/£
реклама
На правах рукописи ШПАКОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ /£ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СОПРЯЖЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ С G-БЕЛКАМИ В АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОИ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Марианна Николаевна Перцева Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Людмила Валентиновна Пучкова доктор биологических наук, профессор Зоя Иринарховна Крутецкая доктор биологических наук, профессор Евгений Викторович Розенгарт Ведущее учреждение Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва Защита состоится «27» марта 2007 г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН. Автореферат разослан «Jj» 0% 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.127 доктор биологических наук, профессор Д/>- £^-££-0- М.Н. Маслова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Регуляция большинства жизненно важных функций и процессов в организме позвоночных и беспозвоночных животных осуществляется с помощью гормонов и гормоноподобных веществ. Их действие реализуется через высоко специализированные гормональные сигнальные системы. Предметом нашего исследования была наиболее широко распространенная гормоночувствительная аденилатциклазная система (АЦС). Ее основными компонентами являются рецептор, расположенный в плазматической мембране и специфически опознающий гормональный сигнал, гетсротримерный G-белок стимулирующего (Gs-белок) или ингибирующего (Gjбелок) типа, который состоит из трех типов субъединиц - а, Р и у, и фермент аденилатциклаза (АЦ), генерирующий образование вторичного посредника цАМФ (Sunahara, Taussig, 2002). цАМФ активирует протеинкиназу А и через нее регулирует широкий спектр эффекторных систем клетки. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в изучении АЦС, молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов остаются до конца невыясненными. Недостаточно информации о молекулярных детерминантах в белках, компонентах АЦС, вовлеченных в процесс их функционального взаимодействия и являющихся ключевыми звеньями в сигнал передающей цепи. Много вопросов остается и в отношении регуляции АЦС гормонами, которые действуют через рецепторы, не относящиеся к серпантинному типу. По-прежнему мало изученными остаются АЦС беспозвоночных животных, в первую очередь одноклеточных эукариот. Понимание того, каким образом функционирует АЦС, является одним из магистральных направлений в современной биохимии и молекулярной эндокринологии, поскольку через эту систему регуляторное влияние на клетку оказывают более сотни различных по химической природе гормонов, а сама АЦС играет ключевую, координирующую роль в регуляции практически всех жизненно важных клеточных процессов - роста, метаболизма, аноптоза, дифференцирования. Решению актуальной проблемы функционирования АЦС и посвящено настоящее исследование, в котором изучены молекулярные механизмы функционального сопряжения компонентов АЦС и, в первую очередь, взаимодействие между активированным рецептором и G-белком, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала через эту систему. В работе применен эволюционный подход, который заключался в сравнительном исследовании функциональных блоков АЦС у животных различного филогенетического уровня высших позвоночных (крысы), многоклеточных беспозвоночных (моллюски, черви) и одноклеточных эукариот (инфузории). Оригинальным и перспективным является использование для выяснения молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с Gбелками пептидной стратегии, которая представляет собой принципиально новый подход в изучении функционирования сигнальных систем и их компонентов на субмолекулярном уровне (Chidiac, 1998; Covic et al., 2002). Открытие в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина (Pertseva et al., 2003), заставляет по-новому взглянуть на молекулярные механизмы действия на АЦС родственного ему релаксина. Релаксин регулирует широкий спектр физиологических процессов в организме человека и рассматривается как перспективный лекарственный препарат для лечения заболеваний репродуктивной, сердечно-сосудистой и нервной систем (Ivell, Einspanier, 2002; Lu et al., 2005). Однако до сих пор молекулярные механизмы действия релаксина на клетку изучены недостаточно. Их п 4 расшифровка представляет собой важнейший этап в понимании общих закономерностей регуляторного влияния релаксина и других пептидов инсулипового суперсемейства на функциональную активность эффекторных, в том числе цАМФ-зависимых, систем клетки, и является необходимым условием для практического применения релаксина в медицине. Опираясь на развиваемую нами концепцию молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных и гормонзависимых заболеваний (Перцева, Шпаков, 2004), было предпринято исследование функционального состояния АЦС и молекулярных механизмов сопряжения рецепторов с G-белками в условиях патологии при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс. Понимание природы нарушений функционирования АЦС при сахарном диабете важно как для диагностики этого социально значимого заболевания, так и для поиска эффективных путей его лечения. Создание новых, более эффективных, гормональных препаратов, обладающих высокой специфичностью и селективностью регуляторного действия на АЦС, требует разработки функциональных зондов для изучения молекулярных механизмов взаимодействия рецепторов с G-белками. Одним из перспективных подходов для разработки таких зондов является синтез нсгормональных регуляторов АЦС - пептидов, которые мимикрируют функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов и способны влиять на функциональную активность компонентов АЦС (Nurnberg et al., 1999; Breitvveg-Lehmann et al., 2002). Нами были впервые синтезированы и изучены различные по структуре поликатионные пептиды, которые по независимому от рецептора механизму активируют G-белки и влияют на передачу гормональных сигналов через АЦС, являясь, таким образом, негормональными регуляторами функциональной активности этой системы. В настоящее время сравнительно мало известно о структурно-функциональной организации АЦС одноклеточных эукариот, в частности инфузорий. В то же время, исследование сигнальных систем одноклеточных представляет как теоретическую, так и практическую ценность. Согласно развиваемым в нашей лаборатории представлениям (Перцева, 1989; Pertseva, 1991), именно на уровне одноклеточных организмов начинают формироваться гормональные сигнальные системы высших эукариот. Инфузории Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis, избранные нами в качестве объектов, широко используются в экотоксикологических исследованиях. Поскольку АЦС является одной из мишеней внешних воздействий, то выяснение ее функционирования поможет в разработке новых эффективных подходов для оценки последствий таких воздействий и их высокочувствительного мониторинга. Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в выяснении молекулярных механизмов функционального сопряжения гормональных рецепторов и гетеротримерных G-белков, компонентов АЦС, в клетках животных различного филогенетического уровня. Задачи исследования состояли: 1) С помощью сравнительного теоретического анализа выявить в рецепторах серпантинного типа и гетеротримерных G-белках молекулярные детерминанты, ответственные за их функциональное сопряжение и вовлеченные в процесс передачи гормонального сигнала. 2) Использовать пептидную стратегию, заключающуюся в синтезе пептидов, которые соответствуют взаимодействующим с рецепторами С-концевым участкам а-субъединиц 5 G-белков, для исследования молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных животных. 3) С применением впервые синтезированных пептидов, соответствующих С-концевому участку третьей цитоплазматической петли (С-ЦПЗ) рецептора релаксина LGR7, выявить и изучить молекулярные механизмы передачи релаксинового сигнала через АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных. 4) Расшифровать и исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма действия релаксина, обнаруженного в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea. 5) Исследовать чувствительность АЦС к биогенным аминам и пептидным гормонам при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс и выявить локализацию нарушений в АЦС, возникающих в условиях этой патологии. 6) Провести сравнительное исследование механизмов действия синтетических поликатионных пептидов, не имеющих гомологии с сигнальными белками, но способных мимикрировать функционально важные для сопряжения с G-белками участки рецепторов, на функциональную активность компонентов АЦС. 7) Охарактеризовать АЦС одноклеточных эукариот - инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis, и изучить молекулярные механизмы передачи через нее гормональных сигналов на этапе сопряжения рецептора с G-белком и АЦ. Научная новизна. В результате проведенных теоретических и экспериментальных исследований показано, что одним из основных молекулярных механизмов, лежащих в основе функционального сопряжения рецепторов с G-белками в тканях позвоночных и беспозвоночных, является способность поликатионных спиралей цитоплазматических петель активированного гормоном рецептора взаимодействовать с С-концевым сегментом а-субъединицы гетеротримерного G-белка и опосредовать, таким образом, передачу гормонального сигнала к АЦ и цАМФ-зависимым эффекторным системам. Впервые показано, что С-концевые пептиды а-субъединиц Gs- и G.-белков способны с высокой селективностью прерывать передачу гормонального сигнала через те типы G-белков, производными первичной структуры которых они являются, вследствие чего их можно применять для идентификации G-белков, участвующих в сигнальной транедукции. Показано, что впервые синтезированные нами пептиды, соответствующие С-ЦПЗ релаксинового рецептора LGR7 серпантинного типа, не только влияют на передачу релаксинового сигнала через АЦС в сердце и мозге крыс, но и независимым от рецептора способом активируют Gj-белки и АЦ. Это указывает на участие рецептора LGR7 в транедукции релаксинового сигнала в этих тканях и свидетельствует о вовлечении в процесс функционального сопряжения с Gs-белком С-ЦПЗ этого рецептора. Впервые расшифрован АЦ сигнальный механизм действия релаксина, реализуемый в скелетных мышцах крысы, который включает: рецептор тирозинкиназного типа => Gj-белок (GPy-димер) => фосфатидилинозитол-3-киназу => протеинкиназу СС, => Gs-белок => АЦ. По своей структурно-функциональной организации он сходен с открытым ранее в лаборатории АЦ сигнальным механизмом действия инсулина (Pertseva et al., 2003). В работе впервые показано, что основные нарушения в АЦС при стрептозотоциновом диабете 1-го и 2-го типов у крыс, возникают па этапе сопряжения рецепторов биогенных аминов и пептидных гормонов с различными типами G-белков. 