Синтез и свойства конъюгатов замещенных гидрокси
реклама
На правах рукописи Сабуцкий Юрий Евгеньевич Синтез и свойства конъюгатов замещенных гидрокси1,4-нафтохинонов с N-ацетил-L-цистеином и глутатионом 02.00.03 – Органическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Владивосток – 2014 2 Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН Научный руководитель: кандидат химических наук, старший научный сотрудник Полоник Сергей Георгиевич Официальные оппоненты: Горностаев Леонид Михайлович доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой химии Красноярского педагогического университета им. В.П. Астафьева Слабко Олег Юрьевич кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии Школы естественных наук Дальневосточного федерального университета Ведущая организация: Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, г. Новосибирск Защита состоится «20» марта 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук « » 2015 года Черников О.В. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Полигидроксилированные 1,4-нафтохиноны ряда нафтазарина (5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона) и наиболее доступный из них пигмент эхинохром, выделяемый из морских ежей, являются эффективными антиоксидантами. На основе эхинохрома создан отечественный лекарственный препарат ГистохромТМ, применяемый для лечения инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, а также травм и ожогов глаз. Установлено, что эхинохром эффективно защищает кардиомиоциты от побочных токсических эффектов противоопухолевых лекарственных препаратов, вызывающих повышенную продукцию активных форм кислорода и снижение митохондриального мембранного потенциала в клетках сердца. В экспериментах на изолированных кардиомиобластах крыс показано, что эхинохром вызывает значительное увеличение массы митохондрий и функций окислительного фосфорилирования. Найдено, что эхинохром является неконкурентным ингибитором ацетилхолинэстеразы и в этом качестве перспективен для лечения нервно-мышечных расстройств, болезней Альцгеймера и Паркинсона. Высокая эффективность эхинохрома и разнообразные направления его использования в клинической практике делает перспективным поиск новых малотоксичных водорастворимых антиоксидантов - аналогов эхинохрома. Наиболее продуктивным путем создания новых лекарственных средств является модификация известных лекарственных средств (эхинохрома) и синтез новых веществ с фрагментами, повторяющими структуру биологически активного фармакофора. Эхинохром мало растворим в воде, поэтому в медицинской практике используют его натриевую соль, растворы которой, по сравнению с эхинохромом, быстро окисляются кислородом воздуха, что ограничивает срок годности препарата. В связи с этим, основными направлениями модификации эхинохрома являются: повышение растворимости в воде, снижение токсичности, при сохранении уже имеющейся биологической активности, которую связывают с антиоксидантными (антирадикальными) свойствами хинона. Цели и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы является разработка эффективных методов получения водорастворимых N-ацетилL-цистеинильных и глутатионильных производных 1,4-нафтохинонов, синтез неизвестных ранее N-ацетил-L-цистеинильных конъюгатов нафтохинонов, изучение их антиоксидантной и цитотоксической активности, и отбор перспективных соединений для последующего углубленного изучения полученных соединений in vivo. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые системно исследовано взаимодействие замещенных производных хлорнафтазаринов с N-ацетил-L-цистеином под действием карбоната калия и синтезированы новые водорастворимые моно-, бис-, трис- и тетракисN-ацетил-L-цистеинильные конъюгаты нафтазаринов, структурно родственные эхинохрому и другим биологически активным пигментам морских ежей. Разработан новый эффективный кислотно-катализируемый метод тиометилирования замещенных 2-гидрокси-1,4-нафтохинонов параформальдегидом и N-ацетилL-цистеином, впервые синтезирован ряд новых 3-гидрокси-2-тиометил-N-ацетилпроизводных 1,4-нафтохинонов и природных N-ацетилL-цистеинильных L-цистеинильных биологически активных конъюгатов – фибростатинов B,C и D. Разработаны методы синтеза 3-метил-, 3-гидроксиметил-, 3-хлорметил-, 3-ацетоксиметили 3-метоксиметилпроизводных 2,7-диметоксиюглона и 4 родственных соединений. Изучена реакционная способность вновь синтезированных производных 2,7-диметоксиюглона в реакции тиометилирования N-ацетилL-цистеином. Показано, что при катализе уксусной кислотой функциональные группы 3-метилзамещенных радикалов легко замещаются остатком N-ацетил-L-цистеина. Предложена улучшенная методика синтеза биологически активных 2,3-S,S'бисглутатионил-7-алкил-5,6,8-тригидрокси-1,4-нафтохинонов с использованием доступных и нетоксичных реагентов. Исследована токсичность вновь полученных соединений на клетках карциномы Эрлиха in vitro, проведено исследование антирадикальной активности N-ацетилL-цистеинильных производных ряда нафтазарина по способности обесцвечивать окрашенный дифенилпикрилгидразильный радикал. Найдено, что синтезированные конъюгаты нафтохинонов нетоксичны в концентрациях до 100 мкМ. Среди вновь синтезированных N-ацетил-L-цистеинильных производных отобраны перспективные водорастворимые производные нафтазарина для исследований in vivo. Апробация работы. Материалы данной работы были доложены на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы органической химии», Новосибирск, 2012; XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2012; 2-ом Международном симпозиуме «The 2nd International symposium on life sciences», Владивосток, 2013; и VI Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток, 2014. Публикации. Содержание диссертации изложено в трех статьях, опубликованных в журналах из списка ВАК РФ, и четырех тезисах докладов в материалах научных конференций. Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей. Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, список используемых сокращений и список литературы, включающий 156 источников. Диссертация изложена на 123 страницах и содержит 8 таблиц и 35 схем. Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.х.н. Полонику С.Г. за помощь в выполнении диссертационной работы; сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Денисенко В.