Биосинтетическое получение деитериймеченного L

УДК 579.871.08+577.112.385.4.08
О. В. МОСИН, Е. Н. КАРНАУХОВА, А. Б. ПШЕНИЧНИКОВА,
Д. А. СКЛАДНЕЕ*. О. Л. АКИМОВА
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В.
Ломоносова, 117571
НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 113545
Биосинтетическое получение деитериймеченного Lфенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом
Brevibacterium rnethylicum
На примере L-фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum
продолжены
исследования по
использованию метилотрофных бактерий для
биосинтетического получения аминокислот, меченных стабильными изотопами.
Представлены данные по адаптации L-фенилаланинсекретирующего метилотрофа В,
methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% D2O и 2% CD3OD по
объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L-фенилаланин
разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на
дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль
биосинтетического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен
с использованием производных типа метиловых эфиров N-дансил-аминокислот и
последующей масс-спектрометрией электронного удара.
Метилотрофные бактерии — группа микроорганизмов, способных расти на метаноле и других
восстановленных производных углерода, являются
весьма притягательными биотехнологическими объектами, возможности практического применения которых реализованы явно недостаточно [1, 2].
Одним из наиболее важных направлений работ с
метилотрофными микроорганизмами являются исследования, направленные на поиск или конструирование новых продуцентов аминокислот и других
биологически активных соединений. В плане начатых исследований по получению аминокислот, меченных стабильными изотопами [3 — 6], практический интерес представляет использование метилотрофов, особенно продуцентов аминокислот для получения целевых соединений за счет биоконверсии
низкомолекулярных меченых субстратов. Традиционным подходом при этом остается селекция продуцентов биологически активных соединений (БАС)
[7,8].
Безусловно, наиболее целесообразным является
использование облигатных метилотрофов, которые
способны ассимилировать меченые Ci-субстраты в
качестве единственного источника углерода [9]. Как
было показано на примере L-лейцинсскретирущего
облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum,
полная замена в среде метанола на его 13С-аналог
практически не сказывается на величине лаг-фазы
и уровне накопления биомассы, а степень биосинтетического изотопного обогащения характеризуется
главным образом изотопной чистотой 13Ci-субстрата
[3].
Известно, что исчерпывающее биосинтетическое
обогащение дейтерием бактериальных микроорганизмов при высоких концентрациях изотопа в среде
может вызвать ингибирование биосинтеза клеточных протеинов и тем самым замедлить бактериальный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11],
бактерии весьма чувствительны к высокому содержанию дейтерия в среде и, как правило, не способны
выдерживать концентрации оксида дейтерия более
чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов
возможной адаптации метилотрофных микроорганизмов к максимальному содержанию дейтерия в
среде представляется очень актуальной.
Целью данной работы было исследование динамики роста микробной биомассы и секреции деитериймеченного L-фенилаланина лейцинзависимым му-
тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтерометанола на средах с тяжелой водой разного уровня
дейтерирования.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы. Исследования проводили
с факультативным лейцинзависимым (максимальная потребность в L-лейцине — 100 мкг/мл)
метилотрофом В. methylicum, продуцентом L-фенилаланина, полученным из коллекции культур
ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных
микроорганизмов (ВКПМ В 5652).
Исходный штамм поддерживали на агаризованной
(2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %).
Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе
глицерина при -10°.
Адаптированный к максимальному содержанию
дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. methylicum был получен в серии пассажей с последовательным отбором хорошо растущих клонов на агаризованных средах (с 2 % СDзОD по объему),
содержащих ступенчатое увеличение концентрации
дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть
до полной замены воды и метанола на их дсйтерированные аналоги).
Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum
поддерживали на агаризованных средах М9 (см.
выше) с максимальным содержанием дсйтеро-компонентов.
Для приготовления питательных сред с различным
содержанием СОзОО и D2O использовали соли марки
«х. ч.», D2О (99,9 % D) и CD3OD (99,6 % О), полученные из Всесоюзного центра «Изотоп» (Санкт-Петербург, РФ), а также L-лейцин (Reanal, Венгрия). Для получения производных аминокислот
использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, США) и диазометан.
Для получения диазометана применяли N-нитрозометилмочевину, закупленную у Merck (Германия).
