микрофлюидные чипы для исследований биологических проб

МИКРОФЛЮИДНЫЕ ЧИПЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОБ МЕТОДАМИ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ И СПЕКТРОСКОПИИ
А.А. Евстрапов *1,2,3, А.Л. Буляница1, Т.А. Лукашенко1, Г.Е. Рудницкая1, А.С. Букатин1,3
1
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
Санкт-Петербургский Государственный Университет Информационных Технологий,
Механики и Оптики
3
Санкт-Петербургский Академический университет - научно-образовательный центр
нанотехнологий РАН
*
тел. 8 (921) 630-95-95, an_evs@mail.ru
2
Созданы микрофлюидные чипы для исследований биологических проб.
Продемонстрированы методики электрофоретического анализа биопроб при
использовании детектора лазер-индуцированной флуоресценции. Разработаны
экспериментальные образцы микрофлюидных чипов для исследований клеток
методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Введение.
Перспективным
направлением
развития
аналитического
приборостроения является разработка и создание систем на основе микрочиповых
устройств, в том числе - микрофлюидных чипов (МФЧ). Такие системы, получившие
название «lab on a chip», обладают преимуществами по сравнению с макро-аналогами:
сверхмалый расход реагентов и пробы; высокая чувствительность определения
компонентов пробы и быстродействие; компактность и низкое энергопотребление и т.д.
В МФЧ основные стадии анализа (загрузка, транспортировка пробы и реагентов,
фильтрация и концентрирование пробы, химические реакции, разделение продуктов,
детектирование аналита и т.д.) можно реализовать на одной, компактной подложке.
МФЧ востребованы как современный аналитический инструмент при научных
исследованиях, в биотехнологии, медицине, криминалистике, экологии и т.д. [1-3]. За
рубежом по микроаналитическим системам и смежным направлениям издается
значительное число монографий и книг, проводятся международные научные
конференции и семинары имеются многочисленные публикации в рейтинговых
журналах. Но, на текущий момент времени, только лишь немногие фирмы в мире
производят коммерческие приборы на основе МФЧ для анализа биопроб, среди
которых следует отметить Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Shimadzu
Corp.
В докладе приведены результаты работ по созданию МФЧ для исследований
биологических проб методами оптической микроскопии и спектроскопии.
1. Микрофлюидные чипы для электрофоретического разделения проб.
Одним из первых аналитических методов, реализованных на МФЧ, был метод
капиллярного электрофореза [4]. В настоящее время наиболее развиты
электрофоретические и электрохроматографические методы разделения пробы на
МФЧ, которые применяются: для экспресс-анализа ДНК и РНК [1-3], сиквенса ДНК [5],
анализа белков [6], неорганических и органических веществ [7]; иммунного анализа [8].
Создаются интегрированные микрофлюидные системы, в которых совмещены сразу
несколько функциональных устройств и модулей. Но такая интеграция имеет свои
преимущества и недостатки, а в некоторых случаях нецелесообразна, так как
существенно увеличивает стоимость микрочипа.
При создании МФЧ мы руководствовались принципами получения
относительно недорого устройства, позволяющего обеспечить ввод и дозирование
181
пробы, по крайней мере, двух разных объемов для электрофоретического разделения
компонентов пробы с детектированием методом лазер-индуцированной флуоресценции
(ЛИФ). Поэтому в качестве материала МФЧ было выбрано недорогое стекло марки К8.
На рис. 1а представлены фотографии экспериментальных образцов МФЧ с
одноканальной топологией, которые были использованы в исследованиях. МФЧ
представляет собой две стеклянные пластины, герметично соединенные между собой
путем термического связывания или склейкой полимерными композитами [9]. В одной
из пластин методом фотолитографии и кислотного травления сформирована сеть
каналов для ввода, дозирования и разделения пробы на компоненты. В этой же
пластине просверлены отверстия, выполняющие функции микрососудов для пробы и
буфера. Другая пластина является защитной и обеспечивает образование герметичных
каналов. Ширина каналов микрочипа 60 мкм, глубина 15 мкм, длина сепарационного
канала 38 мм. Изготовление микроканалов чипа осуществлялось на ЗАО «Светланаполупроводники» (СПб), сборка и герметизация чипа – в ИАП РАН.
