ALT (SGPT) Reagent Set Каталожный № HTI

ALT (SGPT)
Reagent Set
Каталожный № HTI-А7525
Каталожные номера:
Подготовка реагентов
HTI-A7525-50
HTI-A7525-250
Развести содержимое флакона дистиллированной водой,
объем указан на этикетке. Хорошо перемешать.
Набор
предназначен
для
количественного
определения аланинаминотрансферазы в сыворотке
крови.
1. Реагент хранить в холодильнике при 2-80С.
2. Разведенный реагент стабилен 30 суток в
холодильнике при 2-80С и 24 часа при комнатной
температуре (15-300С).
Хранение реагентов и стабильность
Назначение
История метода
Ультрафиолетовый метод определения активности
АЛТ был описан Henley и соавт. (1955 год) и
Wroblewski, La Due (1956 год) (2). Процедура анализа
была модернезирована и оптимизирована Henry и
соавт. в 1960 году. В 1974 году Скандинавское
общество клинической химии (SSCC) рекомендовало
усовершенствовать этот метод. В 1980 году
Международное общество клинической химии
предложило новый тест, в котором используется
лактатдегидрогеназа и NADH. В настоящее время
именно этот метод используется для определения
активности АЛТ.
Принцип метода
Не использовать реагент, если начальная абсорбция
разведенного реагента против воды при 340 нм больше
0,800.
Предостережения
Только для in vitro диагностики.
Сбор и хранение образцов
1. Использовать только свежие, негемолизированные
образцы сыворотки крови.
2. Концентрация фермента стабильна в течение 3 дней
при комнатной температуре (15-300С), 7 суток в
холодильнике при 2-80С и 40 дней при -200С.
Влияние других соединений
L-аланин + α-кетоглутарат АЛТ
Глутамат + NADH + H+
Непригодные для анализа образцы.
ЛДГ
пируват + L-глутамат
L-лактат + NAD+ + H20
Аланинаминотрансфераза катализирует перенос
аминогрупп с L-аланина на a-кетоглутарат, при этом
формируется
пируват
и
L-глутамат.
Лактатдегилрогеназа
катализирует
окисление
пирувата и окисление NADH до NAD. Скорость
окисления NADH пропорциональна активности
аланинаминотрансферазы.
Таким
образом,
уменьшение абсорбции прямо пропорционально
активности АЛТ.
Реагенты
(Концентрация после разведения реагента):
α-кетоглутаровая кислота (13 ммоль), D-аланин 400
ммоль, NADH 0,20 ммоль, ЛДГ > 1200 МЕ/л, Трисбуфер, рН 7,5+0,1, наполнители и стабилизаторы.
Некоторые лекарственные препараты могут влиять на
активность АЛТ
Материалы, входящие в состав набора
1. Реагент АЛТ.
2. Дистиллированная/деионизированная вода
Материалы необходимые, но не поставляемые
1. Автоматические пипетки.
2. Пластиковые пробирки.
3. Таймер
4. Биохимический ридер, для измерения абсорбции при
длине волны 340 нм.
5. Термостатируемый блок или водяная баня (370С).
Автоматический метод определения
См. инструкцию для пользователя к анализатору.
Ручной метод определения
1. Развести реагент в соответствии с инструкцией.
2. Внести по 1,0 мл реагента в каждую пробирку.
Инкубировать в течение 5 минут при 370С.
3. Настроить спектрофотометр на «0» по воде при 340.
4. Внести по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки
крови. Перемешать. Инкубировать в течение 1 минуты
при 370С.
ALT (SGPT)
Reagent Set
Каталожный № HTI-А7525
5. После инкубации измерить абсорбцию. Прогреть
реакционную смесь до 370С. Повторить измерение
2 раза с интервалом в 1 минуту.
6. Определить изменение абсорбции в минуту
(∆А/мин)
7. Концентрация фермента в образце (МЕ/л)
определяется путем умножения ∆А/мин на фактор
- 1768. См. раздел «Подсчет результатов».
8. Если в исследуемом образце предполагаемая
концентрация фермента выше, чем 500 МЕ/мл, то
необходимо провести разведение: 1 объем
исследуемой плазмы/сыворотки на 1 объем
изотонического солевого раствора. Полученные
результаты необходимо умножить на 2.
Замечания к проведению процедуры
1. Если
используется
спектрофотометр
с
автоматическим
температурным
контролем
реакционной кюветы, считывание абсорбции
должно проводиться в отдельной кювете.
2. В мутных и сильно иктеричных образцах
начальная абсорбция может быть очень высокой.
Рекомендовано для анализа использовать 50 мкл
образца. Полученные результаты необходимо
умножить на 2.
3. В образцах с очень высокими концентрациями АЛТ
может быть слабая абсорбция. Рекомендовано
при необходимости провести разведение образца
и повторить определение.
Калибровка
Процедура стандартизована по миллимолярной
абсорбции NADH (6,22 при 340 нм) при стандартных
условиях.
Подсчет результатов
Одна международная единица – это то количество
фермента, которое при определенных условиях
катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1
минуту.
АЛТ(МЕ/л)=(∆Аbs/минХ1,10Х1000)/(6,22Х0,10Х1,0)=
=∆А/минХ1768
Где:
∆А/мин – изменение абсорбции в минуту.
1000 – перевод МЕ/мл в МЕ/л.
1,10 – общий объем реакционной смеси (мл)
6,22 – миллимолярная абсорбция NADH
0,10 – объем исследуемого образца, мл.
1,0 – длина светового пути, см.
Пример подсчета:
∆А/мин = 0.12
тогда, 0,12Х1768=212 МЕ/л
Внимание: если объемы реакционной смеси изменены,
необходимо
сделать
пересчет
результатов
в
соответствии с формулой.
Международные
единицы:
для
перевода
в
международные единицы (nkat/l) умножить концентрацию
фермента в МЕ/л на 16,67.
Контроль качества
Рекомендовано при каждом проведении серии анализов
включать
коммерческие
контрольные
сыворотки
(патологические
и
нормальные)
с
известной
концентрацией АЛТ. Рекомендовано в каждой
лаборатории устанавливать свою частоту проведения
контроля качества.
Концентрация у практически здоровых лиц
АЛТ: 4-26 МЕ/л при 300С, 4-38 при 370С. В каждой
лаборатории необходимо устанавливать свои границы
нормальных значений.
Характеристики теста
Линейность: 0-500 МЕ/л
Сравнение
Проведен
корреляционный
анализ
результатов,
полученных на данных тест-наборах и другого
коммерческого тест-набора. Коэффициент корреляции
составил 0,999, регрессионный анализ: у=0,95Х+3,6.
Точность
Внутри серии
Среднее
S.D.
25
2.1
84
2.3
C.V.%
8.4
2.7
От серии к серии
Среднее S.D.
28
1.8
84
3.0
Произведено High Technology Inc.
109 Production Rd
Walpole, MA 02081 USA
Fax: 1 508 660-22-24
e-mail: [email protected]
Rev. 5/03 P803-A7525-01
C.V.%
6.4
3.6