Посевной материал выращивали до ранней фазы
экспоненциального роста бактериальной культуры
на средах разного уровня дейтерирования, затем
вносили в ферментационные среды с соответствующим изотопным насыщением D2O и СОзОD (таблица) в количестве 5 об. % и культивировали, как
описано ниже.
Выращивание посевного материала и ферментацию проводили на синтетической среде М9 [13] с
десятикратным избытком NH4C1 (так как в предва-
Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum
Номер
Компоненты среды, об. %
Лаг-фаза, ч
опыта
Н20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
98
98
73,5
73,5
49
49
24,5
24,5
0
0
D20
0
0
24,5
24,5
49
49
73,5
73,5
98
98
CHjOH
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
CD3OD
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
24
30
32
35
40
44
46
49
60
64
Выход
Время
биомассы, % от генерации, ч
100
92
90
86
70
60
56
47
33
30
2,2
2,4
2,4
2,6
3,0
3,2
3,5
3,8
4,4
4,8
Данные приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
рительных экспериментах по оптимизации состава
питательных сред показано, что такое увеличение
концентрации хлористого аммония в среде стимулирует биосинтез L-фенилаланина несмотря на некоторое увеличение продолжительности лаг-фазы) и
L-лсйцином. После стериллизации рН доводили до
величины 7,0—7,2 при помощи NaOH. В качестве
источника углерода использовали метанол (2 % от
объема среды) или его дейтериймеченный аналог.
Культивирование бактерий проводили при 37° в
условиях интенсивной аэрации растущей культуры
в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150
мл среды. Морфологию клеток В. methylicum исследовали с помощью поляризационно-интерфсрснционного микроскопа «Biolar» (Польша). Рост культуры контролировали на спектрофотометре «Beckman
DU 6» (США) при X 620 нм.
Все эксперименты по биосинтетическому включению дейтерия проводили параллельно с контрольным (см. таблицу) на стандартной недейтерированной среде.
Для каждого эксперимента по биосинтетическому
введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки
на ранней фазе экспоненциального роста осаждали
центрифугированием (10000 мин"1, 5 мин). После
отделения биомассы супернатант лиофилизовали.
Сухой остаток супернатанта, содержащий фенилаланин, переводили в метиловые эфиры N-дансилпроизводных аминокислот, как описано в работе [3].
ТСХ осуществляли на пластинках «Silufol» (Че-хоСловакия) в системах: (А) — изопропанол-аммиак
(7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1).
Количественное определение секретируемого фенилаланина производили методом ТСХ на пластинках «Silufol» в системе (А). Образцы КЖ объемом 10
мкл наносили на пластинки. Элюирование проявленных нингидрином пятен фенилаланина проводили 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %ном этаноле. Концентрацию аминокислоты определяли спектрофотомстрически с использованием кривой корреляции при X 540 нм.
Очистку метиловых эфиров N-дансил-производных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий,
осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм)
хроматографии на силикагеле L 40/100 (Chemapol,
Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой
хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола).
Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раствором нингидрина в ацетоне. N-Дансильные производные аминокислот идентифицировали в системе (Б)
по характерной флуоресценции в УФ-свете.
Аминокислоты идентифицировали сопоставлением их спектральных и хроматографичсских характеристик с литературными данными [14], сравнением
со стандартными аналогами, а также подтверждали
данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа
их производных.
