35 Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé

Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
9. Feron F., Perry C., McGrath J.J., Mackay-Sim A. New techniques for biopsy
and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch. Otolaryngol. Head. Neck.
Surg. 1998; 124: 861–6.
10. Bianco J.I., Perry C., Harkin D.G. et al. Neurotrophin-3 promotes
purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia
2004; 45: 111–23.
11. Steeves J., Fawcett J., Tuszynski M. Report of international clinical trials
workshop on spinal cord injury February 20–21, 2004, Vancouver, Canada. Spinal
Cord 2004; 42: 591–7.
35
12. Takami T., Oudega M., Bates M.L. et al. Schwann cell but not olfactory
ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the
moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J. Neurosci. 2002; 22:
6670–81.
13. Collazos-Castro J.E., Muneton-Gomez V.C., Nieto-Sampedro M. Olfactory
glia transplantation into cervical spinal cord contusion injuries. J. Neurosurg. Spine
2005; 3(4): 308-17.
14. Murrell W., Feron F., Wetzig A. et al. Multipotent stem cells from adult
olfactory mucosa. Dev. Dyn. 2005; 233(2): 496-515.
Ïîäãîòîâèë À.Â. Áåðñåíåâ
Ïî ìàòåðèàëàì Brain 2005; 128(Pt 12): 2951-60
ÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ
Ñðàâíèòåëüíîå ãåíîìíîå èññëåäîâàíèå êëîíèðîâàííûõ
è íîðìàëüíûõ ýìáðèîíîâ
Òåõíîëîãèÿ ïåðåíîñà ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ýíóêëåèðîâàííûé îâîöèò èìååò áîëüøîå çíà÷åíèå äëÿ áèîìåäèöèíû
è ñåëüñêîãî õîçÿéñòâà, òàê êàê ýòî óíèêàëüíûé ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ãåíåòè÷åñêè èäåíòè÷íûõ ðîäèòåëüñêèì êëåòîê èëè
æèâîòíîå-êëîí. Îäíàêî, âñå èñcëåäîâàòåëüñêèå ãðóïïû îòìå÷àþò êðàéíå íèçêóþ ÷àñòîòó ðîæäåíèÿ æèçíåñïîñîáíîãî
æèâîòíîãî èç òàêîãî ýìáðèîíà (nuclear transfer, NT-ýìáðèîí). Êàê ïðàâèëî, åùå ïðè ðàííåì ýìáðèîíàëüíîì ðàçâèòèè
íàáëþäàþòñÿ çíà÷èòåëüíûå íàðóøåíèÿ â òêàíå- è îðãàíîãåíåçå, íåñîâìåñòèìûå ñ æèçíüþ. È õîòÿ óæå ïîëó÷åíî íåìàëî êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ ðàçëè÷íûõ âèäîâ, ïîëíîñòüþ
êîíòðîëèðîâàòü ïðîöåññ è íàïðàâëåííî óâåëè÷èâàòü åãî
ýôôåêòèâíîñòü ïîêà íå óäàåòñÿ. Îäíîé èç îñíîâíûõ ïðè÷èí
íèçêîé ýôôåêòèâíîñòè òåõíîëîãèè ñ÷èòàåòñÿ íàðóøåíèå
ýïèãåíåòè÷åñêîãî êîíòðîëÿ ðàáîòû ãåíîâ, âñëåäñòâèå ýòîãî - íåïðàâèëüíîå ðàçâèòèå ýìáðèîíà. Òåì íå ìåíåå, ðåïðîãðàììèðîâàíèå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà ïðè åãî ïåðåíîñå äîñòîâåðíî ïîêàçàíî, è óäà÷íûå ñëó÷àè êëîíèðîâàíèÿ
äîêàçûâàþò èçìåíåíèÿ â ãåííîé àêòèâíîñòè è «ñíÿòèå»
ýïèãåíîìíîé èíôîðìàöèè.