6 Для изучения этих нарушений была применена разработанная автором пептидная стратегия. Впервые исследована АЦС представителей одноклеточных эукариот - инфузорий D. anser и Т. pyriformis, сходная по ряду свойств с АЦС позвоночных. Показано, что ее функциональная активность регулируется биогенными аминами и пептидными гормонами млекопитающих. Эти данные и результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур сигнальных белков, компонентов АЦС одноклеточных, свидетельствуют о раннем формировании АЦС в эволюции эукариот. Научно-практическая значимость работы. Синтезированные нами и исследованные в работе пептиды, соответствующие участкам рецепторов и G-белков, ответственным за взаимодействие между ними, а также синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие эти участки, но не имеющие гомологии с сигнальными белками, могут быть в дальнейшем применены как в качестве функциональных зондов для изучения молекулярных основ функционирования АЦС, так и в качестве высокоэффективных и селективных негормоиальных регуляторов активности сигнальных белков. В перспективе на основе этих пептидов могут быть разработаны лекарственные препараты, избирательно действующие на функциональную активность гормональных сигнальных систем. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов в Санкт-Петербургском государственном университете, Медицинском университете, Химико-фармацевтической Академии и других Университетах и вузах России. Положения, выносимые на защиту. 1. Основные молекулярные детерминанты, ответственные за взаимодействие с Gбелками, локализованы в проксимальных к мембране участках цитоплазматических петель рецепторов и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры. Синтетические пептиды, которые соответствуют участкам рецепторов и G-белков, ответственным за их функциональное взаимодействие, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала через АЦС. 2. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются ткане- и видоспецифичными и реализуются через гетеротримерные G-белки. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea - через шести компонентный АЦ сигнальный механизм. 3. В условиях стрептозотоципового диабета 1-го и 2-го типов у крыс наблюдаются нарушения функционирования чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам АЦС, в первую очередь на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком. 4. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с Gбелками участки рецепторов, способны по независимому от рецептора механизму активировать G-белки и влиять на проведение гормонального сигнала через АЦС. 5. В клеточных культурах инфузорий D. anser и Т. pyriformis имеется функционально активная АЦС, чувствительная к гормонам млекопитающих. Это согласуется с присутствием у одноклеточных эукариот сигнальных белков, гомологичных 7 компонентам ЛЦС позвоночных, что свидетельствует об эволюционной консервативности АЦС эукариотических организмов. Апробация работы. Основные результаты и положения работы широко представлены на большом числе отечественных и зарубежных научных конференций и симпозиумов, в том числе: на VI Международном конгрессе по нейроэндокринологии (Питтсбург, США, 2006), на III Международном симпозиуме по пептидам (Прага, Чехия, 2004), на III и IV Международных конференциях по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004), на XVII, XXI и XXII Конференциях сравнительных эндокринологов (СЕСЕ: Кордоба, Испания, 1994; Бонн, Германия, 2002; Упсала, Швеция, 2004), на Международном симпозиуме по сигнальной транедукции (FEBS: Брюссель, Бельгия, 2003), на Симпозиуме '"Cell Signalling Mechanisms: from Membrane to Nucleus" (FEBS: Амстердам, Нидерланды, 1997), на Европейской конференции "Cell signaling, transcription, and translation as therapeutic targets" (Люксембург, 2002), на Международном симпозиуме "Structure, stability and folding of proteins: fundamental and medical aspects" (Москва, 1998), на VII Восточноевропейской конференции по нейробиологии беспозвоночных (Калининград, 2003), на IV Международной конференции по простейшим нервным системам (Пущино, 1994), на XI, XII и XIII Международных конференциях по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996, 2002, 2006), на Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004), на I и II Всероссийских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на Всероссийском физиологическом съезде (Екатеринбург, 2004), на I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 85 научных работ, в том числе 45 статей в рецензируемых отечественных и международных научных изданиях и 40 тезисов докладов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах, состоит из введения, 6 отдельных глав, включающих обзор литературы, результаты экспериментальных и теоретических исследований и их обсуждение, главы с описанием методов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 342 источника, в том числе 78 отечественных и 264 иностранных. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 11 таблицами. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В опытах использовали: (1) самцов белых крыс линии Wistar и самцов белых беспородных крыс; (2) инфузорий Tetrahymena pyriformis и Dileptus anser; (3) пресноводных двустворчатых моллюсков Anodonta cygnea; (4) земляных червей Lumbricus terrestris. В работе применяли широкий спектр биохимических и фармакологических подходов и методов, включающий: - выделение фракций плазматических мембран из тканей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски, черви) животных методом дифференциального ультрацентрифугирования; - выделение частично очищенных мембранных фракций из гомогенатов клеточных культур инфузорий; 8 - определение активности Mg """-зависимой АЦ с помощью меченых [сс-32Р]АТФ и [83 Н]АТФ в качестве субстратов; - определение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (протеинкиназы А) с помощью [у-3*Р]АТФ в качестве субстрата; - определение связывающих характеристик В-адренергических (АР) и серотониновых рецепторов с помощью [ Н]-дигидроальпренолола и 5-[1,2- Н(М)]-гидрокситриптамина, соответственно; - определение ГТФ-связывания гетеротримерных G-белков с помощью [8-3H]GppNHp; - АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами; - создание моделей стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс; - синтез пептидов твердофазным методом и их применение для изучения функционирования АЦС и молекулярных механизмов сопряжения между компонентами этой системы - гормональными рецепторами и G-белками; - теоретические исследования первичной структуры сигнальных белков с помощью программ BLASTp и BLASTx; - поиск локальной гомологии в сигнальных белках с помощью разработанного автором графическою метода; - расчет склонности участков первичной структуры сигнальных белков к формированию а-спиралей и суперспиральных структур. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Поиск молекулярных детерминант в молекулах рецепторов серпантинного типа и гетеротримерных G-белков, ответственных за их функциональное взаимодействие. Проблема функционального взаимодействия между белками - компонентами АЦС и поиск молекулярных детерминант, вовлеченных в это взаимодействие, занимает одно из центральных мест в современной биохимии и молекулярной эндокринологии. Выявление этих детерминант, ставшее задачей первого этапа исследования, было необходимо для разработки в дальнейшем пептидной стратегии и направленного синтеза пептидов, способных эффективно влиять на функциональную активность АЦС. Данные литературы и проведенный нами с помощью компьютерных методов сравнительный анализ первичных структур цитоплазматических петель более 50 рецепторов серпантинного типа свидетельствуют о том, что в большинстве из них ключевую роль в сопряжении с G-белками играет третья цитоплазматическая петля, причем если для взаимодействия с Gs-бслками наиболее важны С-концевыс участки этой петли, то для взаимодействия с С,-белками - ее N-концевые участки. В N- и С-концевых участках третьей цитоплазматичсскои петли были выявлены высоко консервативные мотивы, обогащенные положительно заряженными аминокислотными остатками, которые определяют селективность и эффективность взаимодействия рецептора с Gбелками. Эти участки, как показал теоретический анализ их вторичной структуры, способны к образованию амфипатических а-спиралей, что наиболее отчетливо выражено в случае С-концевых участков. В молекулах G-белков определяющая роль в сопряжении с рецептором принадлежит сравнительно короткому С-концевому сегменту их Ga-субъединиц (Sunahara et al., 1997; Blahos et al., 2001). Проведенный нами сравнительный анализ 9 показал, что среди Ga-субъединиц, относящихся к одному семейству, первичная структура их С-концевых сегментов высоко консервативна или даже идентична, и, наоборот, среди Ga-субъединиц, относящихся к различным семействам, она вариабельна. Таким образом, С-концевые сегменты Ga-субъединиц отвечают не только за эффективность, но и за селективность взаимодействия G-белка с рецептором. 2. Исследование молекулярных механизмов действия гормонов на активность АДС с применением С-концевых пептидов a-субъединиц Gs- и Gj-белков. Второй этап был посвящен разработке и апробации пептидной стратеги)!, которая основана на применении пептидов, соответствующих С-концевым сегментам асубъединиц G-белков. Эти пептиды были использованы для исследования молекулярных механизмов регуляции АЦС гормонами и выявления типа G-бслков, участвующих в процессе передачи гормонального сигнала. Нами были синтезированы три пептида, соответствующие С-концевому сегменту Gas-субъединицы млекопитающих - 385-394, 387-394 и карбобензокси-387-394 Ga s , и пептид, который соответствует С-концевому сегменту 346-355 ба.г-субъединицы млекопитающих. Было изучено их влияние на передачу стимулирующих и ингибирующих активность АЦ гормональных сигналов в тканях позвоночных (крыса) и беспозвоночных (моллюск Л. cygnea). Вес Gas-пептиды дозозависимо снижали стимулирующие АЦ эффекты серотонина (рис. 1) и изопротеренола в тканях моллюска и крысы, которые осуществляются через Gsбелки. Их ингибирующее влияние осуществлялось по конкурентному механизму - Gasпептиды конкурировали с Gs-белком за связывание с молекулой рецептора. Наиболее эффективным был пептид 385-394, наименее эффективным - карбобензокси-387-394, на основании чего сделан вывод о том, что эффективность С-концевых Са5-пептидов определяется их структурой - длиной (декапептид 385-394 активнее октапептида 387394) и наличием функциональных групп (пептид 387-394 с карбобензоксигруппой менее активен в сравнении с не модифицированным аналогом). Пептид 346-355 Gaj2 дозозависимо снижал осуществляемые через Gj-белки ингибирующие эффекты изопротеренола в мышцах моллюска и Ог-агониста бромкриптина в мозге крысы на предварительно стимулированную форсколином активность АЦ (рис. 2). В случае серотонина в скелетных мышцах крысы, который, как было показано нами ранее, активирует как Gs-, так и 0,-белки, пептид 346-355 Ga^ подавлял ингибирующий АЦ сигнал и способствовал выявлению стимулирующего эффекта гормона, в то время как Gas-пептиды подавляли стимулирующий АЦ сигнал и способствовали выявлению его ингибирующего эффекта (рис. 3). Это свидетельствует о возможности использования С-концевых пептидов в качестве селективных блокаторов сопряжения рецепторов с определенным типом G-белков. Все С-концевые пептиды дозозависимо снижали стимуляцию гормонами ГТФсвязывания, которое является показателем функциональной активности G-белков. При этом Gas-пептиды снижали стимуляцию ГТФ-связывания биогенными аминами, действующими через Gs-белки (рис. 4), в то время как пептид 346-355 Gaj2 снижал стимуляцию ГТФ-связывания изопротеренолом в мышцах моллюска и бромкриптином в мозге крысы, реализующими свое действие через Gj-белки (рис. 5). Стимуляция ГТФсвязывания серотонином в скелетных мышцах крысы, который активирует оба типа Gбелков, снижалась в присутствии как Ga s -, так и Са|2-пентидов (рис. 5). to гг .1.120 . ?100п < 80>x | 60| 40 с 20 Рис. 1, Влияние Gcii-пептидов на стимулирующий ЛЦ эффект ^ ^ t ГО\^-1 ^\Тч^~""~~~»Т \ | ^ \ IV. ^ O i ^ ^ - J 32 5-~^J rI В ° *1 7 6 серотонина в гладких мышцах моллюска. 