seminar050504

Установившееся представление состоит в том, что в соответствии с кривой
оксигенации миоглобин (Mb) связывает O2 с высоким сродством, когда поступление его с
кровью достаточно для функционирования цепей переноса электрона, и отщепляет его
при падении парциального давления O2 (р02) ниже критического уровня в периоды, когда
нарушается нормальный кровоток во время мышечных сокращений. Особенно велика
концентрация Mb в мышцах морских млекопитающих, ныряющих на долгое время в
поисках пищи. Поскольку у наземных животных, как показывают расчеты, запасенного O2
хватает всего на один цикл сокращения (~ 6 сек), развита также гипотеза, что Mb
облегчает диффузию O2 в клетке. Aвторы многих экспериментальных и теоретических
работ на эту тему считают, что именно внутриклеточный перенос O2 из сарколеммы к
митохондриям (МХ), а не его депонирование, является основной функцией Mb в мышцах.
Заметим, что оба механизма являются чисто физическими, не предполагающими
взаимодействия Mb с митохондриями (МХ), другими клеточными структурами или
метаболитами.
В последние годы эти представления о механизмах функционирования Mb
испытывают настоящий кризис. Ревизии подверглась и сама функция Mb - переносить O2
- после сообщения о том, что трансгенные мыши с “нокаутированным” геном,
ответственным за экспрессию Mb, не отличаются от обычных особей по стандартным
физиологическим тестам. Возник законный вопрос: нужен ли вообще Mb, а если да, то для
чего?. Выяснение механизма функционирования Mb важно не только как
фундаментальная проблема молекулярной биологии (биохимии), но и весьма актуально в
прикладном аспекте при создании наилучших условий в плане снабжения кислородом для
выращивания клеточных культур и моделирование этих процессов в установках,
содержащих клетки, способные экспрессировать Mb.
В своей работе мы спектроскопически изучали кинетику отщепления O2 от MbO2 в
присутствии дышащих МХ. Использовали нативные, разобщенные с помощью FCCP и
свежезамороженные МХ. Опыты проводились в двух вариантах: в первом МХ были
отделены от раствора белка полупроницаемой пленкой, способной пропускать только
низкомолекулярные вещества, а во втором –непосредственно в смеси MbO2 с МХ.
Изучали зависимость скорости дезоксигенации от концентрации MbO2 и МХ, а также
влияние на скорость реакции общего заряда миоглобина (нативный и
карбоксиметилированный Mb кашалота).
Показано, что отщепление O2 от MbO2 при физиологических p02 возможно лишь
при непосредственном контакте его с MХ; при этом скорость реакции не зависит от
концентрации белка (нулевой порядок по MbO2 в отличие от первого порядка реакции в
отсутствие МХ) и полностью совпадает со скоростью потребления O2 митохондриями в
тех же условиях по данным полярографии. Очевидно, что механизм дезоксигенации MbO2
включает его взаимодействие с митохондриальной мембраной, вследствие которого
сродство Mb к O2 уменьшается в несколько раз, что соответствует сдвигу кривой
диссоциации Mb к более высоким р02. По аналогии с регуляцией сродства Hb к лиганду
ДФГ, протонами и др. сродство Mb к O2 регулируется его взаимодействием с МХ,
состояние которых полностью определяет скорость отщепления O2 от миоглобина.