Íåäàâíî áûëà ïðîâåäåíà ðàáîòà ïî ñðàâíåíèþ ýêñïðåññèè ãåíîâ â íåñêîëüêèõ NT-ýìáðèîíàõ êîðîâ íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû, ñ ñîìàòè÷åñêèìè êëåòêàìè - äîíîðàìè ÿäåð è ñ
íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûìè áëàñòîöèñòàìè. Àíàëèç áîëåå
5000 òûñÿ÷ ãåíîâ, ïðîâåäåííûé ïðè ïîìîùè ìèêðî÷èïîâ,
ïîêàçàë, ÷òî ýêñïðåññèÿ ãåíîâ â NT-ýìáðèîíàõ ñèëüíî îòëè÷àåòñÿ îò ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê-äîíîðîâ è ìèíèìàëüíî
îòëè÷àåòñÿ îò íîðìàëüíûõ áëàñòîöèñò. Ýòî äîêàçûâàåò, ÷òî
ïåðåíåñåííûå â îîöèòû ÿäðà ïðåòåðïåâàþò çíà÷èòåëüíîå
ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû, è ïðîáëåìû, âîçíèêàþùèå ïðè ðàçâèòèè òêàíåé è îðãàíîâ èç
NT-ýìáðèîíîâ, âîçìîæíî, ñâÿçàíû ñ îøèáêàìè ýòîãî ôåíîìåíà, çíà÷åíèå êîòîðûõ óâåëè÷èâàåòñÿ â ïðîöåññå îðãàíîãåíåçà.
Ïðè ñðàâíåíèè êàðòèíû òðàíñêðèïöèè óäàëîñü âûÿâèòü 29
% ãåíîâ, ïî-ðàçíîìó ýêñïðåññèðóþùèõñÿ â NT-ýìáðèîíàõ è
ñîìàòè÷åñêèõ êëåòêàõ-äîíîðàõ ÿäåð. Ýòè ãåíû îòíîñÿòñÿ ê
ñëåäóþùèì ñèãíàëüíûì ïóòÿì: îêèñëèòåëüíîå ôîñôîðèëèðîâàíèå, êëåòî÷íûé öèêë, ñèíòåç ÀÒÔ, öèêë òðèêàðáîíîâûõ
êèñëîò, ìåòàáîëèçì ïóðèíîâ, ïèðóâàòà, ãëèêîëèç è ãëþêîíåîãåíåç, à òàêæå àïîïòîç. Èññëåäîâàòåëè ïðîàíàëèçèðîâàëè
â NT-ýìáðèîíàõ 94 ãåíà, êîòîðûå ýêñïðåññèðóþòñÿ â ýòèõ
êëåòêàõ íà âûñîêîì óðîâíå. Èç íèõ 23 ãåíà çíà÷èòåëüíî
ñèëüíåå ýêñïðåññèðîâàëèñü â èññëåäóåìûõ îáðàçöàõ, ïî
ñðàâíåíèþ ñ äîíîðíûìè ñîìàòè÷åñêèìè êëåòêàìè. Ñðåäè
íèõ - ðàíåå îïèñàííûå ODC1, PECAM1, CCNE1 - ãåíû,
ñïåöèôè÷íûå äëÿ ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê (ÝÑÊ).
Òàêèì îáðàçîì, ïðèíèìàÿ âî âíèìàíèå ðàçëè÷èÿ â óðîâíå
ýêñïðåññèè îïèñàííûõ ãåíîâ, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ÿäðî
ñîìàòè÷åñêîé êëåòêè ïðåòåðïåâàåò çíà÷èòåëüíîå ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå ïîñëå ïåðåíîñà â ÿéöåêëåòêó.
Ïðîôèëü ýêñïðåññèè ãåíîâ áûë ñðàâíåí ó NT-ýìáðèîíîâ è ýìáðèîíîâ, ïîëó÷åííûõ âñëåäñòâèå èñêóññòâåííîé
èíñåìèíàöèè (artificial insemination, AI-ýìáðèîíû) è èñêóññòâåííîãî îïëîäîòâîðåíèÿ (in vitro fertilization, IVF-ýìáðèîíû).
Îêàçàëîñü, ÷òî àêòèâíîñòü ãåíîâ â NT-ýìáðèîíàõ áîëåå ñõîæà ñ òàêîâîé â AI-ýìáðèîíàõ, òîãäà êàê ðàçëè÷èÿ ìåæäó NTè IVF-ýìáðèîíàìè áîëåå çíà÷èòåëüíûå. Èíòåðåñíî, ÷òî ïðè
ñðàâíåíèè èíäèâèäóàëüíûõ ýìáðèîíîâ âíóòðè ãðóïïû áîëåå
îäíîðîäíûìè ÿâëÿþòñÿ NT-ýìáðèîíû, à IVF-ýìáðèîíû –
íàèáîëåå ðàçíîðîäíûå. Ñõîæàÿ êàðòèíà ãåííîé ýêñïðåññèè
ó NT-ýìáðèîíîâ òàêæå ïîäòâåðæäàåò ìåõàíèçì ïåðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà. Ðàçëè÷èÿ ìåæäó IVF-ýìáðèîíàìè ìîãëè
âîçíèêíóòü âñëåäñòâèå êóëüòèâèðîâàíèÿ èëè ãåíåòè÷åñêèõ
ðàçëè÷èé ìàòåðåé-äîíîðîâ ÿéöåêëåòîê.