1, 2 и J - пептиды 385-394, 387-394 и карбобензокси-387-394 Gcts. По вертикали - стимулирующий АЦ эффект 10"6 М серотонина, % . 6 4 -|од[пептид], М Рис. 2. Влияние пептида 346-355 Ga, 2 на ингибированис изопротерсиолом в гладких мышцах моллюска (а) и D 2 агонистом бромкриптином в мозге крысы (б) активности АЦ, стимулированной форсколином. / - 10'5 М форсколин; 2 - ( / ) + 10* М гормон; 3-6 - (2) + W 7 , Iff*, 10"5 и Ю-4 М пептид. Назальная активность А Ц принята за 100%. Ингибирующее влияние С-концсвых пептидов реализуется на этапе сопряжения рецептора с G-белком. Доказательством этого является переход рецепторов в низкоаффинное для агониста состояние в их присутствии. Так, если без С-концевых пептидов кривая вытеснения антагониста Р-АР [ Н]-ди1 идроальпренолола агонистом изопротеренолом при добавлении Г Т Ф , который снижает сродство рецептора к агонисту, смещалась вправо (значение К, возрастало с 78 до 482 н М ) , то в присутствии Осц-пептида 385-394, такое смещение практически отсутствовало, поскольку рецептор изначально находился в низкоаффинном состоянии ( К „ 141 н М ) (рис. 6). II Рис. 3. Влияние С-концезых пептидов на регуляцию серотонином активности АЦ в скелетных мышцах крысы. 1,2*1пептиды 385-394, 387-394 и карбобснзокси-387-394 Gets; 4 пептид 346-355 Ga,2. По вертикали - активность ЛЦ в присутствии 10''' М серотонина, %. Базальная активность АЦ принята за 100%. Рис. 4. Влияние Gas-пептидов и пептида 346-355 Ga,2 (10 М) на стимуляцию ГГФсвязывания серотонином в гладких мышцах моллюска (о) и мозге крысы (б) и изопротеренолом в скелетных мышцах крысы (в). / - без добавок; 2 - гормон, 10"6 М; 3 - гормон + 385-394 Ga s ; 4 - гормон + 387-394 Ga s ; 5 - гормон + карбобекзокси-387-394 Gc^; б - гормон + 346-355 Go^. ГТФ-связывание в контроле принято за 100 %. *, р < 0.05. 12 5? | | 2 280 240 200 160- n g 120 e 80" t 40 0 а б в Рис. 5. Влияние Gas-пептидов и 346-355 Ga,2 (Ю"' М) на стимуляцию ГТФ-связывания изоиротеренолом в гладких мышцах моллюска (а), бромкриптином в мозге крысы (б) и серотопином в скелетных мышцах крысы (в). Обозначения те же. что и на рис. 4. *, р < 0.05. г? г 100-1 • ш 3 п 5« А • Б 1 fe-t-^-r N. \ 80- 1 юо+ГТФ о $ 8 eo^ 1 8 °" § вобез ГТФА Ф § 40- о § 40 I 20- 13ос о о без ГТФ \ \ О 10 9 8 7 6 5 4 -1од[изопротереноп], М Iё2 0 О 10 9 8 7 6 5 4 •1од[изопротеренол], М Рис. 6. Вытеснение ['Н]-дигидроальпренолола изоиротеренолом из связывающих мест в мембранах скелетных мышц крысы в присутствии Gas-пептида 385-394. А - контроль; Б - в присутствии 10"5 М пептида 385-394 Ga s . / - изопротерснол; 2 изопротеренол + 1 Т Ф , 10"1 М . По оси ординат - специфическое связывание [ 5 Н]дигидроальпренолола, %. Разработанная нами стратегия, основанная на использовании С-концевых пептидов, была применена для изучения сигнальных механизмов действия биогенных аминов на активность АЦС в тканях моллюска A. cygnea. 13 Октопамин, дофамин и серотонин (10"8-104 М) дозозависимо стимулировали активность ЛЦ и ГТФ-связывание в ганглиях и гладких мышцах моллюска. При сравнительном исследовании действия биогенных аминов на АЦС в тканях моллюска обнаружено, что в ганглиях наиболее эффективны октопамин и дофамин, в мышцах октопамин и серотонин. В присутствии пептида 385-394 Gcts стимулирующие активность АЦ (рис. 7) и ГТФ-связывание эффекты биогенных аминов снижались или полиостью блокировались. Это свидетельствует о том, что эти эффекты реализуются через рецепторы, сопряженные с Gs-белками. Пептид 346-355 Ga,2 был эффективен только в отношении АЦ эффекта серотонина в ганглиях. Он отчетливо его усиливал, что указывает на участие в реализации этого эффекта как Gs-, так и С-белков. Полученные данные согласуются с результатами ингибиторного анализа, проведенного нами с помощью специфических антагонистов рецепторов биогенных аминов. Таким образом, блокирование С-концевыми пептидами функциональной активности АЦС осуществляется на этапе взаимодействия активированного гормоном рецептора с Gбелком, причем действие С-концсвых пептидов осуществляется по конкурентному механизму и является высоко селективным. Gas-нептиды ингибируют передачу стимулирующих, а йа^-пептиды — ингибирующих АЦ гормональных сигналов. 6 5 4 -1од[пептид 385-394], М 7 6 5 4 -1од[пептид 385-394], М Рис. 7. Влияние пептида 385-394 Gas (10"7-10'4 М) на стимуляцию гормонами (10"5 М) активности АЦ в ганглиях и гладких мышцах моллюска. А - ганглии, Б - мышцы. 1 - октопамин; 2 - дофамин; 5 - серотонин. 3. Молекулярные механизмы действия релаксина на активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных. Целью третьего этапа работы была расшифровка молекулярных механизмов регуляторного влияния релаксина, родственного инсулину пептидного гормона, на функциональную активность АЦС в тканях позвоночных и беспозвоночных. В качестве объектов для исследования были избраны ткани позвоночного животного крысы - миокард, мозг и скелетные мышцы, и мышцы беспозвоночных - 14 моллюска A. cygnea и червя L. terrestris. Для изучения участия G-белков и релаксинового рецептора LGR7 серпантинного типа в регуляторном действии релаксина на АЦ была применена пептидная стратегия. Она была основана на использовании С-концевых пептидов а-субъединиц G-белков и впервые синтезированных нами 11-ти и 15-тичленных пептидов, QVKKE-Nle-lLAKR-амида (619-629) и EIRNQVKKE-Nle-ILAKRамида (615-629), соответствующих С-ЦПЗ рецептора релаксина LGR7. Выбор пептидов, производных С-ЦПЗ рецептора LGR7, был продиктован следующими обстоятельствами: (/) соответствующий участок в рецепторе тиреотропного гормона, гомологичного, согласно нашим данным, рецептору LGR7, играет ключевую роль во взаимодействии с Gбелками (Kosugi et al., 1992); (2) в участке 619-629 расположены кластеры положительно заряженных аминокислот, которые являются основными молекулярными детерминантами, ответственными за сопряжение рецепторов с G-белками. Поскольку включение гидрофобных радикалов в пептиды усиливает их взаимодействие с мембраной и повышает эффективность взаимодействия с сигнальными белками (Covic et al., 2002), пептид 619-629 был модифицирован остатком пальмитиновой кислоты - QVKKE-Nle1ЬАКЛК(Ра1т)-амид (619-629-Lys(Palm)). Релаксин дозозависимо стимулировал АЦ во всех исследованных тканях (рис. 8). Действие гормона было наиболее отчетливо выражено в миокарде и мозге, в меньшей степени - в скелетных мышцах крысы, и слабо выявлялось в мышцах беспозвоночных, что свидетельствуют о тканевой и видовой специфичности его влияния на АЦС. Релаксин также стимулировал ГТФ-связывание G-белков (рис. 9). В присутствии сурамина, специфичного ингибитора гетеротримерных G-белков, стимулирующие эффекты релаксина блокировались. Это указывает на то, что релаксин осуществляет свое действие на АЦ именно через гетеротримерные G-белки и не оказывает заметного влияния на другие их типы. 500 SS - j 400 <£ Б зоо —•—1 —•—2 —А—3 •ш Л • •* • 5 г < 200-1 100 9 8 7 -1од[релаксин], М Рис. 8. Стимуляция релаксином активности АЦ в тканях крысы и мышцах моллюска A. cygnea и червя L. terrestris. 1, 2, 3 - мозг, миокард и скелетные мышцы крысы; 4 - гладкие мышцы моллюска; 5 - мышцы кожномускульного мешка червя. Базальная активность АЦ, которая составляла в мозге - 76.9+5.2, в миокарде - 16.6+1.1, в скелетных мышцах 16.2+0.8, в мышцах моллюска - 23.6+1.8, в мышцах червя 55.7±4.4 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка, принята за 100 %. 15 Рис. 9. Стимуляция релаксином ГТФсвязывания во фракциях мембран миокарда, скелетных мышц и мозга крысы. 1 - миокард, 2 - скелетные мышцы, 3 мозг. Базальный уровень ГТФ-связывания, который в миокарде, скелетных мышцах и мозге составлял соответственно 2.37±0.14, 1.45±0.13 и 6.9310.35 пмоль [8-3H]-GppNHp на 1 мг мембранного белка, принят за 100 %. Пептиды 615-629 и 619-629-Lys(Palm) в отсутствие гормона дозозависимо стимулировали активность АЦ (рис. 10) и ГТФ-связыванис. Стимулирующий эффект пептида 619-629-Lys(PaIm) был выражен в большей степени, что связано с наличием в его структуре гидрофобного остатка пальмитата. Таким образом, пептиды, производные С-ЦПЗ рецептора LGR7, способны независимым от рецептора способом стимулировать активность АЦ и G-бслка. Действие пептидов осуществлялось в микромолярном диапазоне концентраций, что указывает на их высокую эффективность. 240 л в4 Хз 220 -j 200 Л 180- ЗЕТ^*-2 а 160г Ш 140S £ 120- ..*. ' ^Л1 < Рис. 10. Стимуляция пептидами, производными С-ЦПЗ релаксинового рецептора LGR7, активности АЦ в миокарде крысы. 1 - пептид 619-629; 2 - пептид 619-629-Lys(Palm); 3 - пептид 615-629. 1007 6 5 4 -1од[пептид], М В присутствии пептидов 619-629-Lys(Palm) и 615-629 ( 1 0 - 1 0 " ' М) стимулирующий эффект релаксина на АЦ и ГТФ-связывание в миокарде (рис. 11) и мозге крысы дозозависимо снижался. Ингибирующее влияние пептидов осуществляется по конкурентному механизму - они конкурируют с рецептором релаксина LGR7, производными которого являются, за связывание с G-белком. Таким образом, релаксиновый сигнал в миокарде и мозге передается к АЦ через рецептор LGR7 16 серпантинного типа. Влияние пептидов на стимулирующие АЦ эффекты релаксина было ткане- и видоспецифичным - в скелетных мышцах крысы и мышцах беспозвоночных оно не выявлялось, что указывает на участие других типов рецепторов в реализации эффектов гормона в этих тканях. £ 120 X 2 * "О £ « S 1 80 в й t S во • х в» в а | | 4 0 S S £ й 20 6 5 4 -1од[пептид], М 6 5 4 -1од[пептид], М Рис. 11. Ингибирующее влияние пептидов, производных С-ЦПЗ рецептора LGR7, на стимуляцию релаксином (10"8 М) активности АЦ (а) и ГТФ-связывания (б) в миокарде крысы. 