Å. Â. Äîðîæêî, Å. È. Êîðîòêîâà ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÀÍÒÈÎÊÑÈÄÀÍÒÍÛÕ ÑÂÎÉÑÒ ÂÎËÜÒÀÌÏÅÐÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ È ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ

Êîëëåêòèâ àâòîðîâ, 2010
Å. Â. Äîðîæêî, Å. È. Êîðîòêîâà
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÀÍÒÈÎÊÑÈÄÀÍÒÍÛÕ ÑÂÎÉÑÒÂ
ÁÈÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈ ÀÊÒÈÂÍÛÕ ÑÅÐÓÑÎÄÅÐÆÀÙÈÕ ÑÎÅÄÈÍÅÍÈÉ
ÂÎËÜÒÀÌÏÅÐÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ È ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÈÌ
ÌÅÒÎÄÀÌÈ
Òîìñêèé ïîëèòåõíè÷åñêèé óíèâåðñèòåò, Òîìñê, Ðîññèÿ, [email protected], [email protected].
Áèîëîãè÷åñêè-àêòèâíûå ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ (ÁÀÑÑ) ïðîÿâëÿþò âûðàæåííûå
àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà. Îñîáîå ìåñòî ñðåäè ýòèõ ñîåäèíåíèé çàíèìàþò ãëóòàòèîí,
öèñòåèí, öèñòèí, ìåòèîíèí, òàóðèí è ëèïîåâàÿ êèñëîòà.  ðàáîòå èñïîëüçîâàëñÿ âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé ìåòîä äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ. Ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä èñïîëüçîâàëè äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ. Âñå èññëåäóåìûå ÁÀÑÑ â òîé èëè èíîé ñòåïåíè ïðîÿâèëè àíòèîêñèäàíòíóþ àêòèâíîñòü. Ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí ïîêàçàëè íàèáîëüøèå çíà÷åíèÿ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ëèòåðàòóðíûì äàííûì. Ìåòèîíèí ïðîÿâèë ìèíèìàëüíóþ àíòèîêñèäàíòíóþ àêòèâíîñòü îòíîñèòåëüíî äðóãèõ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ. Äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ
ðåçóëüòàòîâ áûë ïðèìåíåí ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè
ÁÀÑÑ, âûðàæåííûé â åäèíèöàõ ORAC (oxygen radical absorbance capacity), îòíîñèòåëüíî
ãëóòàòèîíà, êàê ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà. Ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèì è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì ìåòîäàìè, êîððåëèðîâàëè ìåæäó ñîáîé.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ, àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà, ñïåêòðîôîòîìåòðèÿ, âîëüòàìïåðîìåòðèÿ
Âàæíóþ ðîëü â ðåãóëÿöèè ñâîáîäíî-ðàäèêàëüíûõ
ïðîöåññîâ îðãàíèçìà èãðàþò áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå
ñåðóñîäåðæàùèå ñîåäèíåíèÿ (ÁÀÑÑ), àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà êîòîðûõ ïðîÿâëÿþòñÿ çà ñ÷åò íàëè÷èÿ
òèîëîâûõ ãðóïï â ñòðóêòóðàõ ìîëåêóë [1, 2]. Îñîáîå
ìåñòî ñðåäè ýòèõ ñîåäèíåíèé çàíèìàþò ãëóòàòèîí, öèñòåèí, öèñòèí, ìåòèîíèí è ëèïîåâàÿ êèñëîòà (ðèñ. 1).
Òàóðèí ñîäåðæèò âìåñòî òèîëîâîé ãðóïïû ñóëüôîãðóïïó è òàêæå îòíîñèòñÿ ê ÁÀÑÑ (ðèñ. 1).
Àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ïðåäñòàâëåííûõ âåùåñòâ ïîçâîëÿþò èñïîëüçîâàòü èõ äëÿ ïðîôèëàêòèêè è
ëå÷åíèÿ ðÿäà çàáîëåâàíèé [3].
 íàñòîÿùåå âðåìÿ äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè (ÀÎÀ) ÁÀ ñóùåñòâóåò íåñêîëüêî ìåòîäîâ. Áîëüøèíñòâî èç íèõ îñíîâàíî íà îöåíêå ñòåïåíè èíãèáèðîâàíèÿ ìîäåëüíûõ ñâîáîäíî-ðàäèêàëüíûõ
ðåàêöèé, âûçâàííûõ ðàäèêàëàìè ïåðåêèñíûõ ëèïèäîâ,
â ïðèñóòñòâèè àíòèîêñèäàíòîâ õåìèëþìèíåñöåíòíûì
(ÕË), êèíåòè÷åñêèì, ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèì è äðóãèìè ìåòîäàìè [4 – 7].  ïîñëåäíåå âðåìÿ äëÿ äàííûõ
öåëåé ñòàëè èñïîëüçîâàòüñÿ ýëåêòðîõèìè÷åñêèå ìåòîäû àíàëèçà: êóëîíîìåòðè÷åñêîå òèòðîâàíèå, ïîëÿðîãðàôèÿ, âîëüòàìïåðîìåòðèÿ, àìïåðîìåòðèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì áèîñåíñîðîâ è ò.ä. Îíè õàðàêòåðèçóþòñÿ âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ, ýêñïðåññíîñòüþ è ïðîñòîòîé â àïïàðàòóðíîì îôîðìëåíèè [8 – 11].