Íåñìîòðÿ íà ñõîæóþ ãåííóþ ýêñïðåññèþ ìåæäó NT- è
AI-ýìáðèîíàìè, 50 ãåíîâ (îêîëî 1 %) îòëè÷àþòñÿ ïî óðîâíþ òðàíñêðèïöèè. Ñðåäè íèõ 8 ýêñïðåññèðóþòñÿ òîëüêî â
NT-ýìáðèîíàõ, à 17 – òîëüêî â AI-ýìáðèîíàõ. Âîçìîæíî,
ýòè ãåíû ñâÿçàíû ñ ðàçëè÷èÿìè ðàçâèòèÿ in vitro è in vivo.
Äëÿ íåêîòîðûõ èç ýòèõ ãåíîâ îïèñàíû ôóíêöèè, íàïðèìåð,
TFAP2A íåîáõîäèì äëÿ ôîðìèðîâàíèÿ íåðâíîé òðóáêè è
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 1 (3), 2006
36
Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé
ðàçâèòèÿ ñåðäå÷íîé ìûøöû [1], à MEIS2 è DUSP6 íåîáõîäèìû äëÿ ðàçâèòèÿ êîíå÷íîñòåé [2, 3], (folate receptor 1) èãðàåò
ðîëü â òðàíñïîðòíîé ñèñòåìå ìåæäó ìàòåðèíñêèì è ýìáðèîíàëüíûì îðãàíèçìàìè [4]. Âñå ýòè ãåíû òðàíñêðèáèðóþòñÿ
íà íèçêîì óðîâíå â NT-ýìáðèîíàõ è, âîçìîæíî, ÿâëÿþòñÿ
ïðè÷èíîé íàðóøåíèé ðàçâèòèÿ êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ.
Ñ äðóãîé ñòîðîíû, ìíîæåñòâî àíîìàëèé ðàçâèòèÿ êëîíèðîâàííûõ æèâîòíûõ ìîãóò áûòü âûçâàíû íàðóøåíèÿìè èìïðèíòèíãà. Èññëåäîâàòåëè ïðîàíàëèçèðîâàëè ýêñïðåññèþ
21 ãåíà, èìïðèíòèðîâàííûõ ó ìûøè è ÷åëîâåêà. Ñðåäè ýòèõ
ãåíîâ 20 ýêñïðåññèðîâàëèñü îäèíàêîâî ó NT-, AI- è IVF-ýìáðèîíîâ. È òîëüêî îäèí ãåí – CD81 – àêòèâíûé â ïëàöåíòå
ìûøè, ïî-ðàçíîìó ýêñïðåññèðîâàëñÿ ó NT- è AI-ýìáðèîíîâ.
Âîçìîæíî, ýòî íàðóøåíèå ïîñëóæèëî ïðè÷èíîé äëÿ òàê íàçûâàåìîãî large offspring syndrome, ÷àñòî íàáëþäàåìîãî â ñëó÷àå NT. Íîðìàëüíàÿ ýêñïðåññèÿ äðóãèõ èìïðèíòèðîâàííûõ
ãåíîâ ïîäòâåðæäàåò òåîðèþ î ïåðåïðîãðàììèðîâàíèè ÿäðà.
Íàðóøåíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ, ñöåïëåííûõ ñ Õ-õðîìîñîìîé, íàáëþäàëîñü ó êëîíèðîâàííûõ óìåðøèõ æèâîòíûõ
è NT-ýìáðèîíîâ. Íî èç 123 èçâåñòíûõ ÷åëîâå÷åñêèõ ãåíîâ,
ñöåïëåííûõ ñ Õ-õðîìîñîìîé, ó÷åíûå íå íàøëè íè îäíîãî,
ýêñïðåññèðóþùåãîñÿ ïî-ðàçíîìó â AI- è NT-ýìáðèîíàõ.
Èññëåäîâàòåëè ïðåäïîëàãàþò, ÷òî êëþ÷åâîå ñîáûòèå â ðàííåì ðàçâèòèè – èíàêòèâàöèÿ Õ-õðîìîñîìû – âîçìîæíî, ó
êîðîâ ïðîèñõîäèò ïîçæå, ÷åì òå ñðîêè ðàçâèòèÿ, âî âðåìÿ
êîòîðûõ ïðîâîäèëè èññëåäîâàíèÿ.