А., к.ф.-м.н. Глазунову В.П., к.х.н. Дмитренку П.С., Денисенко Д.В., Моисеенко О.П. за запись ЯМР, ИК- и масс-спектров; д.б.н. Калинину В.И. за помощь в переводе и полезные советы при подготовке статьи в журнал Synthesis. Автор приносит глубокую благодарность к.б.н. Юрченко Е.А. за определение цитотоксической активности вновь полученных соединений, а также всем сотрудникам лаборатории органического синтеза природных соединений за поддержку и теплую атмосферу в коллективе. Автор выражает благодарность организациям, оказавшим финансовую поддержку данной работы: Международному научно-техническому центру (проект № 4009) и Российскому фонду фундаментальных исследований (проект №12-I-П5-05). 5 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Наиболее продуктивным путем создания новых лекарственных средств является модификация биологически активных природных соединений и лекарственных препаратов путем синтеза на их основе новых веществ с фрагментами, повторяющими структуру биологически активного фармакофора. Одним из методов модификации биологически активных соединений является их конъюгация с углеводами и аминокислотами. На отдельных представителях ряда 1,4-нафтохинонов показано, что такая конъюгация приводит к продуктам, которые сохраняют исходную активность модифицируемого соединения и обладают более высокой растворимостью, либо дает новые соединения с другими полезными свойствами. Было обнаружено, что конверсия природного 5-гидрокси-1,4-нафтохинона (юглона) 1 в ацетилированные O- и S- гликозиды приводит к веществам, обладающим способностью избирательно и эффективно стимулировать апоптоз клеток лейкоза человека, в отличие от самого юглона, без воздействия на нормальные клетки иммунной системы (нейтрофилы). При гликозилировании эхинохрома 2 и шиконина 4 были получены глюкозидные производные 3, 5, которые в отличие от исходных хинонов 2 и 4 способны индуцировать синтез белков теплового шока массой 70 кДа in vitro и in vivo. 1 юглон 2 R=H 4 R=H 6 R=Me, 7 R=Et, 8 R= OH 3 R= GlcAc4 5 R= GlcAc4 GS - глутатионил Синтезированные ранее в нашей лаборатории бисглутатионильные производные гидроксинафтазаринов 6-8 показали более высокую водорастворимость, более низкую токсичность и значительную кардиопротекторную активность, не уступающую активности эхинохрома. В представленной работе для модификации нафтохинонов нами использован N-ацетил-L-цистеин 9, водорастворимый лекарственный препарат, используемый как муколитический агент и детоксикант, применяемый при передозировке парацетамола. N-Ацетил-L-цистеин также является предшественником в биосинтезе глутатиона, серосодержащего трипептида - γ-L-глутамил-L-цистеинилглицина 10, отвечающего в организме за детоксикацию чужеродных соединений. NHAc HO2C O HO2C SH N H H N H2N H CO2H H O SH 9 N-ацетил-L-цистеин (NAC-SH) 10 глутатион восстановленный (GSH) 6 1.1 Взаимодействие N-ацетил-L-цистеина с триалкилнафтазаринами На первом этапе работы нами было изучено взаимодействие N-ацетилL-цистеина (NAC-SH) 9 с триалкилнафтазаринами 11 и 12. После 5 часов взаимодействия хинона 11 с N-ацетил-L-цистеином из реакционной массы выделили исходный хинон 11 (49 %) и новый полярный продукт реакции, которому по данным ЯМР спектроскопии приписали строение целевого конъюгата 13 (46 %). Хинон 12 реагировал сходным образом. При проведении процесса в тех же условиях из продуктов реакции выделили исходный хинон 12 (57 %) и конъюгат 14 (38 %). Схема 1 OH O OH O H Me OH O Me H Me NAC-SH R Me Me OH O R Me OH O S-NAC H R OH OH A 11 R = Me, 12 R = Et O OH O Me S Me R H N H Me OH H H O OH O 13 R = Me (46%), 14 R = Et (38%) OH OH [O] Me S-NAC Me R OH OH B Мы полагаем, что взаимодействие этих веществ протекало как михаэлевское 1,4-присоединение тиола к хиноидной системе связей нафтазаринового ядра, с последующей изомеризацией нестабильного интермедиата А и окислением полифенола В кислородом воздуха (схема 1). Некоторое уменьшение выхода конъюгата 14, в сравнении с 13, по-видимому связано со стерическим эффектом этильного заместителя, препятствующего присоединению тиола к хиноидной части нафтазаринового ядра. Строение вновь полученных производных установлено методами ИК- и 1 ЯМР Н-спектроскопии, и масс-спектрометрии. В ИК-спектрах соединений 13 и 14 наблюдались полосы поглощения в областях 3326-3378 и 1549-1555 см-1, характерных для замещенной амидной -NH- группы, полосы поглощения карбонила CH3CONHгруппы при 1625-1635 см-1, и полосы, принадлежащие карбонилам нафтазаринового ядра при 1599 см-1. В области 3370-3410 см-1 имелась уширенная полоса поглощения гидроксильных групп, а при 1704-1723 см-1 полоса поглощения карбонила карбоксильной группы. Спектры ЯМР 1Н веществ 13 и 14 содержали характерные синглеты протонов α-ОН групп нафтазаринового ядра в области слабого поля при 13.18-13.34 м.д., уширенный синглет протона карбоксильной группы, который наблюдался в области 12.83-12.88 м.д., дублет протона амидной -NH- группы при 8.22-8.28 м.д. с КССВ = 8.1 Гц и мультиплет метинового протона остатка цистеина в области 4.334.34 м.д. с интенсивностью 1Н с КССВ 4.7, 8.1 и 8.6 Гц. Каждый протон метиленового звена -СH2-S- проявлялся в виде отдельно отстоящих дублетов дублета при 3.30-3.61 м.д. с КССВ = 4.7, 8.6 и 13.8 Гц. Сигналы метильных групп нафтазариновой 7 и аминокислотной части проявлялись в виде синглетов при 2.17-2.32 и 1.72-1.74 м.д. соответственно. Спектр соединения 14 отличался от 13 наличием характеристических сигналов этильной группы – квартета при 2.90 м.д. и триплета при 1.05 м.д. с КССВ 7.2 Гц. В масс-спектрах соединений 13 и 14 наблюдали пики молекулярных ионов с m/z равными 393 и 407, что соответствовало предложенным формулам. 