1 - пептид 619-629; 2 - пептид 619-629-Lys(Palm); 3 - пептид 615-629. По оси ординат стимулирующий эффект релаксина на активность АЦ, % (а), и связывание [8-3Н]GppNHp, % (б). Эффекты гормона в отсутствие пептидов приняты за 100 %. Для выяснения типа G-белков, участвующих в передаче релаксинового сигнала, были применены С-копцевые пептиды и техника АДФ-рибозилирования мембран холерным и коклюшным токсинами. АДФ-рибозилтрансферазы этих токсинов селективно выключают из процесса передачи гормонального сигнала Gs- и Gj-белки, соответственно (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Пептид 385-394 Gas отчетливо снижал АЦ эффекты релаксина в миокарде и мозге, пептид 346-355 Gaj2 на них не влиял (рис. 12). В скелетных мышцах крысы и мышцах беспозвоночных С-концевые пептиды были не эффективны. Обработка холерным токсином приводила к блокированию АЦ эффекта релаксина в мембранах миокарда и мозга (табл. 1). Коклюшный токсин в этом случае был не эффективен. Следовательно, релаксин осуществляет регуляцию АЦ в миокарде и мозге крысы через Gs-белок, а его АЦ сигнальный механизм в этих тканях включает три компонента - рецептор серпантинного типа LGR7, Gs-белок и фермент АЦ. В скелетных мышцах крысы (табл. 1) и гладких мышцах моллюска обработка обоими токсинами приводила к блокированию АЦ эффекта релаксина, что свидетельствует об участии как Gs-, так и 0,-белков в реализации эффекта гормона в этих тканях. Сходная картина наблюдалась и в случае расшифрованного ранее в лаборатории АЦ сигнального механизма действия инсулина, который, наряду с Gs- и Gj-белками, 17 включает рецсптор-тирозиикиназу, фосфатидилинозитол-3-киназу и протвинкиназу CQ (Pcrtseva et al., 1995, 1996, 2003; Plesncva ct al., 2001). Мы предприняли попытку идентифицировать эти сигнальные блоки в АЦ сигнальном механизме действия релаксина в скелетных мышцах крысы и мышцах моллюска. 500 Рис. 12. Влияние С-концевых пептидов Ga,- и Са^-субъсдиниц на стимулирующий АЦ эффект релаксина (10" М). а - мозг крысы; б - миокард крысы; в - скелетные .мышцы крысы; г - мышцы моллюска; д- мышцы червя. / - без пептида; 2, 3 - в присутствии 10' и 10"1 М пептида 38S-394 Ga5; 4 - в присутствии Ю-4 М пептида 346-355 Ga,2. *, р < 0.0S. Таблица 1. Влияние АДФ-рибозилирования мембран бактериальными токсинами на стимуляцию АЦ релаксином в тканях крысы. Активность АЦ, пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка Кеч ! ормона Релаксин, 10'8 М Обработка коклюшным токсином Мозг 80.4 + 7.4 425.3 ±9.5* (+429%) Миокард 17.4 ±1.6 111.3 ± 7 . 1 * (+540%) Скелетные мышцы 16.4 ±1.2 22.3 ±1.7* (+36%) Обработка холерным токсином Мозг 138.6 + 8.9 165.4 ±8.3* (+19%) Миокард 35.2 ±1.4 44.8 ± 2.5* (+27 %) Скелетные мышцы 34.711.8 36.2 ±1.9 (+4%) Значения стимулированной релаксином АЦ активности, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствие гормона (/> < 0.05), отмечены звездочками. Ткань 18 Тирфостин-47 (рис. 13) и генистеин, ингибиторы тирозинкиназы, и вортманнин, ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы, дозозависимо снижали АЦ эффект релаксина в скелетных мышцах крысы и мышцах моллюска, что указывает на участие тирозинкиназы и фосфатидилинозитол-3-киназы в реализации эффекта гормона. Тирозинкиназа, как мы полагаем, является рецепторной, поскольку использованные нами ингибиторы тирозинкиназы действуют в основном на мембранносвязанные формы фермента. Специфические антитела к атипичной изоформе протеинкиназы СС, млекопитающих дозозависимо ингибировали АЦ эффект релаксина в скелетных мышцах крысы, но были не эффективны в мышцах моллюска, что может быть связано как с их видовой специфичностью, так и с различиями в наборе изоформ протеинкиназы С в тканях позвоночных и беспозвоночных. Ингибирование АЦ эффекта релаксина тирфостином-47, генистеином, вортманнином и антителами, выработанными на нротеинкиназу СС,, было специфичным и не выявлялось в отношении стимуляции АЦ биогенными аминами. Следовательно, АЦ сигнальный механизм действия релаксина в скелетных мышцах крысы включает: рецептор тирозинкиназного типа => 0,-белок (GPy-димер) => фосфатидилинозитол-3-кнназу => протеинкиназу СС, => Gs-белок => АЦ. В гладких мышцах моллюска Anodonta cygnea его структурно-функциональная организация сходная, отличаясь лишь изоформой протеинкиназы С. Рис. 13. Действие ингибитора тирозинкиназы тирфостина-47 на стимулирующий АЦ эффект релаксина (Ю-8 М) в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска. 1 - мышцы крысы; 2 - мышцы моллюска. Максимальный АЦ эффект релаксина принят за 100 %. Изменения АЦ эффекта релаксина при действии тирфостина-47 достоверны, р < 0.05. 1 2 3 4 5 [тирфостин-47], мкМ 4. Нарушения функционального сопряжения рецепторов с гетеротримерными Gбелками при стрептозотоцииовом диабете. В настоящее время получены доказательства того, что при различных формах патологии, в том числе при диабете, наблюдаются значительные функциональные нарушения в гормональных сигнальных системах (Lania et al., 2001; Thompson et al., 2005). В случае АЦС предполагается, что наиболее чувствительным звеном является сопряжение рецепторов с G-белками. На четвертом этапе с целью выявления функциональных нарушений в АЦС при стрептозотоцииовом диабете 1-го и 2-го типа у 19 крыс нами была исследована чувствительность этой системы и ее отдельных компонентов к действию гормональных агентов, осуществляющих как стимуляцию активности АЦ через Gs-белки, так и ее ингибирование через 0,-белки. 30-сут стрептозотоциновый диабет 1-го типа вызывали интраиеритониальным введением крысам стрептозотоцина, вследствие чего у животных развивалась стойкая глюкозурия и гипергликемия. Базальная активность АЦ в скелетных мышцах диабетических крыс (18.5±0.9 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка) была выше, чем в контроле (13.7+0.4 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка). Стимулирующее действие изопротеренола (10"8-1О'5 М) на активность АЦ и ГТФ-связывание в скелетных мышцах контрольных крыс было более выражено в сравнении с диабетическими животными. Так гормон (10"6 М) стимулировал ГТФ-связывание в контроле на 97 %, при диабете - на 42 %. Полученные результаты свидетельствуют о снижении реактивности Gs-сопряженной АЦС в скелетных мышцах крысы к изопротеренолу при стрептозотоциновом диабете 1-го типа, причем основные повреждения возникают на уровне Gs-белка. Норадреналин, который активирует как Gs-, так и Gj-белки, повышал активность АЦ в скелетных мышцах при диабете эффективнее, чем в контроле, в то время как его стимулирующее влияние на ГТФ-связывание G-белков при диабете было выражено слабее. Это связано с подавлением иш ибирующего влияния норадреналина на активность АЦ, осуществляемого через Gj-белки, что и было подтверждено с помощью С-концевых пептидов. Так, в присутствии пептида 346-355 Goti2, который подавляет ингибирующий путь регуляции АЦ, эффект гормона в контроле возрастал на 50 %, при диабете - только на 20 % (Рис. 14). Наряду с этим, пептид 346-355 Ga;2 снижал стимуляцию норадреналином ГТФ-связывания в мышцах контрольных животных более отчетливо в сравнении с диабетическими крысами. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о нарушении функции Gi-белков при диабете 1-го типа (Wichelhaus et al., 1994; Gando et al., 1997). Сходные изменения чувствительности АЦС к гормонам были выявлены и в миокарде крыс со стрептозотоциновым диабетом 1-го типа. 270 ;£ i f 200- < 1ЯП- о о X 160- а | < 140 120 100 7 6 5 4 -!од[пептид], М Рис. 14. Влияние пептидов 385-394 Gas и 346-355 GotjT на стимулирующий АЦ эффект норадреналина (10~6 М) в скелетных мышцах контрольных крыс и крыс с диабетом 1-го типа. 1,3- контроль; 2, 4 - диабет 1-го типа. 1, 2 - ъ присутствии пептида 385-394 Gas; 3,4 - в присутствии пептида 346355 Gaji. Базальная активность АЦ принята за 100 %.р< 0.05. 20 Таким образом, при стрептозотоциновом диабете 1-го типа снижается чувствительность АЦС скелетных мышц и миокарда крыс к действию биогенных аминов, что наиболее отчетливо выявляется в случае АЦС, сопряженной с Gj-белками. Это может быть связано как с нарушением взаимодействия G.-белков с рецептором, так и со снижением уровня их экспрессии при диабете 1-го типа. Выявлено также снижение функционального сопряжения рецепторов биогенных аминов с Gs-белком, ведущее к ослаблению стимулирующего АЦ сигнала. Для создания стрептозотоциновой модели инсулин-независимого диабета 2-го типа (Hemmings, Spafford, 2000) новорожденным 1-2-сут самцам крыс вводили стрептозотоцин в дозе 80 мг/кг веса тела животного, что приводило к развитию у них диабета 2-го типа. Животных забивали через 80 дней после введения стрептозотоцина. Активаторы G-белков NaF и GppNHp, негидролизуемый аналог ГТФ, стимулировали АЦ в миокарде крыс с диабетом 2-го типа слабее в сравнении с контрольными животными. В мозговой ткани различия были выражены в меньшей степени. Эти данные свидетельствуют о том, что при стрептозотоциновом диабете 2-го типа в миокарде снижается чувствительность Gs-белков к негормональным активаторам, а, следовательно, нарушается их взаимодействие с АЦ. Релаксин и изопротсренол, действующие через Gj-белки, дозозависимо стимулировали АЦ в миокарде как диабетических, так и контрольных животных, однако их АЦ эффекты при диабете были заметно снижены, в наибольшей степени в случае релаксина (рис. 15). В присутствии пептида 385-394 Gas АЦ эффекты гормонов в миокарде снижались (рис. 16). При этом у диабетических крыс АЦ эффекты гормонов были менее чувствительны к ингибирующсму влиянию пептида 385—394 Gas, а в случае релаксина - также и к ингибирующему влиянию пептидов, производных С-ЦПЗ релаксинового рецептора LGR7. Так пептиды 619-629-Lys(Palm) и 615-629 (10"5 М) в миокарде контрольных крыс снижали АЦ эффект релаксина (10"s M) на 71-72 %, а в миокарде диабетических животных - на 52-55 %. Это является следствием снижения эффективности сопряжения гормональных рецепторов с Gs-белком при диабете 2-го типа. В мозге диабетических и контрольных крыс не было выявлено заметных различий в эффективности стимулирующего АЦ действия релаксина и серотонина, что указывает на тканевую специфичность нарушений функциональной активности Gs-белков и их сопряжения с рецепторами при стрептозотоциновом диабете 2-го типа. Для выявления нарушений в сопряженных с Gj-белками сигнальных каскадах при стрептозотоциновом диабете 2-го типа было изучено влияние пептидного гормона соматостатина и 02-агониста бромкриптина, действующих на АЦ через 0,-белки, на предварительно стимулированную форсколином активность АЦ. Обнаружено, что как в миокарде, так и в мозге диабетических животных ингибирующие эффекты гормонов на стимуляцию АЦ форсколином отчетливо снижаются (рис. 17). При этом ингибирование АЦ при диабете лишь в незначительной степени снижалось в присутствии пептида 346355 Goii2, в то время в контроле этот пептид полностью блокировал ингибирующие АЦ эффекты гормонов (рис. 16). 21 500 б 250 < 200 1 2 150- 100 8 7 -1од[репаксин], М 7 6 5 -1од[изопротеренол], И Рис. 15. Стимулирующие А Ц эффекты гормонов в миокарде контрольных и диабетических крыс. а - релаксин, о - изопротерепол. / - контроль, 2 - диабет 2-го типа. Базальная активность А Ц принята за 100 %• Рис. 16. Влияние пептидов 385-394 Get, и 346-355 Ga,2 ( 1 0 J M ) на стимулирующие А Ц эффекты релаксина ( 1 0 8 М) (/, 2) и изопротерснола (10' 5 М ) (3. 