Ïðè àíàëèçå ãåíîâ, ó÷àñòâóþùèõ â ðåãóëÿöèè ìåòèëèðîâàíèÿ è ìîäèôèêàöèè õðîìàòèíà, íå óäàëîñü âûÿâèòü ðàçíèöû â ýêñïðåññèè ãåíîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ íîðìàëüíûìè
ýìáðèîíàìè. Íà îñíîâàíèè ñâîèõ äàííûõ ó÷åíûå ñäåëàëè
âûâîä, ÷òî ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà,
ïåðåíåñåííîãî â öèòîïëàçìó ÿéöåêëåòêè, êàñàåòñÿ è ýïèãåíåòè÷åñêèõ èçìåíåíèé.
Èç 434 ãåíîâ, íåïîñðåäñòâåííî âîâëå÷åííûõ â ïðîöåññû ðàííåãî ðàçâèòèÿ, ó÷åíûì óäàëîñü âûÿâèòü ëèøü 5 äèôôåðåíöèàëüíî ýêñïðåññèðóþùèõñÿ ìåæäó NT- è AI-ýìáðèîíàìè, òîãäà êàê ó IVF-ýìáðèîíîâ òàêèõ ãåíîâ 14 ïî
ñðàâíåíèþ ñ NT, è 24 ïî ñðàâíåíèþ ñ AI-ýìáðèîíàìè. Ýòè
ðåçóëüòàòû ïîêàçûâàþò, êàêîå âëèÿíèå èìååò äëÿ ðàííåãî
ðàçâèòèÿ èñêóññòâåííîå îïëîäîòâîðåíèå. Òðè ãåíà áûëè àêòèâíû èñêëþ÷èòåëüíî ó AI-ýìáðèîíîâ (AKAP11, CCL2 è
PPAP26), âîçìîæíî, îíè îòâå÷àþò çà óñïåøíîå ðàçâèòèå
íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûõ ýìáðèîíîâ èëè àêòèâèðóþòñÿ
â îòâåò íà óñëîâèÿ ðàçâèòèÿ in vivo.
Ïîäâîäÿ èòîã ðàáîòû, ìîæíî ñêàçàòü, ÷òî ó÷åíûì óäàëîñü âûÿâèòü áîëåå 300 ãåíîâ, êîòîðûå íå ìåíÿþò ñâîåé
àêòèâíîñòè â òðåõ èññëåäîâàííûõ òèïàõ ýìáðèîíîâ, ÷òî ìîæåò ñâèäåòåëüñòâîâàòü îá èõ ïåðâîñòåïåííîé âàæíîñòè íà
ðàííèõ ýòàïàõ ðàçâèòèÿ. Êðîìå ýòîãî, äîñòîâåðíî áûëî
ïîêàçàíî, ÷òî õàðàêòåð ýêñïðåññèè ãåíîâ ïðè ïåðåíîñå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ÿéöåêëåòêó íà ðàííèõ ýòàïàõ áîëåå áëèçîê ê òàêîâîìó â íîðìàëüíî îïëîäîòâîðåííûõ ýìáðèîíàõ
(AI-ýìáðèîíû). Àíàëèç, ïðîâîäèìûé íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû
ïîêàçàë, ÷òî ñîìàòè÷åñêîå ÿäðî ïðåòåðïåâàåò ðåïðîãðàììèðîâàíèå, è ýêñïðåññèÿ ãåíîâ ìåíÿåòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ãåííîé àêòèâíîñòüþ ðàííåãî ýìáðèîíà.
Îñòà¸òñÿ íåÿñíûì, ïî÷åìó èñêóññòâåííîå îïëîäîòâîðåíèå, â êîòîðîì ó÷àñòâóþò ÿäðà ïîëîâûõ êëåòîê, íà ðàííèõ
ýòàïàõ ñèëüíåå îòëè÷àåòñÿ îò íîðìàëüíîãî îïëîäîòâîðåíèÿ, ÷åì êëîíèðîâàíèå. Âîçìîæíàÿ ïðè÷èíà - èñïîëüçîâàíèå íåçðåëûõ îîöèòîâ è èõ äëèòåëüíîå êóëüòèâèðîâàíèå.
Íåîáõîäèìû äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ íà áîëåå ïîçäíèõ
ñðîêàõ ðàçâèòèÿ. Ïî ðåçóëüòàòàì ðàáîòû ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïåðåíîñ ÿäðà äàåò áîëüøå øàíñîâ äëÿ ðàçâèòèÿ
ýìáðèîíà, îäíàêî òàêîå ïîëîæåíèå íå ñîâñåì îáîñíîâàííî, òàê êàê èçâåñòíû ìíîãèå ôóíêöèè ñïåðìàòîçîèäà â îïëîäîòâîðåíèè ïîìèìî ïåðåäà÷è ãåíåòè÷åñêîãî íàáîðà.