Масс-спектры электронного удара производных
аминокислот измерены на приборе МВ-80 A (Hitachi,
Япония) при энергии ионизирующих электронов
70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, большинство микроорганизмов, распространенных в природе, к которым относятся метилотрофы, не могут служить хорошими продуцентами ароматических аминокислот, вследствие наличия эффективных механизмов регуляции биосинтеза
этих соединений в микробной клетке, хотя эта способность появляется у ряда их мутантных форм
[15 — 17]. Активными микробными продуцентами
L-фснилаланина являются, как правило, мутанты, у
которых снят негативный контроль со стороны таких
ключевых ферментов биосинтеза этой аминокислоты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиарабиногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза)
[18, 19]. Определенный интерес в связи с этим
представляет исследование способности продуцировать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотрофным мутантом В. methylicum, достаточно удобным,
хотя и малоизученным объектом для биотехнологического применения. Поэтому начальный этап биохимических исследований В, methylicum был связан с
получением ауксотрофных мутантов, для которых в
большинстве случаях характерны ограниченный спектр
мутантных фенотипов и кроме того довольно высокий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцинзависимый штамм В. methylicum, продуцент L-фенилаланина, был отобран в лаборатории генетики метилотрофов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов на предыдущем этапе работы
после обработки В. methylicum нитрозогуанидином
по устойчивости к аналогу фенилаланина метафторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким
образом аналогорезистентные мутанты конвертировали метанол и накапливали при этом фенилаланин
в ферментационной среде. Сравнительные анализы
аминокислоты
методом
тонкослойной
хроматографии и масс-спектрометрии показали, что
фенилаланин, секретиру-емый В. mcthylicum,
полностью
идентичен
коммерческому
Lфенилаланину.
Мы изучали влияние степени замещенности дейтерием низкомолекулярных субстратов воды и метанола в составе питательных сред на рост полученного
ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточной генерации (см. таблицу), а также секрецию
дейтериймеченного фенилаланина. Продолжительность лаг-фазы, время генерации и максимальная
секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях
изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4,
6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1).
Секреция
, г/л
пассажей на агаризованных средах (с 2 % СD3ОО
по объему) при ступенчатом увеличении
концентрации оксида дейтерия в них (см. таблицу).
Последовательно отбирали наиболее продуктивные
по уровню накопления дейтерированной биомассы
клоны В. methylicum и пересевали их на среды с
большей степенью дейтерирования, вплоть до
полной замены воды и метанола на их
дейтерированные аналоги (выживаемость на
полностью дейтерированных средах не более 40 %).
Полученный в результате ступенчатого отбора штамм В. methylicum, адаптированный к дейтерию, переносили затем с максимально насыщенных дейтерием агаризованных сред на жидкие среды М9, приготовленные исключительно из 98 % D2O (99,9 % D) и
содержащие 2 % СОзОD, и культивировали, как
описано в эксперименте.
Динамика роста бактерии В. mеthylicum,
адаптированного к высокому содержанию дейтерия
в среде, и способность секретировать Lфенилаланин в условиях максимально насыщенных
дейтерием сред представлены на рис. 2.
Секреция
Рис.
1.
Рис.
2.
Характеристики
бактериального
роста
В.
methylicutn {выход биомассы, время генерации и максимальная
секреция фенилаланина) на средах с изотопным составом,
соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в
таблице
Как видно из представленных данных, в отсутствие дейтериймеченных субстратов при росте
исходной бактерии на протонированной среде
продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч
(см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания
тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы
увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D2O и 2 %
CD3OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если
замена метанола на его дейтерированный аналог не
вызывала существенного ингибирования роста
бактерий и не сказывалась на выходе микробной
биомассы, то на средах с высоким содержанием
оксида дейтерия микробный рост был заметно
подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где
оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу,
опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже,
чем в контрольных экспериментах и в тех случаях,
когда использовали простую воду и дейтеро-метанол
(см. таблицу, опыт 2).
Как видно, длительность времени генерации
бактериальной культуры с увеличением изотопного
насыщения среды дейтерием увеличивается. Из
данных таблицы видно, что продолжительность лагфазы и время клеточной генерации бактерии при
переходе со стандартной на дейтерированные среды
находятся в определенной корреляции. Так
например, в условиях эксперимента 10 продолжительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а
время генерации возрастает в 2,2 раза.
С целью увеличения эффективности изотопного
мечения клеточных БАС и аминокислот и интенсификации роста метилотрофа на полностью
дейтерированных
средах
мы
адаптировали
полученный мутант В. methylicum к максимальному
содержанию дейтерия в среде культивирования. Для
этого были проведены пять серий адаптационных
дО время, ч
Динамика роста В. methylicum (la, 10'а, 10d) и секреция
фенилаланина (16, 10'б, 10б) на средах с изотопным составом,
соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б —
исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адаптированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на
полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный
метилотроф на полностью дейтерированной среде
Выход биомассы, время генерации и максимальная секреции фенилаланина исходным мутантом
(10) и мутантом, адаптированным к высокому содержанию дейтерия в среде (10'), на средах, максимально насыщенных дейтерием, приведены в гистограмме на рис. 3 относительно контрольного (У). Сравнивали ростовые данные адаптированного к дейтерию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт
10') с исходным В. methylicum на стандартной среде
М9 (опыт I) и на полностью (98 % D2О) дейтерированных средах с 2 % CD3OD (опыт 10).