1.2 Взаимодействие N-ацетил-L цистеина с хлоралкилнафтазаринами Далее нами было изучено взаимодействие N-ацетил-L-цистеина с хлоралкилнафтазаринами 15–18. Известно, что атомы хлора в нафтазариновом ядре в присутствии карбонатов щелочных металлов легко замещаются серосодержащими нуклеофилами. При конденсации N-ацетил-L-цистеина 9 с хлоралкилнафтазаринами 15–18 с выходами 73-96 % были получены соответствующие моно- и бисцистеинильные конъюгаты 13, 14, 19 и 20 соответственно. Мы полагаем, что взаимодействие N-ацетил-L-цистеина 9 с хлорнафтазаринами 15–18 (схема 2) протекает с образованием в качестве промежуточного соединения продукта 1,4-присоединения тиолят-аниона и последующим отщеплением хлорид-иона. Коньюгацию хлорнафтазаринов 15–18 с N-ацетил-L-цистеином проводили в ацетоне. В ходе реакции наблюдали выпадение творожистого бордового осадка, который растворялся при обработке сульфокатионитом, что указывает на то, что данный осадок является солью полученного конъюгата по карбоксильной группе. При конъюгации дихлорхинона 18 с 2 моль N-ацетил-L-цистеина в ацетоне из реакционной смеси выпадал осадок продукта монозамещения, что препятствовало эффективной конверсии дихлорхинона 18 в целевой бисцистеинилхинон 20, выход которого составил ~15 %. При проведении конденсации хинона 18 в смеси ацетонвода, в которой хорошо растворяется продукт монозамещения, выход дизамещенного продукта 20 составил 90%. Конъюгаты, полученные замещением атома хлора в хинонах 15 и 16, были идентичны веществам, полученным ранее из триалкилнафтазаринов 11 и 12. Cхема 2 OH O Me OH O Cl Me R OH O 15 R=Me, 16 R=Et 17 R=H, 18 R=Cl NAC-SH K2CO3 Me OH O S-NAC . . S-NAC Me Cl Me R OH OK A -KCl Me R OH O 13 R=Me (81%), 14 R=Et (96%) 19 R=H (73%), 20 R=NAC-S (90%) Строение соединений 19 и 20 было установлено методами ЯМР и ИКспектроскопии, как ранее для конъюгатов 13 и 14. В спектре бисцистеинильного конъюгата 20, вследствие симметрии молекулы, наблюдали двухпротонный синглет двух α-ОН групп при 13.15 м.д., уширенный синглет двух протонов карбоксигрупп при 12.89 м.д., дублет двух протонов -NH- групп при 8.27 м.д. с КССВ 8.2 Гц, мультиплет метиновых протонов при 4.33 с J = 4.7, 8.2, 8.7 Гц, а также два дублета дублетов метиленовых протонов -СH2-S- при 3.68 и 3.42 м.д. с КССВ 4.7, 8.7 и 13.6 Гц, все удвоенной интенсивности. В сильном поле наблюдали синглеты метильных и ацетильных групп с хим. сдвигом 2.22 и 1.76 м.д. соответственно. В масс-спектрах 8 соединений 19 и 20 наблюдали пики молекулярных ионов, с величинами соответствующими теоретически рассчитанным значениям. m/z, 1.3 Взаимодействие 2-гидрокси-3-замещенных 6,7-дихлорнафтазаринов с N-ацетил-L-цистеином На следующем этапе N-ацетил-L-цистеин конденсировали с 2-гидрокси6,7-дихлорнафтазаринами 21–23, хинонами, несущими β-гидроксильные группы, и получили конъюгаты N-ацетил-L-цистеина 24–26 (схема 3), структурно родственные известным биологически активным конъюгатам глутатиона 6–8. Схема 3 OH O Cl OH O OH Cl R OH O 21 R=H, 22 R=Me 23 R=Et NAC-SH, K2CO3 NAC-S . OH NAC-S R OH O 24 R=H (88%), 25 R=Me (80%) 26 R=Et (89%) Исходные хлорнафтазарины 21–23 имеют два вида гидроксилов: кислые хиноидные β-ОН группы (рК ~4-5) и фенольные α-ОН группы (рК ~10-12). При действии используемого в работе основания, β-гидроксильные группы образуют соответствующие соли, что ведет к повышению электронной плотности нафтазаринового ядра и оказывает сильное влияние на положение его таутомерного равновесия. В N-ацетил-L-цистеине под действием К2СО3 способны ионизироваться как карбоксильная СООН-группа (рК 3,24), так и меркаптогруппа SH (рК 9.52). Из этого следует, что для эффективной ионизации тиольной функции N-ацетилL-цистеина при его конденсации с соединениями 21–23 необходимо использовать бóльшее количество основания, чем для нафтазаринов, не содержащих β-гидроксильную группу. Соединение 21 легко реагировало с N-ацетил-L-цистеином, образуя бисцистеинильное производное 24, при этом следов образования трисцистеинильного продукта не наблюдали. По-видимому, это можно объяснить сильным электродонорным эффектом ионизированной β-гидроксильной группы нафтазарина, препятствующим присоединению тиола в положение 3 нафтазаринового ядра. В ИК-спектрах соединений 24–26 наблюдали полосы поглощения карбоксильной и амидной группы, а также карбонилов нафтазаринового ядра, в областях, описанных для ранее полученных конъюгатов 19 и 20. Спектры ЯМР 1Н веществ 24–26 были схожи со спектром соединения 20, содержащего два аминокислотных остатка. В спектре соединения 24 при 6.39 м.д. наблюдался синглет хиноидного протона нафтазаринового ядра. Для соединений 25 и 26 выбор в пользу таутомера с расположением β-гидроксила в хиноидном ядре сделан по аналогии с хиноном 24. Масс-спектры высокого разрешения конъюгатов 24–26 подтвердили брутто-формулу полученных веществ. 1.4 Взаимодействие N-ацетил-L-цистеина с полихлорированными нафтазаринами С целью получения водорастворимых трис- и тетракисацетилцистеинильных аналогов 2,3,6-тригидрокси-7-этилнафтазарина (эхинохрома) 2 и 2,3,6,7-тетра- 9 гидроксинафтазарина (спинохрома Е) 27 нами было изучено взаимодействие полихлорированных нафтазаринов 28–30 с N-ацетил-L-цистеином. Конденсацию полихлорированных соединений 28–30 с N-ацетил-L-цистеином проводили как ранее в смеси ацетон-вода при комнатной температуре. При этом с выходами 85-94 % были OH O OH O Et OH HO OH HO OH HO OH OH O OH O 2 эхинохром 27 спинохром Е получены трис- и тетракисацетилцистеинильные производные нафтазаринов 31–33 (схема 4). Реакция хинонов 29–30 с N-ацетил-L-цистеином протекала через быстрое образование продуктов моно- и ди- замещения, которые за 2-3 часа постепенно превращались в целевые трис- и тетракисзамещенные конъюгаты 31-33. ЯМР 1Н спектры веществ 31–33 также во многом были схожи со спектрами гидроксилсодержащих конъюгатов 24–26. Различие состояло в изменении интегральной интенсивности сигналов аминокислотного остатка, связанное с присоединением третьего (31, 32) либо четвертого (33) аминокислотного заместителя. Схема 4 OH O OH O R Cl Cl Cl NAC-SH, K2CO3 OH O 28 R=Me, 29 R=Et, 30 R=Cl R S-NAC NAC-S S-NAC OH O 31 R=Me (94%), 32 R=Et (93%) 33 R=NAC-S (85%) Для соединения 33 вследствие высокой симметрии молекулы в ЯМР 1Н спектре наблюдали единственный сигнал двух α-ОН групп нафтазаринового ядра и соответствующие сигналы протонов N-ацетилцистеинильного радикала – все учетверенной интенсивности. Высокая степень симметрии соединения 33 подтверждается и спектром ЯМР 13С, в котором наблюдается всего восемь сигналов атомов углерода, три из которых (110.68, 143.65 и 171.9 м.