Êðîìå àêòèâàöèè îîöèòà, ñïåðìàòîçîèäû òàêæå âíîñÿò
ñâîþ ÐÍÊ, íåîáõîäèìóþ äëÿ ðàííåãî êîíòðîëÿ ðàáîòû ãåíîâ
[5, 6], èõ õðîìàòèí èìååò ñïåöèôè÷åñêóþ êàðòèíó ìåòèëèðîâàíèÿ, êîòîðóþ íå ìîæåò âîññîçäàòü îâîöèò. Òàêèì îáðàçîì, íåëüçÿ ïðåäïîëàãàòü ëó÷øåå ðàçâèòèå ýìáðèîíà ïðè
ïåðåíîñå ñîìàòè÷åñêîãî ÿäðà â ÿéöåêëåòêó, ÷åì ïðè èñêóññòâåííîì îïëîäîòâîðåíèè. Îäíàêî, ìîæíî óòâåðæäàòü, ÷òî
îîïëàçìà îêàçûâàåò îãðîìíîå âëèÿíèå íà õðîìàòèí è ðàáîòó ãåíîâ, ïåðåñòðàèâàÿ èõ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïîòðåáíîñòÿìè ðàííåãî ýìáðèîíàëüíîãî ðàçâèòèÿ. Ñ öåëüþ âûÿñíåíèÿ
ãåíåòè÷åñêèõ ðàçëè÷èé ìåæäó êëîíèðîâàííûìè è íîðìàëüíûìè ýìáðèîíàìè ìûøè íà ñòàäèè áëàñòîöèñòû áûëà ïðîâåäåíà àíàëîãè÷íàÿ ðàáîòà è â ëàáîðàòîðèè Rudolf Jaenisch
[7]. Ó÷åíûå ïîäòâåðäèëè, ÷òî ïî ãåííîé àêòèâíîñòè è ïî
ðàçâèòèþ íà ýòîé ñòàäèè ÝÑÊ ìûøè èç ýòèõ ýìáðèîíîâ
àáñîëþòíî èäåíòè÷íû è èìåþò îäèíàêîâûé ïîòåíöèàë äëÿ
èñïîëüçîâàíèÿ â òåðàïåâòè÷åñêèõ öåëåé [7].  òî æå âðåìÿ,
îãðàíè÷åííûå ñðîêè ðàçâèòèÿ, ïðè êîòîðûõ ïðîâîäèëèñü
èññëåäîâàíèÿ, íå äàþò ïðàâà óòâåðæäàòü, ÷òî ýòî ïåðåïðîãðàììèðîâàíèå äîñòàòî÷íî äëÿ äàëüíåéøåãî ðàçâèòèÿ
îðãàíèçìà.
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ:
1. Brewer S., Williams T. Loss of AP-2alpha impacts multiple aspects of
ventral body wall development and closure. Dev. Biol. 2004; 267(2): 399-417.
2. Kawakami Y., Rodriguez-Leon J., Koth C.M. et al. MKP3 mediates the
cellular response to FGF8 signalling in the vertebrate limb. Nat. Cell Biol. 2003;
5(6): 513-9.
3. Mercader N., Leonardo E., Azpiazu N. et al. Conserved regulation of proximodistal
limb axis development by Meis1/Hth. Nature 1999; 402(6760): 425-9.
4. Piedrahita J.A., Oetama B., Bennett G.D.et al. Mice lacking the folic acid-
binding protein Folbp1 are defective in early embryonic development. Nat. Genet.
1999; 23(2): 228-32.
5. Kramer J.A., Êrawetz S.A. RNA in spermatozoa: implications for the
alternative haploid genome. Mol. Hum. Reprod. 1997; 3(6): 473-8.
6. Miller D. Analysis and significance of messenger RNA in human ejaculated
spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 2000; 56(2 Suppl): 259-64.
7. Brambrink T., Hochedlinger K., Bell G., Jaenisch R. ES cells derived from
cloned and fertilized blastocysts are transcriptionally and functionally
indistinguishable. PNAS 2006; 103(4): 933-39.
Ïîäãîòîâèëà Ò. Â. Ëîïàòèíà
Ïî ìàòåðèàëàì Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102(49):17582
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 1 (3), 2006