Как видно из графиков на рис. 2, степень замещенности дейтерием воды и метанола не оказывает
м•
и биомассы, % 0тк0нтрол»н<?го
L-Ptic, г/л
Время
Рис. 3. Выход биомассы, время генерации и максимальная секреция
фенилаланина на средах с изотопным составом, соответствующим
номеру эксперимента в таблице: 10 — исходный метилотроф; 10' —
адаптированный к высокому содержанию дейтерия В. methylicum; 1
— исходный метилотроф на стандартной недейтери-рованной среде
значительного влияния на секрецию фенилаланина,
в то время как выход микробной биомассы на дейтерированной среде значительно уменьшается. Незначительное снижение уровня секреции фенилаланина (до 0,5 г/л) наблюдалось лишь в изотопных
экспериментах (см. рис. 2, 10 б), когда использовали
исходный метилотроф на средах с максимальным
насыщением дейтерием. Уровень накопления микробной биомассы адаптированным метилотрофом на
полностью дейтерированной среде выше, чем для
исходного В. methylicum (см. рис. 2, 10 а) , несмотря
на двухкратное увеличение продолжительности лагфазы (рис. 2, опыт 10' а), в то время как секреция
фенилаланина у адаптированного метилотрофа существенным образом не отличалась от таковой на
недейтерированной среде. В отличие от адаптированного к дейтерию В. methylicum, рост исходного
мутанта на полностью дейтерированной среде с 98%ной тяжёлой водой сильно ингибируется дейтерием
(см. рис. 2, 10 и).
Как видно из рис. 3, время клеточной генерации
для адаптированного метилотрофа (2,5 ч) близко к
исходному на стандартной среде. Несложный селекционный подход позволил получить штамм В. methylicum, способный конвертировать дейтеро-метанол
на максимально насыщенных дейтерием средах в
клеточные БАС и секретирусмый L-фенилаланин.
При этом выход фенилаланина у адаптированного
мутанта не сократился (см. рис. 2). Таким образом,
было показано, что некоторые виды метилотрофных
бактерий, например, факультативный метилотроф
В. methylicum, в принципе могут быть адаптированы
к высокому содержанию дейтерия в среде без потери
ростовых и биосинтетических способностей бактериальной культуры.
Механизм биосинтеза L-фенилаланина В. methylicum и роль лейцина в этом процессе не объяснены
окончательно.
Что же касается самого фенилаланина, то он, как
известно, синтезируется в клетках микроорганизмов
и, в частности, в коринебактериях из своего предшественника — префеновой кислоты, которая через
стадию образования фенилпирувата превращается в
фенилаланин под действием клеточных трансаминаз
[24 — 26] .
Продолжая обсуждать механизм секреции фенилаланина этим метилотрофом следует отмстить, что
общей особенностью сскретируемой целевой аминокислоты было значительное увеличение ее продукции на ранней фазе экспоненциального роста В.
mehtylicum, когда выход микробной биомассы был
незначителен (см. рис. 2). Затем во многих экспериментах наблюдалось, как правило, ингибирование
биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в
среде. Как показали микроскопические наблюдения
за растущей популяцией микроорганизмов, подобный характер динамики секреции фенилаланина не
коррелирует с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях
роста, что служит подтверждением морфологической
однородности микробной популяции. По-видимому,
накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, как показано еще на других микробных
продуцентах L-фенилаланина! при культивировании микроорганизмов без рН-статирования не исключено обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза [25, 26]. Кроме основной сскретируемой аминокислоты в среде, как правило, присутствуют следовые количества других аминокислот (аланин, валин, а также тирозин и триптофан) и других метаболитов, четко детектируемых масс-спектрометричсским анализом [3].