д.) принадлежат нафтазариновой части молекулы. В ИК-спектрах соединений 31–33 имеются характерные полосы поглощения амидной и карбоксильной группы, а также полосы поглощения карбонильных групп нафтазаринового ядра, практически совпадающие по частоте с полосами поглощения в спектрах веществ 24–26. Масс-спектры высокого разрешения соединений 31–33 показали наличие молекулярных ионов конъюгатов, значение m/z которых соответствовало теоретически рассчитанным для них величинам. 1.6 Синтез 3-метилфлавиолина и его метиловых эфиров Для разработки метода тиометилирования ароматического ядра гидрокси1,4-нафтохинонов N-ацетил-L-цистеином и последующего синтеза природных фибростатинов 34–39 нам предстояло синтезировать исходные нафтохиноны, повторяющие структуру нафтохиноидного ядра данных соединений. При получении фибростатинов B 35 и D 37 предпочтительно исходить из флавиолина 40 с его последующей конверсией в 3-метилфлавиолин 41 и ступенчатым 10 метилированием хинона 41 диазометаном в целевые 7-гидрокси-2-метокcи3-метилюглон 42 и 2,7-диметокси-3-метилюглон 43. Поскольку в литературе мы не обнаружили сведений о синтезе 3-метилфлавиолина 41, нами был разработан способ получения 41 радикальным метилированием флавиолина 40, который получали по известной методике с выходом ~60% из доступной динатриевой соли 1,8-дигидроксинафталин-3,6-дисульфокислоты. O H3C HO O O 3 R NH R S 3 1 OR1 R O R2 R2 O OH O OH O Фибростатины A-F A 34 R1=H, R2=Me, R3=OMe B 35 R1=OMe, R2=Me, R3=OMe C 36 R1=OMe, R2=H, R3=OMe D 37 R1=OMe, R2=Me, R3=OH E 38 R1=H, R2=CH2OH, R3=OMe F 39 R1=OMe, R2=CH2OH, R3=OMe 40 R1=R2=R3=H (флавиолин) 41 R1= R3=H, R2=Ме 42 R1=R2=Ме, R3=H 43 R1=R2=R3=Ме Для введения метильного радикала в положение 3 флавиолина 40 нами были опробованы несколько известных в литературе методов – различные вариации алкилирования диметилсульфоксидом – в присутствии безводного сульфата меди (II) в присутствии перекиси водорода, а также алкилирование перекисью ацетила. Схема 5 O HO Me O O OH DMSO H2O2 HO OH O 40 OH. HO OH Me OH O 44 (14%) OH O 41 (28%) Ac2O/ Py O O OAc DMSO AcO AcO OAc MeOH H2O2 OAc O 45 O Me OAc O OH. HO HCl . Me OH O 41 (25%) Метилирование хинона 40 диметилсульфоксидом в присутствии безводного сульфата меди (II) привело к осмолению реакционной смеси. Алкилирование системой ДМСОперекись водорода дало смесь 3-метилфлавиолина 41 и 8-метилфлавиолина 44 в соотношении 2:1 с выходами 28 и 14% соответственно (схема 5). Для увеличения выхода продуктов реакции и уменьшения осмоления реакционной смеси алкилированию подвергли триацетат флавиолина 45 с последующим гидролизом реакционной смеси в метаноле. В этом варианте получили единственный продукт 41, но выход его был меньше, чем в предыдущем случае, и составлял 25%. Наиболее успешной для получения 3-метилфлавиолина 41 оказалась методика радикального 11 алкилирования флавиолина 40 перекисью ацетила в кипящем ацетонитриле. В итоге требуемый 3-метилфлавиолин 41 был получен с выходом 70% в пересчете на вошедший в реакцию флавиолин (схема 6). Помимо этого из реакционной смеси был выделен продукт двойного алкилирования – 3,8-диметилфлавиолин 46 (6%). Было найдено, что наибольший выход хинона 41 достигается при ~50% конверсии исходного флавиолина. Дальнейшая конверсия хинона 40 приводит к снижению выхода целевого 3-метилфлавиолина 41 и увеличению доли 3,8-диметилфлавиолина 46. Схема 6 O HO Me O O OH Ac2O2 HO OH CH3CN / reflux OH. HO . Me Me OH O OH O OH O 40 41 (70%) 46 (6%) О-Метилирование хинона 41 проводили путем осторожной обработки его раствора в этилацетате диазометаном до полной конверсии исходного хинона. В итоге после разделения продуктов реакции препаративной ТСХ получили монометиловый эфир 42 (58%) и диметиловый эфир 3-метилфлавиолина 43 (37%). При полной конверсии хинона 42 выход диметилового эфира 43 составил 93%. O 2 OR1 R O 40 R1= R2=Н (флавиолин) 47 R1=Me, R2=H OH O 48 R1= R2=Me При обработке диоксанового раствора флавиолина 40 раствором диазометана были получены 7-гидрокси-2-метоксиюглон 47 (70%) и 2,7-диметоксиюглон 48 (9%), которые также были использованы в работе. При полной конверсии хинона 47 2,7-диметоксиюглон 48 был получен с выходом 73%. 1.7 Синтез 3-гидроксиметил-, 3-хлорметил-, 3-метоксиметил- и 3-ацетоксиметилпроизводных 2,7-диметоксиюглона Для формирования структуры фибростатинов E 38 и F 39 потребовалось разработать методы синтеза производных флавиолина, несущих -СН2-ОН группу в положении 3 хиноидного ядра. Данный заместитель может быть введен двумя способами: прямым гидроксиметилированием в положение 3 хиноидного ядра, либо косвенно, путем формирования галоидметильного заместителя -СН2Hal с последующей его конверсией в СН2-ОН группу. Замещение галогена в хлорметильной группе на ОН-группу может быть также осуществлено и после тиометилирования нафтохинона N-ацетил-L-цистеином. На первом этапе мы планировали получить 3-гидроксиметильные производные флавиолина, исходя из соответствующих метиловых эфиров 47 и 48. Известным методом введения гидроксиметильной группы в ароматические соединения является гидроксиметилирование радикалами ·СН2ОН, которые образуются из метанола под действием персульфата аммония при нагревании в присутствии солей переходных металлов. Данная реакция была хорошо изучена на различных производных пиридина 12 и хинолина, но не применялась в ряду 1,4-нафтохинонов. Так как было известно, что 2-гидрокси-3-гидроксиметильные производные 1,4-нафтохинонов легко отщепляют воду с образованием соответствующих орто-хинон-метидов, реакция была опробована на доступном метиловом эфире лаусона 49, в котором такая дегидратация затруднена. При кипячении раствора хинона 49 в смеси метанол-ацетонитрил (~1:1) в присутствии персульфата аммония и нитрата серебра наблюдали образование нового Схема 7 O O OMe OMe AgNO3, (NH4)2S2O8 CH3CN / MeOH reflux CH2OH O 50 (24%) O 49 полярного соединения желтого цвета. В ЯМР 1Н спектре данного вещества отсутствовал характеристический синглет хиноидного протона при 6.19 м.д. и наблюдался новый синглет при 4.39 м.