4) в миокарде (а) и на ин| ибирование соматостатином (10" М ) (1, 2) и бромкриитином (10" М ) (3, 4) стимулированной форсколином А Ц активности в миокарде и мозге (б) контрольных и диабетических крыс. 1,3контроль, 2, 4 - диабет 2-го типа. Белые столбики - без пептида, серые - в присутствии пептида 385-394 Ga s , черные - в присутствии пептида 346-355 Ga,2. Стимулирующие А Ц эффекты гормонов (а) и форсколина в отсутствие гормонов (б) приняты за 100 %. *.р < 0.05. | 20- *" —i 1 8 7 6 -!од[соматостатин], М о о ев Ч: О) о г • £2 4Ь о E l 40 о. о ** \ о п$> 80- < $ 60 i 1 К> о .p. э о В 100• & тимулирующий АЦ эффект форсколина, % 22 »- 7 6 6 -1од[бромкриптин], М Рис. 17. Ингибирование стимулированной форсколином (10"s М) активности ЛЦ соматостатином в миокарде (а) и бромкриптином в мозге (б) крыс. 1 - контроль, 2 - диабет 2-го типа. Стимулирующий АЦ эффект форсколина в отсутствие гормонов принят за 100 %. Совокупность полученных нами данных свидетельствует о нарушениях функционального сопряжения гетеротримерных G-белков с рецепторами различных гормонов и ЛЦ при стрептозотоциновом диабете 2-го типа. Как и в случае стрепгозотоцинового диабета 1-го типа, наиболее значительные нарушения возникают при передаче гормонального сигнала через G.-белки, что согласуется с данными литературы о снижении их функций при диабете 2-го типа (Livingstone et al., 1991; Palmer et al., 1992). Базальная активность АЦ при стрептозотоциновом диабете 2-го типа, в отличие от таковой при диабете 1-го типа, в миокарде и мозге практически не меняется. Выявлена тканевая специфичность изменений в функциональной активности Gsсопряженной АЦС при диабете 2-го типа, заключающаяся в снижении ее чувствительности к гормонам в миокарде диабетических крыс при отсутствии заметных изменений в мозге. 5. Молекулярные механизмы действия поликагнойных пептидов, мимикрирующих цигоплазматические петли рецепторов, на функциональную активность АЦС. На пятом этапе проводилось изучение молекулярных механизмов действия впервые синтезированных нами поликатионных пептидов на функциональную активность АЦС. Поликатионные пептиды характеризуются способностью формировать амфипатические спирали, вследствие чего мимикрируют участки цитоплазматических петель рецепторов, взаимодействующие с G-белками, и способны активировать G-белки по независимому от рецепторов механизму (Mousli et al., 1990; Higashijima et al., 1990; Leschke et al., 1997; Fukushima et al., 1998; Nurnberg et al., 1999; Breitweg-Lehmann et al., 2002). Эти пептиды могут быть применены в качестве функциональных ЗОНДОЕ для изучения сопряжения рецепторов с G-белками. 23 Для исследования нами были синтезированы 12 поликатионных неразветвленных пептидов, которые по своим структурным признакам объединены в три группы (собственно поликатионные, поликатионные с остатками глутаминовой кислоты и поликатионные с гидрофобными Сю-радикалами), а также 4 поликатионных пептида с разветвленной структурой (табл. 2). Исследование вторичной структуры с помощью спектроскопии кругового дихроизма показало, что наиболее высокой склонностью к образованию спиральных структур среди них обладают пептиды с гидрофобными радикалами. Таблица 2. Структура поликатионных пептидов, доля их спиральной конформации (по данным спектроскопии кругового дихроизма в трифторэтаноле) (1) и значения IC50 (цЩ для ингибирующего влияния на АЦ эффекты ссротонина в мышцах моллюска (2) и изопротеренола в скелетных мышцах крысы (5). № | Пептид | 1 \ 2 \ 3 Группа 1. Поликатионные пептиды. >1000 I Ас-АНААНА 6% >1000 II 20% 100 120 Ac-АН АААНААНА III Ас-РРНААНАААНААНА 21% 60 100 IV Ас-АНАКАНАКАНАКАНАКА 20% 120 150 V 52 24% 65 C-eAhx-YKAKKKKKKKWK Группа 2. Поликатионные пептиды, содержащие остатки глутаминовой кислоты. VI Ac-KLHEKLHEKLHEKL 500 31% 400 VII Ac-KLHEKLHEKKHEKL 24% 160 160 VIII Ac-LKEKLKEKLKEKLKEKL 27% 160 150 IX 58% 500 750 Ac-IHEKIHEKIHEKIHEKA Группа 3. Поликатионные пептиды, содержащие гидрофобные Сю-радикалы. 56 X K(C,„)-HEKK(Ci0)-HEKK(C,o)-HEKK(C,0)-HEKA 75% 70 32 XI 70% 47 CK(C 1 o)-EAhx-YKAKKKK.KKKWK 22 XII 63% 28 C-EAhx-WKK(C10)-KKK(C,o)-KK.KK(C1o)-YK.K(C,o)KK Пептид (ЕК)„. XIII | Ас-ЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКЕКА | 60 % | >1000 | >1000 Группа 4. Разветвленные пептиды (димерные XIV и XV, тетрамериые XVI и XVII). XIV (GRKKRRQRRRPPQ)2-K-£Ahx-C(Acm) 58% 180 500 22% 100 60 XV (GRGDSGRKKRRQRRRPPQ)2-K-EAhx-C(Acm) 2 XVI 8 6% f(GRKKRRQRRRPPQ)2-K-EAhx-Cl2 7 0.9 XVII f(GRGDSGRKKRRQRRRPPQ)2-K-EAhx-Cl2 12% Все аминокислоты даны в однобуквенном коде; Ас - ацетил; Асш - ацетамидометильная группа; ЕАЬХ - остаток s-аминогексановой кислоты; Сю - остаток каприновой кислоты. Пептиды с гидрофобными радикалами (рис. 18) и с разветвленной структурой в отсутствие гормона отчетливо стимулировали базальную активность АЦ в тканях крысы и моллюска. Они также стимулировали ГТФ-связывание G-белков. Сурамин (10" М), селективный ингибитор гетеротримерных G-белков, подавлял стимулирующие эффекты 24 поликатионных пептидов. Это указывает на то, что мишенями их действия являются гетеротримерные G-белки. В присутствии 10^-Ю"4 М этих пептидов стимулирующие АЦ эффекты активаторов G-белков - NaF и GppNHp снижались, но не более чем на 40 %. Разветвленные пептиды достаточно эффективно ингибировали активность АЦ, стимулированную форсколином, что указывает на их способность взаимодействовать с каталитическим сайтом АЦ. Таким образом, впервые показано, что искусственно созданные поликатионные пептиды по независимому от рецептора механизму влияют на активность компонентов АЦС и ее стимуляцию негормональными активаторами. га с 30о ю .28- < ™ 26J 24 т//1\\~ Н 1 I I 22 —»—пептид X —•— пептид XI —А— пептид XII I f 20л 18 Il6 с ' Рис. 18. Влияние пептидов с гидрофобными Сю-радикалами на базальную активность АЦ в гладких мышцах моллюска. 7 6 5 4 3 -1од[пептид], М Иеразветвленные пептиды с гидрофобными радикалами и разветвленные тетрамерные пептиды дозозависимо снижали стимуляцию АЦ и ГТФ-связывания серотонином в мышцах моллюска и изопротерснолом в мышцах крысы, осуществляемую ими через Gs-белки. Эффективность ингибирующего влияния пептидов на АЦ эффекты биогенных аминов представлена в виде значений IC50 (табл. 2). Поликатионные пептиды также снижали ингибирующие АЦ эффекты соматостатина и Ог-агониста бромкриптина в мозге и миокарде крысы и изопротеренола в мышцах моллюска, реализуемые через G>белки, причем пептид X с гидрофобными радикалами был намного эффективнее пептида XV с разветвленной структурой (рис. 19). Поскольку ингибирующее влияние поликатионных пептидов осуществляется в отношении широкого спектра гормонов в тканях различных животных, оно не является высоко специфичным и осуществляется на этапе сопряжения активированного гормоном рецептора с G-белком, а не на более поздних, пострсцепторных этапах передачи гормонального сигнала. Об этом свидетельствуют как данные об ингибировании поликатионными пептидами стимулирующего эффекта гормонов на ГТФ-связывание Gбелков, так и снижение в их присутствии аффинности связывания рецепторов с агонистами. Так аффинность агониста к р-АР в миокарде в присутствии пептида X с гидрофобными радикалами и пептида XVII с разветвленной структурой снижается (рис. 20), что выражается в повышении значений К] для изопротеренола (в контроле 47 нМ) в присутствии пептидов X и XVII до 253 и 78 нМ. В присутствии пептида X сдвиг вправо 25 кривой вытеснения изопротсренолом [ Н]-дигидроальпренолола при добавлении ГТФ практически отсутствует (рис. 20), в присутствии пептида XVII он заметно снижается. Сходные результаты получены при исследовании влияния поликатионных пептидов на связывание 1'Н)-дигидроальпренолола в скелетных мышцах крысы. Для выявления типа G-белков, на которые действуют поликатионные пептиды, был применен метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами (Reisinc, 1990) и пептидная стратегия. В мембранах, рибозилированных с помощью холерного токсина, стимулирующие ЛЦ эффекты пептидов X и XV снижались или блокировались полностью. В мембранах, обработанных коклюшным токсином, сгимулирующие эффекты пептидов повышались (рис. 2J). С-концевой пептид 385-394 Ga s дозозависимо ингибировал стимуляцию ноликатионными пептидами активности АЦ и 1ТФсвязывания. в то время как пептид 346-355 Ga,j влиял на эти эффекты в меньшей степени. Таким образом, установлено, что поликатионные пептиды с гидрофобными радикалами и с разветвленной структурой способны активировать как G,- (в большей степени), так и Gi-белки. При этом они взаимодействуют с С-концевыми сегментами Gaсубъединиц и мимикрируют действие активированного гормоном рецептора. 26 з*. 120- Б пi 100В 3 п 80 \ \ +ГТФ I so- без ГТФ V 1 40 £ 1 ю 9 8 7 6 5 4 -1од[изопротеренол), М 20- 1•с °" и 10 9 8 7 6 5 4 -1од[изопротеренол], М Рис. 20. Вытеснение |*Н|-дигидроальпреполола изопротерснолом из связывающих мест в миокарде крысы в присутствии пептида X с гидрофобными радикалами. А - контроль; Б - в присутствии 10' М пептида X. / - изопротеренол; 2 - изопротсренол совместно с ГТФ, 10' М. По вертикали специфическое связывание [,Н]-дигидроалыфено:юла, %. Рис. 21. Влияние АДФ-рибозилирования коклюшным токсином па АЦ эффекты поликатионных пептидов. а - мозг крысы. 6 - миокард крысы, в - гладкие мышцы моллюска. / - пептид X, 10 М; 2 - пептид X, 10"4 М; 3 - пептид XV, 10'5 М; 4 - пептид XV, Ю-4 М. Активность АЦ в рибозилированных коклюшным токсином мембранах, которая составляла в мозге и миокарде крысы 80.417.4 и 17.4±1.6, в мышцах моллюска 25.8+1.8 пмоль цАМФ/мип на 1 мг мембранного белка, принята за 100 %. *•/>< 0.05. 