Степень биосинтетического обогащения секретируемого L-фенилаланина была определена масс-спектрометрическим анализом метиловых эфиров Nдансильных производных аминокислот методом электронного удара. Согласно сравнительным данным
масс-спектрометрического анализа производных нативного и дейтерироваиного фенилаланина со сред
разного уровня дейтерирования (см. таблицу), степень биосинтетического включения дейтерия в молекулу фенилаланина коррелирует с концентрацией
дейтерия в среде. Так например, в масс-спектре
дейтерированного производного фенилаланина (молекулярная масса недейтерированного соединения
412), полученного из В. methylicum в условиях максимального насыщения среды дейтерием (см. таблицу, опыт 10), четко детектируется высокоинтенсивный пик молекулярного иона с m/z 420 (М+ + 8) и
менее интенсивный пик с примесью m/z 419 (М.++ 7).
Предварительные данные свидетельствуют о высокой степени включения дейтерия в молекулу фенилаланина в условиях полной замены воды и метанола
на D2О и СDзOD, что составляет (с учетом
точности метода) 7-8 атомов из 8 детектируемых по
скелету молекулы. При этом лсгкообмсниваемые
атомы D(H) амино- и карбоксильной групп не рассматриваются.
Основными преимуществами В. methylicum, адаптированного к максимальному содержанию дейтерия
в среде и способного конвертировать дейтеро-метанол для получения униформно дсйтерированных
аминокислот и белка (в отличие от некоторых традиционных способов с использованием других микробных продуцентов [27, 28] и микроводорослей
[29]) являются хорошие ростовые и биосинтетические способности этого метилотрофа на максимально
дейтерированных средах.
При помощи адаптированного штамма В. methylicum можно достаточно быстро наработать в ла-
бораторных условиях граммовые количества униформно меченного дейтерием L-фенилаланина. Таким образом, использование в прикладных целях
полученного в настоящей работе мутанта В. methylicum, адаптированного к полностью дейтерированным средам, содержащим тяжёлую воду и
дейтеро-метанол
и,
в
частности,
для
биосинтетического получения фенилаланина разной
степени обогащенности дейтерием {вплоть до
полной замены всех атомов водорода на дейтерий)
является весьма эффективным,
В заключение следует отметить, что более высокая эффективность изотопного мечения клеточных
БАС может быть обеспечена путем полной замены
протонированных компонентов среды на их дейтерированные аналоги, а также используя лейцин, униформно меченный дейтерием, который в принципе
можно получать из гидролизатов тотального белка
биомассы этого метилотрофа. Анализ биосинтетического включения дейтерия в аминокислоты тотального белка биомассы будет опубликован отдельно.
Авторы выражают благодарность ст. н. с. ВНИЦ
молекулярной диагностики О. С. РешетовоЙ за участие в получении масс-спектров изучаемых образцов
производных аминокислот.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
Романовская В. А.,
Мохамед эль Сайд II Микробиология. —
1986.— Т. 48. — № 2. — С. 97 — 107.
2.Никонова Е. С., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. II
Прикл. биохим. и микробиол. — 1986. — Т. 22. —
С. 557 — 561.
3.Karnaukhova Е. N., Resheiova О, S., Semenov S. I.
et al. // Amiiio Asids. — 1993. — V. 4. — P. i — 14.
4.Skladnev D. A., Baev M. V., Shilova S. Ун. //
Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for
Energy, — Industry and Enviroment. — Athens. —
1991. — P. 47 — 51.
5.Skladnev D. A., Reshetova O. S. II J. Pharm. Belg. —
1992. — V. 47. — № 3. — P. 216.
6.Pshenichnicova А. В., Reshetova O. S. it Abstr.
of 4th International Meeting on Bio-Chroma to graphy
and Molecular Biology. — La Grand Motte. France,
1992. — № 63.
7.Tsygankov Y. D., Kasakova S. M. (I Arch.
Microbiol. — 1987. V. 149. — P. 112 — 119.
8.Stone S., Goodwin P. M. II J. General Microbiol. —
1989. — V. 135.__p. 227 235.
9.Patent USA № 0220951, 1988.
10. Borek E., Rittenberg D. II Proc. Natl. Acad. ScL —
1960. — V. 46. — P. 777.
11.Keiko Vnno., Hiroki Busujima., Shegeki Shimba. //
Chem. Pharm. Bull. — 1988. — V. 36. — № 6. — P.
