 – 1,93)
1,49 (0,99 – 1,99)
1,55 (1,05 – 2,05)
Посчитано клеток-эквивалентов Neq
200
300
400
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,34 (0 – 0,76)
н.д.
0,43 (0,02 – 0,84)
0,27 (0 – 0,63)
0,51 (0,10 – 0,91)
0,34 (0 – 0,70)
0,24 (0 – 0,57)
0,58 (0,18 – 0,98) 0,40 (0,05 – 0,75)
0,29 (0 – 0,62)
0,64 (0,24 – 1,04) 0,46 (0,11 – 0,81) 0,34 (0,02 – 0,66)
0,70 (0,31 – 1,11) 0,51 (0,16 – 0,86) 0,39 (0,07 – 0,71)
0,76 (0,37 – 1,16) 0,55 (0,21 – 0,90) 0,43 (0,11 – 0,75)
0,82 (0,42 – 1,21) 0,60 (0,25 – 0,95) 0,47 (0,15 – 0,79)
0,87 (0,47 – 1,26) 0,64 (0,30 – 0,99) 0,51 (0,19 – 0,82)
0,92 (0,53 – 1,31) 0,68 (0,34 – 1,02) 0,54 (0,23 – 0,86)
0,96 (0,57 – 1,35) 0,72 (0,38 – 1,07) 0,58 (0,26 – 0,89)
1,01 (0,62 – 1,40) 0,76 (0,42 – 1,10) 0,61 (0,30 – 0,93)
500
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
0,16 (0 – 0,49)
0,21 (0 – 0,52)
0,26 (0,02 – 0,56)
0,30 (0 – 0,60)
0,34 (0,04 – 0,64)
0,38 (0,08 – 0,68)
0,41 (0,11 – 0,71)
0,45 (0,15 – 0,74)
0,48 (0,18 – 0,77)
0,51 (0,21 – 0,80)
н.д. – выявленная частота транслокаций не отличается достоверно от контрольного значения, p<0.05
(точный критерий Фишера)
В заключение необходимо подчеркнуть, что метод биодозиметрии, основанный на
анализе частоты хромосомных аберраций, позволяет оценить поглощенную дозу,
величина которой эквивалентна дозе однократного острого облучения (т.е. для тех
условий облучения, при которых получена калибровочная кривая). Иными словами,
можно
оценить
реакцию
организма
(уровень
хромосомных
нарушений)
после
радиационного воздействия в единицах дозы однократного облучения. Учитывая, что
чаще всего приходится сталкиваться с ситуациями, когда имеет место хроническое или
пролонгированное облучение, необходима корректировка полученных значений доз
облучения. Так, например, для ориентировочного пересчета дозы при хроническом
радиационном воздействии следует применять коэффициент 2-3 по отношению к острому
облучению в той же дозе, независимо от длительности воздействия ионизирующего
излучения (United Nations, 1988).
Эффективность использования методов цитогенетического анализа.
Коллектив авторов, участвовавших в разработке медицинской технологии, имеет
большой опыт использования цитогенетических методов для оценки уровня облучения
людей, пострадавших в результате различных радиационных аварий. Проведено
обследование более 4000 участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС и
жителей, проживающих на загрязненных в результате этой аварии территориях.
Проведено обследование населения, проживающего в районе р. Теча (Челябинская обл.) и
в районах, прилегающих к Семипалатинскому полигону (более 500 человек). В результате
выявлены повышенные в несколько раз уровни нестабильных и стабильных аберраций
хромосом по сравнению с контролем. Показано, что уровень клеток с дицентриками
снижается
во
времени.
При
обследовании
участников
ликвидации
аварии
на
Чернобыльской АЭС отмечено, что в течение всего периода после радиационного
воздействия (20 лет ), частота клеток с дицентриками превышает контрольный уровень.
Выявлены (спустя 20-45 лет после радиационного воздействия) высокие уровни клеток с
дицентриками и при обследовании населения, проживающего в Брянской области, в
районе р. Теча, а также в Алтайском крае, что свидетельствует о длительном сохранении
определенной доли клеток с нестабильными хромосомными аберрациями у людей,
получивших достаточно высокие дозы облучения.
С помощью FISH метода оценены поглощенные дозы у участников ликвидации
аварии на ЧАЭС. Диапазон полученных доз среди обследованных людей составил от
24
фонового до 1 Гр. По частоте стабильных хромосомных аберраций оценены величины доз
для жителей Алтайского края.