27 6. Обнаружение АЦС у инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis и изучение ее чувствительности к гормонам млекопитающих. Заключительный, шестой, этап работы был посвящен исследованию АЦС представителей одноклеточных организмов - инфузорий D. anser и Т. pyriformis. Выбор инфузорий был продиктован тем, что они сравнительно легко культивируются, а для Т. pyriformis возможна синхронизация деления клеточной культуры. Это дает возможность проследить инфузорий на различных стадиях клеточного цикла и выяснить, как влияет стадия цикла на функциональную активность АЦС. В различных культурах инфузорий D. anser базальная активность М^-зависимой АЦ составляла от 1430 до 3914 пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка, что существенно выше ее значений в тканях позвоночных. Форсколин и гуаниновые нуклеотиды - ГТФ и GppNHp стимулировали АЦ D. anser, причем их стимулирующий эффект более отчетливо выявлялся в культурах со сравнительно низкой базалыюй активностью фермента, что хорошо согласуются с данными других авторов о том, что величина АЦ эффекта тем ниже, чем выше базальная активность фермента (Pieroni et al., 1995). Исследование культур Т. pyriformis показало, что фактором, определяющим базальную активность АЦ, является стадия развития культуры. В культур&ч, имеющих 2-5, 20-30 и более 35 % делящихся клеток, базальная активность АЦ составляла 31, 228 и 747 пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка, соответственно. Таким образом, у Т. pyriformis в экспоненциальной стадии роста базальная активность АЦ значительно выше в сравнении с инфузориями в стационарной фазе, что, как можно полагать, связано с активным участием АЦС в регуляции ростовых и метаболических процессов у инфузорий в экспоненциальной фазе роста. Функциональная активность АЦ Т. pyriformis, стимулировалась катионами Mn 2f , форсколииом, гуаниновыми нуклеотидами и фторидом натрия. Стимулирующие АЦ эффекты фторида натрия, наиболее мощного активатора G-белков у позвоночных (Chabre, 1990), как и эффекты других активаторов АЦ, были отчетливо выражены в культурах инфузорий со сравнительно низкой базальной активностью АЦ, а в культурах с высокой базалыюй активностью снижались или полностью отсутствовали (рис. 22). Биогенные амины - адреналин, изопротеренол и серотонин стимулировали АЦ у D. anser (табл. 3). Наиболее эффективным среди них был серотонин - его эффект был сопоставим с таковым у позвоночных. В культурах Т. pyriformis серотонин стимулировал АЦ, адреналин ингибировал активность фермента, причем в культурах с более высокими значениями базальной активности АЦ стимулирующий эффект серотонина снижался и даже переходил в ингибирующий, а ингибирующий эффект адреналина, наоборот, усиливался (рис. 23). Изопротеренол стимулировал АЦ только в культуре с низкой базалыюй активностью. В пользу участия в этих эффектах гетеротримерных G-белков свидетельствует то, что биогенные амины также стимулировали ГТФ-связывание, а стимуляция ими ГТФсвязывания блокировалась в присутствии сурамина, ингибитора гетеротримерных Gбелков. 28 16001400- rr < л o о I 1000800- I Ш 600 i 200- < n 1200- 3L 400 0 Ш ...ЛЛЛлдпя , 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1 2 1 3 1 4 К у л ь т у р ы инфузорий Рис. 22. Влияние фторида натрия ( 1 0 " М ) на активность А Ц Т. pyriformis в культурах с различной базалыюй активностью фермента. Цифры по горизонтам - базальная активность А Ц Т. pyriformis (нмоль ц А М Ф / м и н на 1 мг белка); / - 2.8; 2 - 3 . 1 : i -18.0; 4 - 23.2; 5 - 26.5; б - 42.1; 7 - 4 3 . 0 ; 8 - 56.2: 9 62.7; 10 - 142; 11 - 347; 12 - 1259; 13 - 1470; 14 - 1644. По вертикали - активность А Ц . % (базальная активность А Ц в каждом случае принята за 100%). Таблица 3. Влияние биогенных аминов на активность А Ц инфузории D. anser. Концентрация Активность АЦ. нмоль цАМФ/мин на 1 мг белка, х ±SX гормона, М адреналин изопротеренол Серотонин Без гормона 1795+105 (100%) 22301120(100%) 1680+90(100%) 10 s 2390+165(133%) 2250±110(101%) 1550+160(92%) 10" 2570±120(143%) 2560+125 (115%) 3230+305(192%) 10* 2590±205(144%) 29001105(130%) 36501220(217%) 10' 2780±135(155%) 25001150(112%) 24401100(145%) 29 300* 250- < 200- 8 150i 100£ < 50A Б В Рис. 23. Влияние серотонина (А), адреналина (Б) и изопротсренола (В) (10 М) на активность АЦ Т. pyriformis. Цифры по горизонтали - базальная активность АЦ (пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка): / - 2.8; 2 - 18.0; 3 - 23.2; 4 - 225; 5 - 439; б - 1259. По вертикили - активность АЦ, % (базальная активность АЦ в каждом случае принята за 100 %). Обнаружение чувствительности АЦС инфузорий к лигандам АР стало отправной точкой для изучения рецепторов, связывающих эти лиганды. Показано, что антагонист РАР [ Н]-дигидроальпремолол специфически связывается с мембранами обеих инфузорий со значениями Kd (для D. anser - 13 нМ, для Т. pyriformis - 27 нМ), которые на один-два порядка ниже в сравнении с таковыми для Р-АР высших эукариот (рис. 24). Лиганды РАР по конкурентному механизму вытесняли [ Н]-дигидроальпрснолол (порядок эффективности пропранолол > изопротерснол > атенолол) как в культуре D. anser (рис. 25), так и Т. pyriformis. В присутствии ГТФ кривая конкурентного вытеснения [ Н]дигидроальпренолола изопротеренолом смещалась вправо. Следовательно, в клетках инфузорий имеются сопряженные с G-белками рецепторы, способные специфично связываться с агонистами и антагонистами Р-АР и но этому показателю сходные с р-АР высших эукариот. У D. anser стимулирующий АЦ эффект адреналина и изопрогерснола снимался б.юкаторами р-АР пропрано.юлом и атснололом (табл. 4), но был не чувствителен к блокаторам а 2 -АР. У Т. pyriformis ингибирующий эффект адреналина, наоборот, снимался антагонистами сс2-АР йохимбином и идазоксаном, но был не чувствителен к блокаторам Р-АР (табл. 4). Эти данные указывают на участие рецептора, сходного с Р-АР позвоночных, в передаче стимулирующего АЦ сигнала адреналина и изопрогерснола в клетках D. anser, и на участие рецептора, близкого по ряду свойств а 2 -АР позвоночных, в передаче ингибирующего АЦ сигнала адреналина в клетках Т. pyriformis. 30 0 20 40 60 80 [ЗН]-дигидроальпренолол, нМ 0,251 Б Dlleptus anscr а X 0,20 Tetrahymena pyriformis ш 0,15 0,10 • 0,05 0 2 4 б 8 10 12 14 1 2 з 4 s 6 Связанный [ЗН]ДГА, фмоль на мг белка Связанный [ЗН]ДГА, фмоль на мг белка Рис. 24. Связывание [ Н]-дигидроальпренолола с мембранами инфузорий. А - кривые насыщения; по оси абсцисс - концентрация [ Н]-дигидроальпренолола, нМ; по оси ординат количество специфически связанного [3Н]дигидроальпренолола, фмоль на 1 мг мембранного белка. Б, В - графики Скэтчарда; по оси абсцисс - количество специфически связанного [ Н]-дигидроальпренолола, фмоль на 1 мг мембранного белка; по оси ординат - отношение связанного меченого лиганда к свободному [3Н]-дигидроальпренололу (в случае D. anser - х 10"3; Т. pyriformis - х 10" ). 31 Рис. 25. Вытеснение лигандами АР меченого [311]-дигидроальпренолола из связывающих мест в мембранной фракции D. anser. 1 пропранолол; 2 изопротеренол; 3 - атенолол; 4 изопротеренол + ГТФ, 10"5 М. Таблица 4. Действие антагонистов АР на базальную и стимулированную адреналином и изопротсренолом активность АЦ инфузорий (пмоль цАМФ/мин на 1 мг белка). Антагонист, ю-6м Без антагониста Пропранолол Атенолол Иохимбин Идазоксан Без антагониста Пропранолол Атенолол Иохимбин Идазоксан Адреналин, 10"6М Dileptus anser 2140±120(+59) 1345±95 1005+80 (-25) 1180+125[+17] 1155±85(-14) 1575+130[+361 1400+110(+4) 2370+135 [+691 1395±95(+4) 2295+90[+651 Tetrahvmena pyriformis 17.410.8 12.3+1.2 (-29) 16.8+0.9 (-3) 11.9+0.7 [-291 15.8+1.1 (-9) 11.6+1.2 [-271 25.0+1.0 [+51 23.9±1.4(+37) 19.0±О.6(+13) 21.9+1.2 [+151 В отсутствие гормонов Изопротеренол, 1900+105 (+41) 1125+100 [+121 1465±125[+271 20651110[+481 1955+125 [+401 19.8±1.4(+14) 16.3+0.9 [-3] 17.1 ±0.8 [+81 28.611.2 [+201 24.0+1.7 [+261 В круглых скобках приведена величина стимулирующего или ингибирующего АЦ эффекта лигандов АР (в %) по отношению к базальной активности АЦ. В квадратных скобках приведена величина АЦ эффекта адреналина и изопротеренола (в %) по отношению к активности АЦ, подвергнутой воздействию антагонистов. 32 Далее была изучена чувствительность АЦС инфузорий к пептидным гормонам млекопитающих - релаксину и глюкагону, рецепторы которых в тканях позвоночных сопряжены с АЦ в основном через Gs-белок. Релаксин дозозависимо стимулировал активность АЦ и ГТФ-связывание у D. anser и Т. pyriformis (рис. 26). Сурамин, ингибитор гетеротримерных G-белков, блокировал стимулирующие эффекты релаксина, что указывает на участие в них гетеротримерных G-белков. Глюкагон в концентрациях 109—10-7 М отчетливо стимулировал АЦ в культурах D. anser и Т. pyriformis. Величина АЦ эффекта глюкагона определялась уровнем базальной активности АЦ Т. pyriformis - в культурах с высокой базальной активностью фермента чувствительность АЦС к глюкагону была снижена (рис. 27). В культурах со сравнительно низкой базальной активностью АЦ эффект глюкагона усиливался в присутствии GppNHp, негидролизуемого аналога ГТФ, что свидетельствует о кооперативности стимуляции АЦ гормоном и гуаниновыми нуклеотидами и указывает на функциональное сопряжение активированного глюкагоном рецептора с Gs-белком у инфузорий Т. pyriformis. Таким образом, у инфузорий D. anser и Т. pyriformis впервые выявлена и охарактеризована АЦС, чувствительная к биогенным аминам и пептидным гормонам млекопитающих, которая включает гетеротримерные G-белки и сходна по ряду свойств с гормоночувствительной АЦС позвоночных. 100 А 2 / \ г? 80 =г *-/L\ _ < 60 к § 40 20 5 /С^^ о- &^ Oft. /j/г/—f—X_iv* Л7 | - Z U г? к 1s ш м 2 S \ / % • 1 10 • 1 • > • 1 9 8 7 -1од[релаксин], М • 140 120 и 100 80 е 6 t 40 s3 20 sLs' ° S о >. 5 -20-^ £ ° Б • г 10 • 1 * • 1 • 1 • 9 8 7 -1од[релаксин], М Рис. 26. Стимуляция релаксином акгивности АЦ (А) и ГТФ-связывания G-белков (Б) в культурах инфузорий. 1 - D. anser, 2-Т. pyriformis. 33 400 ] Л-. 350 ^ 300- < 250 G 200о I 150 X -^. !^, ~! ._! I^-. J-, A rh | ioo « so 12345678910111213 Культуры инфузорий Рис. 27. Влияние глюкагона ( Ю " М ) на активность А Ц в культурах Т. pyriformis с различной базалыюй активностью фермента. Цифры по горизонтали - базальная активность А Ц (пмоль цАМФ/мин на I мг белка): / — 3 . 1 ; 2 - 14.1; 3- 18.0; 4-26.5; 5 - 4 2 . 1 ; 6 - 4 3 . 0 ; 7 - 4 6 . 3 ; « 62.7; 9 - 6 6 . 6 ; / 0 - 142; / / - 2 2 5 ; 12439; 13 - 1259. Но вертикали - активность А Ц . % (базальная активность в каждом случае-100%). Нами впервые была выявлена активность эффекторного звена АЦС - фермента протеинкиназы А в клеточных культурах инфузорий D. anser и Т. pyriformis, которая в отсутствие цАМФ составляла 446 и 112, в присутствии цАМФ - 685 и 254 пмоль включенного [ Р]-фосфата за 1 мин на 1 мг белка (отношение активностей протеинкиназы А в отсутствие цАМФ к таковой в присутствии цАМФ у D. anser и Т. pyriformis составило 0.65 и 0.44). У D. anser фермент стимулировался биогенными аминами (серотонином и изопротерено.юм) и глюкагоном, причем стимулирующее протеинкиназу А действие глюкагона было более выраженным. У Т. pyriformis активность протеинкиназы А отчетливо стимулировалась только глюкагоном. Действие гормонов на активность протеинкиназы А и АЦ было однонаправленным, что указывает на функциональную связь между этими ферментами у инфузорий, как это происходит и у высших эукариот. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате комплекса проведенных исследований получены принципиально новые данные и расширены современные представления, касающиеся функционирования гормоночувствитсльной АЦС в клетках животных различного филогенетического уровня и молекулярных механизмов функционального взаимодействия рецепторов с гетсротримерными G-белками, как ключевого этапа передачи гормонального сигнала, осуществляемого через АЦС. С помощью сравнительного теоретического анализа в структуре рецепторов серпантинного типа выявлены молекулярные детерминанты, которые представляют собой проксимальные к мембране участки цитонлазматических петель, в первую очередь третьей цитоплазматической петли, и ответственны за взаимодействие активированного гормоном рецептора с С-концсвым сегментом сс-субъединицы G-белка. Характерными особенностями этих участков является наличие в их структуре кластеров положительно заряженных аминокислот и способность к образованию амфипатических а-спиралей. Полученные данные могут быть использованы для направленного поиска в молекулах 34 рецепторов и G-белков участков, функционально важных для передачи гормонального сигнала через АЦС, что и было продемонстрировано в наших экспериментах по изучению АЦС, чувствительной к биогенным аминам и пептидным гормонам. Для исследования молекулярных механизмов функционального сопряжения компонентов АЦС нами была разработана и применена пептидная стратегия, представляющая собой интенсивно развивающуюся в последние годы область нанобиотехнологии. Эта стратегия заключалась в синтезе пептидов, которые по своей первичной структуре соответствуют участкам рецепторов и G-белков, вовлеченным во взаимодействие между ними. С этой целью впервые были синтезированы пептиды, которые соответствуют по первичной структуре выявленным с помощью теоретического анализа участкам сигнальных белков - С-ЦПЗ рецептора релаксина LGR7 и С-концевым сегментам а-субъединиц Gs- и Gj-белков. Показано, что синтетические пептиды действуют на функциональную активность АЦС с высокой селективностью. Это выражается в том, что они эффективны только в отношении тех сигнальных путей, которые осуществляются с участием сигнальных белков, производными которых эти пептиды являются. Обнаружено, что пептиды, производные третьей цитоплазматической петли релаксинового рецептора LGR7, способны активировать пострецепторные звенья АЦС по независимому от рецептора механизму вследствие их прямого взаимодействия с Gs-белком. Применение таких пептидов открывает новые перспективы для поиска и разработки исгормональных регуляторов сигнальных систем, которые действуют независимо от рецептора и с высокой селективностью активируют пострецепторные звенья сопряженных с G-белками сигнальных каскадов. С помощью пептидной стратегии и широкого набора функциональных тестов впервые установлены два различных АЦ сигнальных механизма действия релаксина, которые являются ткане- и видоспецифичными. Первый из них, трехкомпонентный, включает рецептор серпантинного типа LGR7, Gs-белок и фермент АЦ, в то время как второй, шестикомпонентный, включает более сложную цепь сигнальных белков: рецептор тирозинкиназного типа => С-белок (Gpy) => фосфатидилинозитол-3-киназу => протеинкиназу СС, => Gs-белок => АЦ. Трехкомпонентный АЦ сигнальный механизм функционирует в сердце и мозге крыс, шестикомпонентный - в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea. Полученные данные свидетельствуют в пользу множественности АЦ сигнальных путей действия релаксина, что важно при разработке новых подходов для его практического применения в медицине. Иллюстрацией успешного применения пептидной стратегии стало использование Сконцевых Ga s - и Gaj-пептидов для установления типа G-белков, участвующих в передаче сигнала, генерируемого биогенными аминами, в нервной и мышечной тканях моллюска A. cygnea. Показано, что стимулирующие АЦ эффекты октопамина и дофамина в ганглиях моллюска Л. cygnea реализуются через рецепторы, функционально сопряженные с Gs-белком, в то время как серотонин в ганглиях одновременно активирует как Gs-, так и Gj-белки. В мышцах моллюска эффекты этих гормонов осуществляются через сопряженные с Gs-белками рецепторы. Совокупность собственных экспериментальных данных и сведений литературы позволила сделать вывод о том, что впервые выявленная в ганглиях моллюска A. cygnea АЦС сходна по ряду своих показателей с АЦС высших позвоночных. В ходе исследования состояния АЦС при стрептозотоциновом диабете как 1-го, так и 2-го типов у крыс выявлено значительное ослабление чувствительности АЦС в 35 скелетных мышцах и миокарде диабетических животных к действию биогенных аминов (катехоламинов, серотонину), которые в наибольшей степени проявляются в случае АЦС, сопряженной с С-белками. Одной из причин нарушений функционирования АЦС при диабете может быть ослабление функционального сопряжения рецепторов и АЦ с G,- и, в меньшей степени, Gs-белками. Выявлена тканевая специфичность изменений в активности Gs-сопряженной АЦС при стрептозотоциновом диабете 2-го типа, заключающаяся в снижении ее чувствительности к гормонам в миокарде диабетических крыс при отсутствии заметных изменений в мозге. Полученные при исследовании стрептозотоцинового диабета данные о снижении функциональной активности АЦС и ослаблении функционального взаимодействия проксимальных звеньев этой системы рецептора и G-белка в мышечных тканях подтверждают основные положения высказанной нами ранее концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринной патологии (Перцева, Шпаков, 2004), которая устанавливает причинно-следственные связи между нарушениями, возникающими в гормональных сигнальных системах, и развитием эндокринных и гормон-зависимых заболеваний. Выявление структурных особенностей взаимодействующих с G-белками участков рецепторов, таких как наличие поликатионных мотивов и способность к образованию спиралей, стало отправной точкой для создания серии синтетических пептидов, представляющих собой поликатионные амфипатические спирали и мимикрирующих, таким образом, функционально важные для взаимодействия с G-белками участки рецепторов. Показано, что впервые синтезированные нами поликатионные пептиды обладают способностью регулировать компоненты АЦС в клетках позвоночных и беспозвоночных, причем их действие направлено в основном на гетсротримерные Gs- и G.-белки и их функциональное сопряжение с рецептором. Создание искусственных негормональных регуляторов АЦС на основе поликатионных пептидов линейной и разветвленной структуры не только открывает новое направление для изучения фундаментальных основ взаимодействия между сигнальными белками, но и в будущем позволит разработать функциональные зонды, способные селективно по независимому от рецептора механизму регулировать и модулировать активность гормональных сигнальных систем, сопряженных с G-бслками. В результате проведенного исследования с использованием эволюционного подхода и широкого набора биохимических методов нами была впервые выявлена и охарактеризована АЦС в клеточных культурах двух видов одноклеточных эукариот свободноживущих инфузорий D. anser и Т. pyriformis. Показано, что АЦ инфузорий, как и АЦ высших эукариот, чувствительна к действию как негормональных агентов, так и гормонов высших позвоночных - глюкагона и биогенных аминов, действующих через рецепторы серпантинного типа, а также релаксина, способного действовать на АЦ как через рецепторы серпантинного, так и тирозинкиназного типа. Величина эффекта негормональных и гормональных агентов в значительной степени определяется уровнем базальной активности АЦ в культуре инфузорий - чем она выше, тем слабее выражен эффект. Специфичность действия биогенных аминов на АЦ инфузорий доказывается блокированием их АЦ эффектов антагонистами адренергических и серотониновых рецепторов. С помощью фармакологических подходов у инфузорий выявлены АР, которые специфично связываются с лигандами Р-АР. Обнаружено также, что биогенные амины стимулируют ГТФ-связывание гетеротримерных G-белков. В клетках инфузорий нами впервые обнаружена активность протеинкиназы А и исследована ее регуляция 36 гормонами. Действие гормонов на нротеинкиназу А и АЦ является однонаправленным, что указывает на функциональную связь между ними, как это наблюдается в клетках высших эукариот. Совокупность полученных данных указывают на присутствие в культурах инфузорий функционально активной гормоночувствительной АЦС, включающей АР-подобные рецепторы, гетеротримерные G-белки и фермент АЦ, который через изменение внутриклеточного уровня цАМФ регулирует активность протеинкиназы А, эффекторного звена АЦ-цАМФ-системы. Таким образом, данные, полученные нами в ходе экспериментального исследования АЦС инфузорий, а также результаты проведенного нами сравнительного теоретического анализа первичных структур сигнальных белков, потенциальных компонентов АЦС низших эукариот, позволяют более полно представить картину эволюции гормоночувствительных АЦС эукариот и доказывают, что сложный ансамбль универсальных молекулярных детерминант, ответственных за функциональное взаимодействие между сигнальными белками, компонентами АЦС, сложился на самых ранних этапах эволюции и, в общих чертах, сохранился до уровня высших позвоночных. При этом ключевой этап передачи гормонального сигнала через АЦС - функциональное взаимодействие активированного лигапдом рецептора с гетеротримерным G-белком у животных различного филогенетического уровня не претерпел значительных изменений. Именно на этом этапе определяются: (1) направленность (векторность) сигнального импульса, в основе которой лежит селективное взаимодействие рецептора с определенным типом G-белка, через который осуществляется регуляция конкретной эффекторной системы клетки; (2) интенсивность сигнального импульса, которая повышается на уровне сопряжения G-белка с рецептором в десятки и сотни раз. На этапе функционального сопряжения рецептора с G-белком возможна регуляция активности сигнальной системы по независимому от рецептора механизму, причем в качестве таких негормональных регуляторов могут выступать как вещества природного происхождения (пептидные токсины), так и искусственно созданные пептиды, мимикрирующие участки молекул рецепторов и G-бслков, функционально важные для их взаимодействия. Различные классы таких пептидов были нами синтезированы и успешно применены для регуляции функциональной активности АЦС в тканях различных видов животных. ВЫВОДЫ. 1. Основные молекулярные детерминанты рецепторов серпантинного типа, ответственные за взаимодействие с G-белками, локализованы в проксимальных к мембране участках их цитоплазматических петель и характеризуются наличием кластеров положительно заряженных аминокислот и способностью формировать спиральные структуры. 2. Синтетические пептиды, соответствующие молекулярным детерминантам в асубъединицах G-белков и рецепторах, которые ответственны за их функциональное сопряжение, способны с высокой эффективностью и селективностью по конкурентному механизму прерывать проведение гормонального сигнала, осуществляемого через те сигнальные белки, производными которых они являются. 3. Молекулярные механизмы стимулирующего АЦ действия релаксина являются тканс- и видоспецифичными. В сердце и мозге крысы релаксин осуществляет свое действие через трехкомпонентную АЦС, включающую рецептор LGR7 серпантинного типа, Gs-белок и АЦ, в скелетных мышцах крысы и гладких мышцах моллюска A. cygnea - через 37 шестикомпонентный АЦ сигнальный механизм, включающий рецептор тирозинкиназного типа, Ру-димср Gj-белка, фосфатидилинозитол-3-киназу, протеинкиназу С£, Gj-белок и АЦ. 4. В условиях стрептозотоцинового диабета 1-го и 2-го типов у крыс наблюдается ослабление функционального сопряжения активированного гормоном рецептора с Gбелком и АЦ. В большей степени нарушаются функции Gj-белков, что приводит к подавлению ингибирующего влияния биогенных аминов и соматостатина на АЦ. 5. Синтетические поликатионные пептиды, мимикрирующие взаимодействующие с Gбелками участки рецепторов, активируют G-белки и негативно влияют на проведение гормонального сигнала через АЦС. Эффективность и молекулярные механизмы действия этих пептидов на АЦС определяются распределением положительно заряженных аминокислот в спирали, наличием гидрофобных радикалов и степенью разветвленности. 