1828 — 1833.
12.Papadimitriou C., Wenzei M. II Z. Naturforsch. —
1989. — V. 44. — S. 1053 — 1057.
13.Миллер Дж. II Эксперименты в молекулярной
генетике. — М-: Мир, 1976. — С. 393.
14.Боллигер X. Р., Бреннер М., Шпшль Э. И
Хроматография в тонких слоях. — М.: Мир, 1965.
— С. 395 — 408.
15. Shiio Jsamu. II Biotechnol. Amino Acid Prod. —
Токио, 1986.
— P. 188 — 206.
16.Максимова И. П., Олехнович И. II. Регуляция
биосинтеза
ароматических аминокислот у метилотрофных
бактерий: Биохимия и физиология метилотрофов.
— Пущино, 1987. —С. 77 — 85.
17.KadziM. etal.// ActaBiotechnol. — 1990. — V. 10. _
№ 1.— Р 93 — 98.
18.Netrusov A. I., Dikanskaja E. M., Kulicova W. P.
Biochemical
specifity of asydophilik methylotrops: Abst. of 13
Intern. Cong.
of Microbiol. USA. Boston. August. 1982. — Boston:
Academic
press, 1982. —V. 1. — P. 61.
19.WunscheL., Fischer II., KieselB. II Z. Allg. Microb. —
1983. —P. 23. — № 3. — S. 189 — 196.
20.Noon D. M, Lindstrom M. E. II J. Bacteriol. —
1986. —V. 166. — P. 581 —590.
21.Levering P. Д., Tiesma L., Woldedorp J, P. et
al. // Arch. Microbiol. — 1987. — V. 146. — P. 346
— 352.
22.КлецоваЛ. В., Говорухина Н. И. и др. //
Микробиология. — 1987.
— Т. 56. — Вып. 6. —
С. 901 — 906.
23.Whitta S., Sinclair M. I., Holloway В. W. II J.
Gen. Microbtol. — 1985. — V. 131. — P. 1547 —
1549.
24.Fazel A. M. et al. // J. Bacteriol. — 1979. — V.
138. — P. 805 — 815.
25.Stenmark S. L., Pierson D. L., Glover G. I. et al. //
Nature (London). — 1974. — V. 247. — P. 290 —
292.
26.Ворошилова Э. Б., Гусяпшнер М. М., Жданова II. И.
и др. // Биотехнология. — 1989. — Т. 5. — № 2. —
С. 137 — 141.
27.Рувинов С. В., Сапоровская М, В., Беликов В. М.
II Изв. Акад. наук. — 1989. — № 10. — С. 2341 —
2343.
28.Сох J., Kyle D., Radmer R. et al. // Trends.
Biotechnol. — 1988.
— V. 6. — P. 279 — 282.
29. Crespi II. L. Synth, and Appl. Isot. Labeled
Compounds. Proc. 2nd Int. Symp., 3-6. Sept. 1985. —
Amsterdam, Oxford, N.-Y., Tokyo: Elscvier, 1986. —
P. I l l — 112.
O. V. MOSIN, E. N. KARNAUKHOVA, A. B.
PSHENICHNIKOVA,
D. A. SKLADNEV, O. L. AKIMOVA
Moscow Institute of Fine Chemical Technology, 117571
Institute for Genetics and Selection of Industrial
Microorganisms, Moscow, 113545
Biosynthetical Preparation of D-Labeled LPhenylanine Produced by Methylotrophic Mutant Brevibacterium methylictim
Using L-phenylalanine producing mutants B. methylicum the
study on application of methylotrophic bacteria to the biosynthetic
production of amino acids labeled with stable isotopes was
developed. The data are presented on the adaptation of
phenylalanine producing methylotroph B. methylicum to maximal
deuterium concentration in medium: 98 per cent D2O and 2 per
cent CD3OD (v/v). The method developed enables to obtain
deuterium labeled L-phenylalanine with various content of isotope
up to complete substitution of hydrogene by deuterium which is
approved by means of mass spcctrometry. The biosynthetical
introduction of deuterium into produced amino acids was valued
with the use of electron impact mass spectrometry of the methyl
ethers of N-dansyl amino acids derivatives.