д. с интенсивностью 2Н при сохранении сигналов соответствующих ароматических протонов Н5-Н8, что позволило приписать данному продукту строение 3-гидроксиметил-2-метокси-1,4-нафтохинона 50. Присутствие в ИК-спектре этого соединения полосы поглощения гидроксильной группы при 3490 см-1 и полос поглощения хиноидных карбонилов при 1677 см-1 находится в согласии с предложенной структурой. Наличие пика молекулярного иона [M-H]- с величиной m/z равной 217, окончательно подтвердило предложенную структуру 3-гидроксиметил-2-метокси-1,4-нафтохинона 50 (схема 7). R4 R R4 O 3 OMe R2 R 1 AgNO3, (NH4)2S2O8 R CH3CN / MeOH reflux R2 O O 3 OMe 1 R CH2OH O 1 49 Результаты гидроксиметилирования замещенных 2-метокси1,4-нафтохинонов 47, 49, 51, 54 Возврат Время 3-Гидроксиметил1 2 3 4 R R R R исходного реакции, хинон, (выход, %)* хинона, % час H H H H 23 12 50 (24) 2 51 OH H H H 18 8 52 (21) 3 47 OH H OH H 46 4,5 53 (52) 4 OH Me Me OH 41 54 *Выход на вошедший в реакцию хинон. 18 55 (42) Таблица 1. № Хинон С целью оценки возможностей данного подхода помимо метилового эфира лаусона 49 в реакцию радикального гидроксиметилирования ввели 2-метоксинафтохиноны группы юглона 47, 51 и нафтазарина 54 (таблица 1). Из 2-метоксиюглона 51 с низким выходом был получен соответствующий гидроксиметилхинон 52 (21%). Реакция 2-метоксипроизводного флавиолина 47 в 13 аналогичных условиях с выходом 52% привела к гидроксиметилхинону 53. Ввиду плохой растворимости 2,7-диметоксиюглона 48 в метаноле и ацетонитриле, непосредственное гидроксиметилирование хинона 48 провести не удалось. Таким образом, реакция радикального гидроксиметилирования замещенных 2-метоксипроизводных 1,4-нафтохинонов метанолом, хотя и протекает с выходами 21-52%, но, тем не менее, ввиду своей простоты, позволила нам быстро наработать препаративные количества соответствующих 3-гидроксиметильных производных нафтохинонов в одну стадию (табл. 1). Для разработки второго варианта схемы синтеза фибростатинов Е и F с использованием галогенметильных предшественников, потребовалось разработать метод введения галогенметильной группы в хиноидное ядро замещенных 2-гидрокси1,4-нафтохинонов. Однако использование наиболее распространенного метода введения галогенметильного радикала (-СН2-Hal) путем конденсации с формальдегидом и галогеноводородом не дало положительных результатов. Длительное кипячение флавиолина 40, параформа, и концентрированной соляной кислоты привело к возврату исходного хинона, а взаимодействие 40 с параформом в растворе HBr/AcOH в присутствии каталитических количеств серной кислоты сопровождалось сильным осмолением реакционной смеси. Введение хлорметильной группы в хиноидное ядро выполнили путем конверсии полученного нами ранее 3-гидроксиметильного производного 53, посредством его обработки тионилхлоридом. Схема 8 56 (66%) 53 57 (63%) Для получения соответствующего гидроксиметильного предшественника фибростатина F монометоксихинон 53 избирательно метилировали диазометаном без затрагивания гидроксильной группы при С-5 и получили диметиловый эфир 56 с выходом 66%, последующая обработка которого тионилхлоридом с добавкой пиридина в растворе дихлорметана дало целевой 3-хлорметилхинон 57 с выходом 63% (схема 8). Из хлорметилнафтохинона 57 при обработке ацетатом серебра было получено 3-ацетоксиметильное производное 58 (выход 80%), а обработка 57 метанольным раствором метилата натрия приводила к 3-метоксиметильному продукту 59 с выходом 82% (схема 9). Схема 9 O MeO CH2OAc OH O 58 (80%) O O OMe AgOAc MeO OMe MeONa / MeOH AcOH MeO OMe CH2OMe CH2Cl OH O 57 OH O 59 (82%) Таким образом, исходя из хлорметилнафтохинона 57 нами были получены 3-ацетоксиметил- и 3-метоксиметилхиноны 58 и 59, которые можно рассматривать как соединения с защищенной бензильной гидроксильной группой. 14 1.8 Разработка метода тиометилирования замещенных 2-гидрокси1,4-нафтохинонов N-ацетил-L-цистеином и параформом Следующая часть нашего исследования посвящена разработке метода синтеза ацетилцистеинильных производных 1,4-нафтохинонов, в которых аминокислотный остаток соединен с молекулой нафтохинона через метиленовое звено, как это наблюдается в природных фибростатинах 34–39. В соединениях такого типа атом двухвалентной серы отделен от хиноидного ядра метиленовой группой и π-орбитали атома серы не вступают в сопряжение с двойной связью хиноидного кольца и, следовательно, мало влияют на его электронную плотность и окислительновосстановительные свойства. Для этого вначале изучили взаимодействие модельного 2-гидрокси-1,4-нафтохинона 60 с N-ацетил-L-цистеином 9 и параформом в кипящем ацетоне при катализе муравьиной кислотой. Было найдено, что наилучшие результаты достигаются при молярном соотношении реагентов: хинон-ацетилцистеин-параформальдегид = 1:1.5:4. В результате из реакционной смеси выделили полярный продукт реакции с Rf = 0.65 и неполярный продукт с Rf = 0.95. По данным спектра ЯМР 1Н соединение с Rf = 0.65 содержало остаток N-ацетил-L-цистеина. Отсутствие сигнала хиноидного протона при С-3 и наличие соответствующих сигналов четырех протонов Н5-Н8 свидетельствовало о замещении в положение 3. В спектре полярного продукта реакции присутствовали два дублета при 3.55 и 3.64 м.д. с интенсивностью 2Н, аналогичные сигналам, наблюдаемым в спектрах фибростатинов 34–39, что позволило приписать полярному продукту структуру 61. Данные ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии хорошо согласуются с результатами ЯМР спектроскопии. В спектре ЯМР 1Н неполярного продукта с Rf = 0.95 также отсутствовал сигнал хиноидного протона и наблюдался синглет при 3.75 м.д. Сопоставление интегральной интенсивности сигналов протонов ароматической части при Н5-Н8 и синглета при 3.75 м.д. указывало на образование биснафтохинонметана 62. Наличие в масс-спектре соединения 62 молекулярного иона [M-H]- с массой 359 подтвердило предложенную структуру неполярного продукта, являющегося результатом реакции образующегося в ходе реакции хинон-метида и исходного гидроксинафтохинона. Для оценки применимости данного метода реакцию тиометилирования распространили на ряд 2-гидрокси-1,4-нафтохинонов 21, 40, 63, 66, 69, 76 и 79, несущих в бензольном кольце различные заместители: Сl, OH, OMe и Me группы. В аналогичных условиях проведения реакции с хорошими выходами были получены соответствующие конъюгаты хинонов с N-ацетил-L-цистеином 64, 67, 70, 72, 74, 77 и 80. Процесс тиометилирования хинонов сопровождался образованием незначительного количества биснафтохинонметанов 65, 68, 71, 73, 75, 78 и 81 (таблица 2). Можно предположить, что 2-гидрокси-1,4-нафтохиноны реагируют с параформальдегидом с образованием in situ реакционноспособных о-хинон-метидов, которые легко присоединяют серосодержащий нуклеофил - N-ацетил-L-цистеин, с образованием тиометилцистеинильных конъюгатов 61, 64, 67, 70, 72, 74, 77 и 80, а также менее активный исходный хинон, что и дает побочные продукты реакции бисхинонметаны 62, 65, 68, 71, 73, 75, 78 и 81. 