2. Детектирование компонентов пробы. При реализации любой аналитической
методики в микрочиповом формате особое внимание уделяется методу детектирования
аналита. Наиболее привлекательным является использование методов анализа без
применения специальных меток и красителей. Но такой подход в ряде случаев
приводит к низкой чувствительности определения компонентов пробы. Особенностью
МФЧ являются малые объемы исследуемой пробы и, следовательно, низкие
информативные сигналы. Это обуславливает применение высокочувствительных
методов и систем детектирования в МФЧ [10], в том числе: ЛИФ; электрохимического
детектирования; хемилюминесценции; масс-спектрометрии; интерферометрии и
рефрактометрии и др. Методы ЛИФ и хемилюминесценции считаются наиболее
чувствительными методами, так как позволяют регистрировать сигнал от единичных
молекул.
Разработанный в ИАП РАН прототип микрофлюидной аналитической системы
состоит из аналитического блока, прецизионного высоковольтного источника и
персонального компьютера, обеспечивающего функционирование системы (рис. 1 б). В
аналитическом блоке расположен детектор ЛИФ (длина волны возбуждения: 473 нм,
мощность лазера 20 мВт, регистрируемый диапазон: 520-650 нм).
а
б
Рисунок 1. Комплект микрофлюидных чипов для электрофоретического разделения
пробы (а) и прототип микрофлюидной аналитической системы (б)
В этом же блоке находятся: микропроцессорное устройство; модуль установки и
фиксации микрочипа; интерфейсы связи с компьютером и источником высокого
напряжения и т.д. Высоковольтный источник имеет два независимых канала
регулировки напряжения. Спектральные характеристики детектора ЛИФ обеспечивают
регистрацию аналита, меченного флуоресцентой меткой – Fluorescein Isothyocyanate
(FITC).
182
1. Экспериментальные исследования
1.1. Разделение одноцепочечных и двухцепочечных фрагментов ДНК
Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях
связано с генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию,
что определяет необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК
для выбора эффективной методики лечения. В рамках исследований по данному
направлению в ИАП РАН созданы и апробированы методики электрофоретического
разделения одноцепочечных фрагментов ДНК (на примере синтетических
олигонуклеотидов – рис. 2а) и двухцепочечных фрагментов (на примере маркеров
молекулярного веса ДНК – рис. 2б).
а
б
Рисунок 2. Электрофоретическое разделение синтетических олигонуклеотидов (а) и
маркеров молекулярного веса ДНК (б) на МФЧ.
1.2 Определение сульфадиазина. Лекарственные соединения, как и многие
физиологически активные вещества, способны оказывать как положительное, так и
отрицательное воздействие на организм в зависимости от дозы и длительности
воздействия. В связи с широким применением высокоэффективных лекарств в
различных сферах деятельности (например, в ветеринарии) в воде и пищевых
продуктах могут накапливаться остатки этих препаратов, в количествах, превышающих
безопасный уровень. Поэтому разработка методов количественного и качественного
анализов лекарственных препаратов является важной задачей. Нами была
продемонстрирована возможность определения сульфамидных препаратов методом
электрофореза на МФЧ.
Меченные FITC производные сульфадиазина (SDZ) были получены на Кафедре
химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. При
проведении электрофореза пробы, содержащей SDZ-FITC в разных концентрациях,
использовали борат-фосфатную буферную систему рН 8.9 с добавками
додецилсульфата натрия и ацетонитрила. На рисунке 3а представлены примеры
электрофореграмм, полученных для двух концентраций SDZ-FITC.
1.1. Анализ аминокислот на микрочипе. Разработка методов количественного и
качественного анализов аминокислот (АК) является важной задачей многих отраслей
науки: медицины, биохимии, микробиологии, пищевой промышленности,
фармакологии и сельского хозяйства.
183
б
Аналитический сигнал, отн.ед.флуорю
а
1,5 мкг/л
0,375 мкг/мл
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
50
100
150
200
Время, cек
Рисунок 3 - Электрофореграммы для проб, содержащих 1,5 и 0,375 мкг/мл SDZ-FITC
(а) и разделение трех аминокислот методом электрофореза на МФЧ (б)
Аминокислоты – важнейшие компоненты продуктов растительного и животного
происхождения, играющие важную роль при обмене веществ в организмах, в
биохимическом синтезе белков и пептидов, витаминов, гормонов, ферментов и т. д.
Аминокислотный анализ в клинической диагностике применяется для обнаружения
наследственных заболеваний и нарушений обмена веществ. Свободные аминокислоты
и короткие пептиды, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное
функциональное значение. В ряде случаев они могут выступать в роли молекулярных
маркеров заболеваний. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими
нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания.
В ИАП РАН проводятся работы по анализу меченных FITC меткой аминокислот
методом электрофореза на МФЧ. Показано, что выбор состава буфера играет ключевую
роль в повышении эффективности и быстродействия при разделении смеси АК. На рис.