6. В клеточных культурах инфузорий Dileplus anser и Tetrahymena pyriformis обнаружена и охарактеризована чувствительная к гормонам млекопитающих АЦС, сопряженная с гетеротримерными G-белками и сходная по ряду признаков с гормоночувствительной АЦС позвоночных, что свидетельствует о высокой консервативности АЦС у представителей низших и высших эукариот и ее раннем формировании в эволюции. Основные публикации по теме диссертации. 1. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Хемосигнальные системы одноклеточных эукариот и бактерий как предшественники гормонокомпетентных систем высших животных // Журн. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 454-474. 2. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Структурно-функциональная характеристика ГТФсвязывающих белков беспозвоночных животных // Журн. эвол. биохим. физиол. 1993. Т. 29. С. 635-653. 3. Pertseva M.N., Shpakov A.O. On the prokaryotic genesis of hormonal signalling systems of eukaryotes // In "Evolutionary Biochemistry and Related Areas of Physicochemical Biology", Eds. by B.Poglazov et a!., Bach Inst, of Biochemistry and ANK.O, Moscow. 1995. P. 509-519. 4. Shpakov A.O. Molecular basis of the functional coupling of receptors to GTP-binding proteins // Membr. Cell Biol. 1996. V. 9. P. 467-488. 5. Шпаков А.О. Гомология первичной структуры третьих цитоплазматических доменов рецепторов родопсинового типа и цитоплазматического хвоста f5субъединицы инсулинового рецептора // Цитология. 1996. Т. 38. С. 1179-1190. 6. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты рецепторов и ГТФ-связывающих белков, определяющие специфичность взаимодействий между ними // Журн. эвол. биохим. физиол. 1996. Т. 32. С. 488-511. 7. Шпаков А.О. Структурные элементы молекул ГТФ-связывающих белков и эффекторов, опосредующие сопряжение между ними // Укр. биохим. журнал. 1997. Т. 69. С. 3-20. 8. Шпаков Л.О., Перцева М.Н. Молекулярные основы функционального сопряжения белков - компонентов инсулиновой сигнальной системы // Усп. биол. химии. 1999. Т. 39. С. 141-186. 38 9. Шпаков А.О., Корольков В.И., Власова Е.Н., Афонина М.П., Власов Г.П. Влияние синтетических катионных пептидов на активацию аденилатциклазной сигнальной системы биогенными аминами в мышечных тканях моллюсков и крыс // Цитология. 2001. Т. 43. С. 483-490. 10. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова Л.Л., Плеснева С.А., Успенская З.И., Перцева М.Н. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileptus anser II Цитология. 2002. Т. 44. С. 1129-1134. 11. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Консервативность инсулиновой сигнальной системы в эволюции беспозвоночных и позвоночных животных // Жури. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 430-441. 12. Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с гетеротримерными G-белками // Цитология. 2002. Т. 44. С. 242-258. 13. Шпаков А.О. Роль ру-димеров ГТФ-связывающих белков в процессах передачи гормонального сигнала // Журн. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 512-529. 14. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system // Сотр. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. P. 11-36. 15. Деркач К.В., Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Ирлина И.С., Плеснева С.А., Перцева МП. Регуляция аденилатциклазной системы инфузории Tetrahymena pyriformis гормональными и нсгормональными агентами и ее зависимость от уровня базальной активности аденилатциклазы // Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 39. С. 332-338. 16. Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислотных остатков цитоплазматических петель рецепторов серпантинного типа в процессе передачи гормонального сигнала // Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. Т. 38. С. 205-217. 17. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власова Е.Н., Корольков В.И., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Докл. РАН. 2003. Т. 389. С. 127-130. 18. Шпаков А.О., Деркач К.В., Перцева М.Н. Гормональные системы низших эукариот// Цитология. 2003. Т. 45. С. 223-234. 19. Шпаков А.О., Деркач К.В., Успенская З.И., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Регуляция биогенными аминами и пептидными гормонами активности аденилатциклазы и протеинкиназы А у инфузорий Dileptus anser и Tetrahymena pyriformis II Докл. РАН. 2003. Т. 378. С. 275-277. 20. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Авдеева Е.В., Воробьев В.И., Власов Г.П. Молекулярные механизмы действия звездообразных поликатионных пептидов, содержащих последовательность 48-60 ТАТ-белка ВИЧ-1, на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Цитология. 2004. Т. 46. С. 1011-1022. 21. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Воробьев В.И., Авдеева Е.В., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Чубей Н.М., Перцева М.Н., Власов Г.П. Разобщающее действие катионных пептидов, содержащих гидрофобные радикалы, на функциональное сопряжение рецепторов серпантинного типа с ГТФ-связывающими белками // Цитология. 2004. Т. 46. С. 268-276. 39 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Корольков В.И., Перцева М.Н., Власов Г.П. Использование С-копцевых пептидов а-субъединиц Gбелков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков // Биол. мембраны. 2004. Т. 21. С. 441-450. Шпаков А.О., Деркач К.В., Успенская З.И., Шпакова Е.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы действия лигандов адренергических рецепторов высших эукариот на функциональную активность компонентов аденилатциклазной сигнальной системы инфузорий Dileptus anser и Telrahymena pyriformis II Цитология. 2004. Т. 46. С. 317-325. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы СС, в аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков // Бюл. экспер. биол. мед. 2004. Т. 138. С. 420-423. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Русаков Ю.И., Перцева М.Н. Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonla cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия. 2004. Т. 21. С. 250-259. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам // Нейрохимия. 2004. Т. 21. С. 190-197. Shipilov V.N., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I. Plciotropic action of insulin-like peptides of moWusk Anodonta cygnea II Ann.N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1040. P. 464-465. Shpakov A.O, Korol'kov V.I., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A., Pertseva M.N. Effects of the C-terminal peptide of the a s subunit of the G protein on the regulation of adenylyl cyclase and protein kinase A activities by biogenic amines and glucagon in mollusk and rat muscles //Neurosci. Behav. Physiol. 2005. V. 35. P. 177-186. Shpakov A.O, Pertseva M.N, Kuznetsova L.A, Plesneva S.A. A novel, adenylate cyclase, signaling mechanism of relaxin H2 action // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1041. P. 305-307. Shpakov A.O., Shipilov V.N., Bondareva V.M. Sensitivity of adenylyl cyclase signaling system of the mollusk A. cygnea ganglions to serotonin and adrenergic agonists // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005. V. 1040. P. 466-468. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власов Г.П. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с G-белками // Докл. РАН. 2005. Т. 405. С. 270-273. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Гурьянов И.А., Перцева М.Н. Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Цитология. 2005. Т. 47. С. 540-548. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Шипилов В.Н., Плеснева С.А., Бондарева В.М., Перцева М.Н. Функциональная характеристика регулируемой октопамином аденилатциклазной сигнальной системы в нервной ткани моллюска Anodonta cygnea //Нейрохимия. 2005.Т. 22. С. 102-109. Шпаков А.О., Перцева М.Н., Гурьянов И.А., Власов Г.П. Влияние пептидов, производных третьей цитоплазматической петли релаксинового рецептора 1 типа, на 40 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. стимуляцию релаксином GTP-связывающей активности G-белков // Биол. мембраны. 2005. Т. 22. С. 435-442. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы регулягорного действия биогенных аминов на функциональную активность адснилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea II Докл. РАН. 2005. Т. 401. С. 829-832. Шпаков А.О., Перцева М.Н. Использование пептидной стратегии для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку // Журн. эвол. биохим. физиол. 2005. Т. 41. С. 389-403. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. мед. 2005. Т. 140. С. 286-290. Pertseva M., Shpakov A., Kuznetsova L., Plesneva S., Omeljaniuk E. Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action: similarities and differences // Cell Biol. Int. 2006. V. 30. P. 533-540. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Шпакова Е.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Регуляция функциональной активности чувствительной к релаксину аденилатциклазы пептидами, производными релаксинового рецептора LGR7 // Докл. РАН. 2006. Т. 407. С. 835-838. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация сопряженных с Gбелками сигнальных систем амебы Dictyostelium discoideum II Журн. эвол. биохим. физиол. 2006. Т. 42. С. 426-444. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с рецепторами серпантинного типа и гстеротримерными G-белками в тканях крыс // Журн. эвол. биохим. физиол. 2006. Т. 42. С. 321-327. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Шпакова Е.А., Власов ГЛ., Перцева М.Н. Исследование молекулярных механизмов действия релаксина на аденилатциклазную сигнальную систему с применением синтетических пептидов, производных релаксинового рецептора LGR7 // Рос. физиол. журн. 2006. Т. 92. С. 521-535. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Бондарева В.М., Гурьянов И.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Снижение функциональной активности G-белков, компонентов гормоночувствителыюй аденилатциклазной сигнальной системы, при экспериментальном диабете 2-го типа // Бюл. экспер. биол. мед. 2006. Т. 142. С. 641645. Shpakov A.O., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Kolychev A.P., Bondareva V.M., Chistyakova O.V., Pertseva M.N. Functional defects in adenylyl cyclase signaling mechanisms of insulin and relaxin action in rat skeletal muscles in condition of streptozotocin type 1 diabetes // Central Eur. J. Biol. 2006. V. 1. P. 530-544. Шпаков А.О. Рецепторы серпантинного типа и гетеротримерные G-белки дрожжевых грибов: структурно-функциональная организация и молекулярные механизмы действия // Журн. эвол. биохим. физиол. 2007. Т. 43. С. 3-23.