15 R4 R O 3 OH R2 R1 O R4 R O 3 OH N-acetyl-L-cysteine HCOOH (CH2O)n R 4 R4 O R3 OH R2 R1 R4 O R3 NHAc N-acetyl-L-cysteine S O R2 COOH R1 O R2 acetone reflux H OH - H2O O O 1 O R4 O R O R3 R1 O Quinone R2 R3 R2 R 1 O OH Таблица 2. Кислотно-катализируемая реакция замещенных 2-гидрокси1,4-нафтохинонов с N-ацетил-L-цистеином и параформом № Хинон R1 R2 R3 R4 Время час 1 2 3 4 5 6 7 8 60 63 66 69 21 40 76 79 H OH H OH OH OH OH OH H H H H Cl H Me MeO H H H H Cl OH Me MeO H H OH OH OH H OH OH 6 4 4 5 8 6 8 8 Коньюгат ацетилцистеина Бисхинонметан № 61 64 67 70 72 74 77 80 № 62 65 68 71 73 75 78 81 Выход, % 85 72 80 74 82 80 83 78 Выход, % 3 5 3 4 5 4 4 6 Строение полученных соединений было установлено методами ИК-, ЯМРспектроскопии и масс-спектрометрии. ЯМР 1Н спектры соединений 64, 67, 70, 72, 74, 77 и 80 содержали сигналы аминокислотного остатка, аналогичные сигналам, наблюдаемым в спектре хинона 61. Следует отметить, что 2-метокси-1,4-нафтохинон 49 и 2-метокси5,7-дигидрокси-1,4-нафтохинон 47 были инертны в реакции тиометилирования N-ацетил-L-цистеином, что открывало возможность синтеза фибростатинов 34–39, в ароматическом ядре которых имеется 5-ОН группа, активирующая бензольное ядро к реакции тиометилирования. 1.9 Взаимодействие метиловых эфиров флавиолина и 3-метилфлавиолина с N-ацетил-L-цистеином и параформом. Синтез фибростатинов B, C, D и их аналогов При проведении реакции диметилового эфира флавиолина 48 с N-ацетилL-цистеином и параформом в ацетоне при катализе муравьиной кислотой было установлено, что тиометилацетилцистеинильное производное не образуется, а наблюдается возврат исходного хинона. Для вовлечения в реакцию хинона 48 были использованы более жесткие условия с применением высококипящих растворителей. Проведение реакции в растворе 85% муравьиной кислоты привело к полному осмолению реакционной смеси. При замене муравьиной кислоты на уксусную также наблюдалось частичное осмоление и образование нового полярного продукта реакции. По данным спектра ЯМР 1Н это соединение содержало сигналы тиометилацетилцистеинильного фрагмента, аналогичные сигналам протонов для соединений 61, 64, 67, 70, 72, 74, 77 и 80, а также синглеты хиноидного и 16 ароматического протонов при 6.27 и 7.16 м.д. соответственно. Методом массспектрометрии была установлена его молекулярная масса, соответствующая соединению состава C18H19NO8S. Сравнение ЯМР 1Н и 13С спектров природного фибростатина С 36 со спектрами вновь полученного соединения показало их полную идентичность. Выход фибростатина С 36 в данных условиях составил 28%. При увеличении продолжительности реакции наблюдали сильное осмоление реакционной смеси. С целью предотвращения осмоления и повышения выхода фибростатина С 36 в качестве растворителя был использован 1,4-диоксан с температурой кипения 101 ºС, а доля уксусной кислоты было уменьшена до каталитических количеств. Для уменьшения возгонки параформа в реакционную среду помимо 1,4-диоксана добавляли воду. Было показано, что в новых условиях резко уменьшается осмоление реакционной смеси, однако кроме целевого фибростатина С 36, образуется новое более полярное производное. Продолжительное кипячение приводило к быстрой конверсии фибростатина С в этот полярный продукт, что вело к снижению выхода фибростатина С и не позволило полностью конвертировать исходный хинон в нужный продукт реакции 36. Схема 10 O O MeO OMe NAC-SH MeO O OMe MeO OMe (CH2O)n OH O 48 NAC-S OH O 36 (46%) NAC-S OH O S-NAC 82 (7%) В спектре ЯМР 1Н нового полярного производного отсутствовал характеристический хиноидный протон при С-3 и наблюдался единственный синглет ароматического протона с хим. сдвигом 7.18 м.д., который совпадал с таковым для фибростатина С 36. В спектре наблюдали сигналы двух аминокислотных остатков, аналогичные сигналам ацетилцистеинильной части фибростатина С. Эти данные позволили приписать выделенному конъюгату структуру бистиометилацетилцистеинильного производного 82. Молекулярная масса хинона 82, установленная методом масс-спектроскопии, соответствует предложенной структуре. Было найдено, что оптимальными условиями проведения реакции является кипячение реакционной смеси в течение 18 часов, при этом выход фибростатина С 36 составил 46%, а соединения 82 7% (схема 10), при возврате 42% исходного хинона 48. Увеличение времени реакции до 23 часов приводило к уменьшению выхода моноцистеинильного производного 36 до 32% и образованию трудноразделяемой смеси полярных продуктов реакции. Реакция монометилового эфира флавиолина 47 в этих условиях приводила к образованию аналога фибростатина С 83 (55%) со свободной гидроксильной группой. В спектре ЯМР 1Н соединения 83 наблюдались сигналы хиноидного и ароматического протонов со значениями хим. сдвига близкими к сигналам аналогичных протонов фибростатина С 36. Это подтверждает, что тиометилирование 47, как и в случае диметилового эфира флавиолина 48, протекает по положению 6 ароматического кольца нафтохинона. Тиометилирование моно- и диметилового эфиров 3-метилфлавиолина 42 и 43 в разработанных нами условиях протекало медленнее с образованием продуктов монозамещения. ЯМР 1Н спектры этих веществ содержали сигналы протонов одного 17 аминокислотного остатка и сигналы ароматических протонов с хим. сдвигом 7.04 и 7.15 м.д. соответственно. Полное совпадение сигналов в спектрах ЯМР 1Н и 13С синтезированных моноконьюгатов со спектрами природных фибростатинов B и D, позволило приписать им структуры 35 и 37. По данным ТСХ оба метиловых эфира 42 и 43 реагировали с приблизительно одинаковой скоростью, однако, несмотря на избыток реагентов, в обоих случаях достичь полной конверсии исходного хинона не представилось возможным вследствие накопления трудноотделяемых продуктов осмоления (таблица 3). O O 2 R OMe R1 R2 NAC-SH, (CH2O)n dioxane / AcOH reflux OMe R1 NAC-S OH O Таблица 3. O R2 OMe NAC-S OH O OH O S-NAC Взаимодействие метиловых эфиров флавиолина и 3-метилфлавиолина с N-ацетил-L-цистеином и параформом. Синтез фибростатинов B, C, D и их аналогов Время МоноацетилцистеинильБисацетилцистеинильный R1 R2 час ный конъюгат (выход, %) конъюгат (выход, %) № Хинон 1 51 Н Н 39 84 (41) - 2 42 Ме ОН 39 37 (57) фибростатин D - 3 43 Ме ОМе 39 35 (50) фибростатин B - 4 47 Н ОН 43 83 (55) - 5 48 Н ОМе 18 36 (46) фибростатин С 82 (7) В аналогичных условиях тиометилирование 2-метоксиюглона 51, содержащего в ароматическом ядре только одну α–ОН группу, дало единственный продукт 84 (таблица 3). 