3б представлен результат разделения трех аминокислот (аргинин, серин, аланин) в
50мМ фосфатном буферном растворе рН 9.0.
2.
МФЧ для исследований биологических объектов. Во многих случаях
анализируемая проба имеет сложный состав, поэтому особое внимание уделяется
стадии подготовки пробы. Например, при анализе крови требуется осуществить
многоэтапную пробоподготовку, отделив анализируемые частицы (клетки) от других
компонентов. Микрофлюидные устройства позволяют реализовать разнообразные
методики и техники разделения пробы [11,12], например, методы диэлектрофореза,
оптофореза, магнитофореза, мембранной фильтрации и т.п. Изучение клеточных
структур в естественном состоянии позволяет получить новые знания о процессах,
происходящих в клетках, определить способы воздействия на клетки, приводящие к
тому или иному результату. Это является важным при создании эффективных
лекарственных средств и разработке новых методов лечения заболеваний.
Для проведения исследований с биологическими объектами были созданы
разные типы МФЧ: микрочип с топологией типа «ступенька» для фильтрации и
удержания объектов размерами более 5 мкм; микрочип с наноканалами – для объектов
размерами более 0.5 мкм [13] и другие. Использование оптически прозрачных
материалов в конструкции микрочипов дает возможность применять методы
оптической микроскопии и спектроскопии. На рис. 5 приведены изображения МФЧ для
исследования биологических объектов методами конфокальной лазерной микроскопии.
Созданные МФЧ могут быть использованы при проведении исследований в научноисследовательских, медицинских, учебных организациях; фармакологических
184
учреждениях; биотехнологических предприятиях; учреждениях МО и МЧС; службах
экологического контроля и мониторинга; криминалистических и судебно-медицинских
лабораториях; агропромышленных лабораториях и на коммерческих предприятиях.
а
б
Рисунок 5. Стеклянные МФЧ: с топологией типа «ступенька» (а) и микрочип с
камерами (б) для исследований биологических объектов.
Разработка микрочипов для исследований биологических объектов проведена
при частичной поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы», в
рамках проекта «Исследования и диагностика клеточных структур: новые
методические подходы и инструментальные решения на основе сканирующей зондовой
микроскопии и микрочиповых технологий» (N 4247).
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Reyes D. R., lossifidis D., Auroux P. A., Manz A. Micro Total Analysis Systems // Anal. Chem.
2002. v. 74, № 12. P. 2623-2652.
Verpoorte E. Microfluidic chips for clinical and forensic analysis// Electrophoresis. 2002. v. 23,
№5. p. 677-712.
Landers, J.P. Molecular Diagnostic Analysis Using Electrophoretic Microchips. //Anal. Chem.
2003. v. 75, №12. p. 2919-2927.
Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel
concept for chemical sensing//Sensors and Actuators B: Chemical. 1990. №1. p. 244-248.
Paegel B.M., Blazej R. G., Mathies R. A. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample
preparation and electrophoretic analysis//Curr. Opin. Biotechnol. 2003. v.14, №1. p. 42-50.
Liu J., Lee M.L. Permanent surface modification of polymeric capillary electrophoresis
microchips for protein and peptide analysis// Electrophoresis. 2006. v 27, №18. p. 3533-3546.
Chovan T., Guttman A. Microfabricated devices in biotechnology and biochemical
processing//Trends Biotechnol. 2002. v. 20. p. 116-122.
Wang J. On-chip enzymatic assays// Electrophoresis. 2002. Vol. 23, №5. P. 713-718.
Евстрапов А. А., Лукашенко Т. А., Тупик А. Н. Применение фотоотверждаемых
оптических клеев для герметизации аналитических микрочипов // Научное
приборостроение. 2010. Т. 20, № 1. С. 29-38.
Uchiyama K., Nakajima H., Hobo T. Detection methods for microchip separations //Anal.
Bioanal. Chem. 2004. v. 379, №3. p. 375–382.
Yi C., Li C.-W., Ji S., Yang M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of
biological cells //Anal. Chim. Acta. 2006. v. 560, №1-2. p. 1-23.
Евстрапов А.А. Физические методы управления движением и разделением микрочастиц в
жидких средах. Часть 1. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет
//Научное приборостроение. 2005. т. 15, №1. c. 8-21.
Евстрапов А.А., Мухин И.С, Кухтевич И.В., Букатин А.С. Применение ионной литографии для формирования наноразмерных каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках// Научно‐технический вестник Санкт‐Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики. 2010. 68, 4. С. 59‐63. 185