При обследовании группы профессионалов-атомщиков РФЯЦ-ВНИИЭФ (110
человек) был выявлен высокий уровень клеток с дицентриками, который достоверно
отличается от аналогичного показателя для контрольной группы (жители г.Сарова). По
частоте транслокаций с помощью калибровочной кривой «доза-эффект»,
для группы
профессионалов-атомщиков были рассчитаны индивидуальные дозы облучения.
Список цитированной литературы
1. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека
(атлас). Издательство «Медицина», Москва. 1982. 264 стр.
2. Bauchinger M. Cytogenetic researches after accidental radiation exposure. // Stem Cells.
– 1995. – V. 13, Suppl. 1. – P. 182 – 190.
3. IAEA, Vienna, 1986, Technical Report Series N0 260, Biological dosimetry:
Chromosomal aberration analysis for dose assessment. 68 p.
4. .Lucas J.N., Awa A., Straume T., Poggensee M., Kodama Y., Nakano M., Ohtaki K.,
Weier H.U., Pinkel D., Gray J., et al Rapid translocation frequency analysis in humans
decades after exposure to ionising radiation. // Int. J. Radiat. Biol. – 1992. – V. 62, N. 1.
P. 53 – 63.
5. Mendelsohn M.L., Mayall B.H., Bogart E., et al. DNA content and DNA-based
centromeric index of 24 human chromosomes. // Science. - 1973 – V. 179, N. 78. – P.
1126-1129.
6. Method of human chromosome aberration analysis. Edit by K.Backton., H.Evans. WHO,
Geneva, 1976, 64 p.
7. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, highsensitivity, fluorescence hybridisation. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 1986. –V. 83, N.
9. – P. 2934 – 2938.
8. United Nations. Ionizing radiation. Sources and biological effects. UNSCER 1982, report
to the General Assembly with annexes. United nations sales publication. E.82. 1982,
United Nations, New York, 1982.
9. United Nations. Sources, Effects and Risk of Ionizing Radiation. UN Scientific
Committee on the Effects of Atomic Radiation (N.Y. United Nations, 1988).
25
Приложение
Приготовление необходимых реактивов
Фосфатный буфер (рН 6.8):
KH2PO4
2,45 г
Na2HPO4
5,70 г
H2O
5л
Хранить при комнатной температуре.
10  PBS:
Приготовить раствор А:
NaCl
73.84 г
Na2HPO4 * 2H2O
16.02 г
H2O бидистилл.
900 мл
Приготовить раствор В:
NaCl
16.56 г
NaH2PO4
2.76 г
H2O бидистилл.
100 мл
Довести при помощи раствора В рН раствора А до 7.0.
PBS:
Развести 10PBS бидистиллированной водой в 10 раз (10 мл 10PBS + 90 мл бидистиллированной воды).
Хранить при комнатной температуре.
Краситель Hoechst 33258 (основной раствор)
Hoechst 33258 - 5 мг
H2 О бидистилл. – до 100 мл
Хранить при t +40С в темноте.
Краситель Hoechst 33258 (рабочий раствор)
Готовится ex temporo
Hoechst 33258 (основной раствор) - 2 мл
PBS
- 98 мл
Краситель Гимза (5% раствор)
Готовится ex temporo
Краситель Гимза (основной раствор)
Фосфатный буфер, pH 6.8
- 5 мл
- 95 мл
20*SSC:
3.0 M NaCl, 0.3 M Na цитрат.
NaCl
175.32 г
Na цитрат (C6H5Na3O7*2H2O)
88.23 г
H2O бидистилл.
800 мл
Довести рН до 7.0. Затем бидистиллированной водой довести объем раствора до 1 литра.
2*SSC:
Развести 20*SSC бидистиллированной водой в 10 раз (10 мл 20*SSC + 90 мл H 2O
7.0, профильтровать.
2  PBS:
Развести 10PBS бидистиллированной водой в 5 раз (20 мл 10PBS + 80 мл H2O
Раствор 1 М MgCl2:
MgCl2 * 6H2O
H2O бидистилл
бидистилл.),
довести рН до
бидистилл.).
50.83 г
250 мл
Раствор 10% пепсина:
100 мг пепсина растворить в 1 мл 0.01 N HCL.
Готовый раствор хранить при t = -20oC.
26
70% раствор формамида:
Формамид
70 мл
20*SSC
10 мл
H2O бидистилл.
20 мл
100 мл

Хранить в холодильнике при t = 4oC,
использовать в течение 1 – 2 недель.
Раствор PBS/ MgCl2:
1 М MgCl2
10*PBS
H2O бидистилл.

Готовится ex temporo.