1.10 Взаимодействие метиловых эфиров 3-гидроксиметил-, 3-хлорметил-, 3-ацетоксиметил- и 3-метоксиметилфлавиолина с N-ацетил-L-цистеином и параформом Для синтеза фибростатина F 39 нами была исследована реакция конденсации 3-гидроксиметильного производного диметоксиюглона 56 с N-ацетил-L-цистеином и параформом в среде диоксана. Мы полагали, что реакция хинона 56 будет протекать по положению 6. Однако N-ацетил-L-цистеин реагировал с хиноном 56 значительно быстрее, чем с хинонами 42, 43, 47 и 48. В итоге с выходом 52% был получен единственный продукт реакции 85. Схема 11 O O MeO OMe AcOH OMe 56 MeO OMe -H2O CH2OH OH O OH O O O MeO H O + H MeO OMe NAC-SH CH2+ OH O 86 OH O S-NAC 85 (52%) По данным спектра ЯМР 1Н, выделенное соединение 85 представляло собой продукт замещения гидроксила –СН2ОН группы на тиольную функцию N-ацетилL-цистеина. По-видимому, в условиях реакции тиометилирования, бензильный 18 гидроксил хинона 56 легко протонируется, теряет воду с образованием карбокатиона 86, который, взаимодействуя с N-ацетил-L-цистеином, дает конъюгат 85 (схема 11). Ранее, при тиометилировании 2-гидрокси-6,7-дихлорнафтазарина 21 N-ацетилL-цистеином в ацетоне, при катализе HCOOH (таблица 2, строка 5), наблюдали, что подвижные атомы хлора нафтазаринового ядра были инертны к замещению –SH группой ацетилцистеина. Данный факт давал основание считать, что тиометилирование диметилового эфира 3-хлорметилфлавиолина 57 пройдет по положению 6 ароматического ядра, а последующий гидролиз ожидаемого продукта реакции 87 позволит получить фибростатин F 39 (схема 12). Схема 12 O MeO O OMe NAC-SH MeO (CH2O)n OH O O OMe NAC-SH, (CH2O)n 39 CH2Cl NAC-S OH O 85 (44%) OMe OH - X CH2Cl S-NAC MeO 57 OH O 87 Хлорметилхинон 57 реагировал с N-ацетил-L-цистеином медленнее, чем гидроксиметилхинон 56, но и он, к нашему сожалению, дал единственный продукт реакции – уже известный конъюгат 85 с выходом 44 %. Поэтому, было решено ввести в реакцию тиометилирования хиноны 58 и 59 с защищенной гидроксиметильной группой, менее склонные к образованию карбкатиона 86. Реакция 3-ацетоксиметильного производного 58 протекала за три часа и также приводила к единственному продукту реакции. По данным спектроскопии ЯМР, образовавшийся хинон является продуктом замещения ацетоксигруппы на остаток N-ацетил-L-цистеина и соответствует ранее полученному конъюгату 85. Выход соединения 85 составил 89%. Конверсия метоксиметильного производного 59 в условиях реакции тиометилирования происходила в течение 18 часов и приводила к двум полярным окрашенным веществам, выделенным нами в предшествующих синтезах. По данным спектроскопии ЯМР 1Н эти вещества представляли собой монои бисцистеинильные конъюгаты 85 и 82. Выходы продуктов реакции составили 68 и 21% соответственно. Таким образом, вследствие высокой нуклеофильности тиольной группы N-ацетил-L-цистеина, реакция тиометилирования соединений 56–59 приводит к 3-тиометилцистеинильному конъюгату 85 - изомеру фибростатина С 36. 1.11 Синтез водорастворимых бисглутатионильных конъюгатов гидроксиалкилнафтазаринов в системе ацетон-вода Ранее разработанная методика синтеза бисглутатионильных конъюгатов 6–8, показавших кардиопротективный эффект, не уступающий эхинохрому, предполагает использование в качестве растворителя больших объемов токсичного метанола и фторидов щелочных металлов, разрушающих стеклянную аппаратуру. Схема 13 OH O Cl OH O OH 2GSH Cl R OH O 21 R=Н, 22 R= Ме, 23 R=Et acetone / H2O K2CO3 GS OH GS R OH O 6 R= Ме, 7 R=Et, 88 R=Н 19 Для получения соединений 6-8 нами было предложено в качестве реакционной среды использовать систему ацетон-вода, успешно примененную ранее для синтеза ацетилцистеинильных производных 24–26. Смесь ацетон-вода хорошо растворяла как исходные нафтазарины, так и глутатион, а также карбонат калия, использованный для ионизации тиольной группы глутатиона взамен фторида калия. В предложенных условиях происходила полная конверсия исходных хлорхинонов 21–23 в Таблица 4. Синтез водорастворимых бисглутатионильных конъюгатов гидроксиалкилнафтазаринов в системе ацетон-вода Хинон 21 22 23 Время реакции, час ацетон-вода метанол Бисглутатионилнафтазарин 2 2 2 24 24 88 6 7 Выход, % ацетон-вода метанол 87 94 88 78 82 бисглутатионильные производные 6, 7 и 88, которые были выделены с выходами 87-94% (схема 13, таблица 4). Таким образом, предложенный нами вариант синтеза бисглутатионильных конъюгатов 6, 7 и 88 позволяет быстро нарабатывать эти соединения в больших количествах с использованием нетоксичных и дешевых растворителей и реагентов. 2. Изучение цитотоксической и антирадикальной активности вновь полученных N-ацетил-L-цистеинильных и глутатионильных конъюгатов ряда нафтазарина Полученные соединения 13, 14, 19, 20, 24-26, 31–33, 70, 72, 77, и 80, в которых остаток N-ацетил-L-цистеина соединен напрямую по атому серы с нафтохиноидным ядром либо через метиленовое звено, были исследованы на наличие цитотоксической активности. Измерения проводились на клетках карциномы Эрлиха с помощью МТТ теста и теста с применением трипанового синего. Было установлено, что эти соединения нетоксичны в опытах in vitro в концентрациях ≤ 100 мкМ. Для вновь синтезированных N-ацетил-L-цистеинильных производных группы нафтазарина была изучена антирадикальная активность, которая оценивалась по способности исследуемого вещества обесцвечивать окрашенный дифенилпикрилгидразильный радикал. В качестве веществ сравнения были выбраны эхинохром, аскорбиновая, и галловая кислоты. В таблице 5 представлены данные, полученные при тестировании N-ацетилL-цистеинильных производных нафтазарина в 96% этаноле. В ряду изученных соединений аминокислотные производные, не имеющие β-гидроксильных групп в структуре нафтазаринового ядра, были практически неактивны в концентрациях до 130 мкМ включительно. Среди них наибольшую способность ингибировать дифенилпикрилгидразильный радикал показал тетракис-S-(N-ацетил-L-цистеинил)нафтазарин 33, который при концентрации 130 мкМ инактивировал DPPH радикал на 33%. Более высокую антирадикальную активность показали вещества 24-26, 70, 72, 77, 80, несущие β-гидроксильную группу в хиноидном ядре, а среди них - бис-S-(Nацетил-L-цистеинил)нафтазарины 24-26, структурно родственные соответствующим бисглутатионильным производным 6, 7, показавшим высокую кардиопротективную активность in vivo. Несколько меньшую активность проявили аминокислотные производные нафтазарина 70, 72, 77, 80, в которых S-ацетилцистеинильный радикал 20 21 22 был присоединен к нафтазариновому ядру через метиленовое звено. Среди них максимальная инактивация радикала (50.9%) отмечена для 6,7-диметоксипроизводного 80 при концентрации 130 мкМ. Представлялось теоретически интересным и практически важным провести прямое сравнение антирадикальной активности бисглутатионильных производных 6, 7, ранее показавшим высокую кардиопротективную активность in vivo, со структурно родственными бисS-(N-ацетил-L-цистеинил)нафтазаринами 24-26. Поскольку бисглутатионильные производные 6, 7 и 88 не растворялись в 96% этаноле, для проведения сравнительных испытаний использовали 30% водный этанол, в котором растворялись как глутатионильные 6, 7 и 88 и ацетилцистеинильные 24-26 производные, так и эхинохром 2, который использовали для сравнения. Помимо вышеупомянутых групп соединений для исследования были отобраны наиболее гидрофильные трис- и тетракисзамещенные ацетилцистеинильные производные 31-33, а также производное диметоксинафтазарина 80. Полученные данные представлены в таблице 6. Применение 30% водного этанола для проведения тестов привело к увеличению антирадикальной активности всех изученных соединений в ~2-9 раз. Так, ранее неактивные трис - и тетракисацетилцистеинильные производные 3133, при концентрации 130 мкМ ингибировали DPPH радикал на 53-63% (~9-кратное увеличение активности). Для остальных веществ активность увеличилась в ~1.5 - 2 раза, и, что следует особо отметить, эти вещества стали более эффективными в концентрациях 5-10 мкМ. Сопоставляя данные по антирадикальной активности, полученные в 30% водном этаноле для глутатионильных 6, 7 и 88 и ацетилцистеинильных 24-26 производных, можно констатировать, что обе группы соединений проявляют сходную активность во всем диапазоне исследованных концентраций. Среди вновь синтезированных N-ацетил-L-цистеинильных производных нафтазарина наиболее перспективными для проведения дальнейших исследований in vivo являются легкодоступные нетоксичные тетракисацетилцистеинилнафтазарин 33 и 2-гидрокси3-метил-6,7-бисацетилцистеинилнафтазарин 25. ВЫВОДЫ: 1. Впервые систематически изучено взаимодействие моно-, бис-, трис-, и тетрахлорзамещенных производных нафтазарина с N-ацетил-L-цистеином, протекающее под действием карбоната калия. Установлены оптимальные условия проведения реакции. Синтезирована группа новых моно-, бис-, трис-, и тетразамещенных N-ацетил-L-цистеинильных производных ряда нафтазарина, структурно родственных эхинохрому и другим биологически активным пигментам морских ежей. 2. Разработан новый кислотно-катализируемый метод тиометилирования замещенных 2-гидрокси-1,4-нафтохинонов N-ацетил-L-цистеином и параформальдегидом. Впервые синтезирован ряд 3-гидрокси-2-тиометилN-ацетил-L-цистеинильных производных 1,4-нафтохинонов, природных фибростатинов В, С, D и родственных соединений. 23 3. Разработаны методы синтеза 3-метил-, 3-гидроксиметил-, 3-хлорметил-, 3-ацетоксиметил-, и 3-метоксиметилпроизводных 2,7-диметоксиюглона и родственных соединений. 4. Изучена реакционная способность вновь синтезированных 3-гидроксиметил-, 3-хлорметил-, 3-ацетоксиметил-, и 3-метоксиметилпроизводных 2,7-диметоксиюглона в условиях реакции тиометилирования гидроксинафтохинонов N-ацетилL-цистеином. Установлено, что при катализе уксусной кислотой функциональные группы 3-метилзамещенных радикалов легко замещаются остатком N-ацетилL-цистеина. 5. Предложена улучшенная методика синтеза биологически активных 2,3-S,S'бисглутатионил-7-алкил-5,6,8-тригидрокси-1,4-нафтохинонов с использованием доступных и нетоксичных реагентов. 6. Изучена антирадикальная активность вновь полученных N-ацетилL-цистеинильных производных ряда нафтазарина по способности обесцвечивать окрашенный дифенилпикрилгидразильный радикал. Найдены перспективные малотоксичные водорастворимые производные нафтазарина для исследований in vivo. Публикации по теме диссертации 1. Сабуцкий Ю.Е., Полоник Н.С., Денисенко В.А., Дмитренок П.С., Полоник С.Г. // Синтез водорастворимых конъюгатов производных нафтазарина (5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинона) с N-ацетил-L-цистеином // Журн. орган. химии. 2013. Т. 49, № 8. С. 1157-1164. 2. Сабуцкий Ю.Е., Полоник С.Г. // Синтез водорастворимых бисглутатионильных конъюгатов 7-алкил-5,6,8-тригидрокси-1,4-нафтохинонов // Журн. орган. химии. 2014. Т. 50, № 5. С. 765-766. 3. Sabutskii Yu.E., Polonik S.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S. // A new method of thiomethylation of hydroxy-1,4-naphthoquinones by N-acetyl-L-cysteine; First synthesis of fibrostatins B, C and D // Synthesis. 2014. Vol. 46, № 20. P. 2763-2770. Тезисы конференций 1. Сабуцкий Ю. Е., Юрченко Е. А., Менчинская Е. С., Полоник Н. С. «Синтез и свойства N-ацетил-L-цистеинильных производных ряда нафтазарина, структурно родственных биологически активным пигментам морских ежей» // Всероссийская молодежная конференция «Актуальные проблемы органической химии», сборник трудов, Новосибирск, 2012. C. 100. 2. Сабуцкий Ю.Е., Полоник Н.С. «Синтез водорастворимых 6,7диглутатионильных производных 2-гидрокси-3-алкилнафтазаринов» // XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, сборник трудов, Владивосток, 2012. C. 46. 3. Sabutskii Yu.E., Polonik S.G. «A new method of thiomethylation of hydroxy-1,4naphthoquinones by N-acetyl-L-cysteine. First synthesis of fibrostatins B, C and D» // 2nd International symposium on life sciences, Vladivostok, 2013. P. 31. 4. Сабуцкий Ю.Е., Полоник С.Г. «Разработка подходов к синтезу фибростатина F» // VI Международный симпозиум «Химия и химическое образование», сборник трудов, Владивосток, 2014, С. 46-47.