5 мл
10 мл
85 мл
100 мл
Раствор параформальдегида (0.25% PFA):
0.250 г параформальдегида (PFA) растворить в 50 мл 100 мM MgCl 2 , добавить 1 каплю 1 N NaOH, для
лучшего растворения подогреть смесь на водяной бане до 70 оС, после полного растворения
параформальдегида добавить 50 мл 2*PBS. Раствор годен в течение недели, хранить при комнатной
температуре.
Master Mix 1.0:
К 5 мл формамида добавить 1 г сульфата декстрана и 1 мл 20*SSC. Довести рН до 7.0 при помощи 1 N HCl.
Бидистиллированной водой довести объем смеси до 7.0 мл. Для растворения сульфата декстрана смесь
прогревать в течение нескольких часов при 700 С. Готовую смесь разлить по микропробиркам, хранить при 20 С. ММ1.0 может храниться нескольких месяцев.
50% раствор формамида:
Формамид
200 мл
20*SSC
40 мл
H2O бидистилл.
160 мл
400 мл

Разлить по 4 сосудам Коплина. Сосуды Коплина пронумеровать, растворы использовать согласно
порядковым номерам. Использовать в течение месяца. Хранить в холодильнике при t = 4oC.
0.1*SSC:
Готовить ex temporo
20*SSC
1.5 мл
H2O бидистилл.
до 300 мл
Разлить по трем сосудам Коплина.
PN-буфер:
К 1 литру 0.1 M Na2HPO4 добавлять 0.1 M Na2HPO4 до тех пор, пока рН раствора не достигнет 8.0. Затем
добавить Nonidet P-40 до конечной концентрации 0.1%. Хранить при комнатной температуре.
PNM-буфер:
Обезжиренное сухое молоко
1% раствор азида натрия
PN-буфер
5г
10 мл
90 мл
К PN-буферу добавляют обезжиренное сухое молоко, азид натрия, перемешивают и оставляют в термостате
при t = 37оС на ночь. Раствор центрифугируют, отбирают супернатант. PNM-буфер разливают по аликвотам
в микропробирки и замораживают при t = -20оС.
Разведение стрептавидина и антистрептавидина:
Маточный раствор биотинилированного антистрептавидина и стрептавидина, конъюгированного с FITC 1
получают разведением согласно инструкции производителя. После разведения маточный раствор разливают
по аликвотам в микропробирки и замораживают при t = -20оС.
Рабочая концентрация этих антител – 5мкг/мл в PNM-буфере.
1
FITC – изотиоцианат флуоресцеина
27
Разведение антидигоксигенина и AMCA2 конъюгированных антител IgG Rat-anti-Mouse и IgG Mouseanti-Rat:
Маточные растворы получают разведением согласно инструкции производителя. После разведения
маточные растворы разливают по аликвотам в микропробирки и замораживают при t = -20оС.
Рабочий раствор антидигоксигенина получают разведением 1 : 250 в PNM-буфере.
Рабочий раствор AMCA конъюгированных антител IgG Rat-anti-Mouse и IgG Mouse-anti-Rat получают
разведением 1 : 50 в PNM-буфере.
0.5 М карбонат-бикарбонатный буфер:
0.42 г NaHCO3 растворить в 10 мл H2O бидистилл. Довести рН до 9.0 при помощи 50% NaOH.
Раствор Antifade3:
100 мг п-фенилендиамин дигидрохлорида растворить в 10 мл PBS. Довести рН до 8.0 при помощи 0.5 М
карбонат-бикарбонатного буфера. Полученный раствор добавить к 90 мл глицерина. Хранить разлитыми по
порциям по 1 мл в темноте при -20 С. Этот раствор темнеет со временем, но остается эффективным. Может
храниться и использоваться более 6 месяцев.
Разведение основного раствора пропидий иодида:
Сухой пропидий иодид развести бидистиллированной водой до концентрации 1 мг/мл. Хранить в темноте
при t = -20оС.
Рабочий раствор пропидий иодида в Antifade:
1 мкл пропидий иодида растворить в 1 мл раствора Antifade. Хранить в темноте при -20оС.
2
3
- AMCA – 7-амино-4-метилкумарин-3-уксусная кислота
- Можно использовать готовый коммерческий реактив VECTASHIELD (Vector Laboratories, Inc)
28
Метафазные пластинки в культуре лимфоцитов крови
FPG метод
Дицентрическая хромосома и парный фрагмент (указаны стрелками)
FISH метод
Реципрокные транслокации с участием 1 и 12 хромосом (указаны стрелками)
29