Îäíàêî, íåñìîòðÿ íà ìíîãîîáðàçèå ìåòîäîâ îïðåäåëåíèÿ ÀÎÀ âåùåñòâ, ìíîãèå âîïðîñû îñòàþòñÿ íåðåøåííûìè: íåñîïîñòàâèìîñòü ðåçóëüòàòîâ èññëåäîâàíèé,
âûïîëíåííûõ ðàçíûìè ìåòîäàìè íà ðàçíûõ ìîäåëüíûõ
ñèñòåìàõ, íåîäíîçíà÷íîñòü ìåõàíèçìîâ àíòèîêñèäàíòíîãî äåéñòâèÿ âåùåñòâ, âëèÿíèå ðÿäà ôàêòîðîâ íà àêòèâíîñòü èññëåäóåìûõ âåùåñòâ, îòñóòñòâèå åäèíîãî
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010
êðèòåðèÿ è ðàçìåðíîñòè äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ ÀÎÀ îáúåêòîâ èññëåäîâàíèÿ.
 äàííîé ðàáîòå ïðåäëàãàåòñÿ èñïîëüçîâàòü âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé ìåòîä äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ, îñíîâàííûé íà ìîäåëüíîé
ðåàêöèè ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà [12]. Äëÿ îáúåêòèâíîñòè ïîëó÷åííûõ äàííûõ è ñðàâíåíèÿ ðåçóëüòàòîâ
èñïîëüçîâàëñÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä [13].
Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü
Äëÿ ñúåìêè âîëüòàìïåðîãðàìì èñïîëüçîâàëñÿ àâòîìàòèçèðîâàííûé âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèé àíàëèçàòîð
“Àíàëèçàòîð ÀÎÀ” (“ÍÏÏ Ïîëèàíò”, Òîìñê) ñ ïîäêëþ÷åííîé ê íåìó ýëåêòðîõèìè÷åñêîé ÿ÷åéêîé
(10 ìë), ñîñòîÿùåé èç èíäèêàòîðíîãî ýëåêòðîäà —
ñòåêëîãðàôèòîâîãî, õëîðèä-ñåðåáðÿíîãî ýëåêòðîäà
ñðàâíåíèÿ è âñïîìîãàòåëüíîãî ýëåêòðîäà. pH ðàñòâîðîâ èçìåðÿëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ñòàíäàðòíîãî pH-ìåòðà ìàðêè Ì-150. Äëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ èñïîëüçîâàëè ñïåêòðîôîòîìåòð “ÑÔ-46”. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëèñü â êþâåòå äëèíîé 1 ñì.
Äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ èññëåäóåìûõ ðàñòâîðîâ èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûå îáðàçöû ãëóòàòèîíà, öèñòåèíà,
öèñòèíà, ìåòèîíèíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà —
ïîðîøêîîáðàçíûå âåùåñòâà áåëîãî öâåòà (Sigma). Ðàñòâîðû ãëóòàòèîíà, öèñòåèíà, ìåòèîíèíà, öèñòèíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà ãîòîâèëèñü ñ èñïîëüçîâàíèåì ôîñôàòíîãî áóôåðà 0,025 ìîëü/ë pH = 6,86 (ýêâèìîëÿðíàÿ ñìåñü Na3PO4 è KH2PO4). Ðàñòâîðû öèñòèíà
è ëèïîåâîé êèñëîòû äëÿ ïîëíîãî ðàñâîðåíèÿ ïîäêèñëÿëè íåñêîëüêèìè êàïëÿìè àçîòíîé êèñëîòû (1:1).
Äëÿ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ ãîòîâèëè ðåàêöèîííóþ ñìåñü íà 10 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà
53
OH
CH
HS
HO
C
CH2
OH
C
O
O
NH2
Öèñòåèí
CH2
CH
NH2
CH2
S S
C
CH O
NH2
OH
H3C
CH2
CH2
2
3
30
1
4
Öèñòèí
20
HO
S
I, ìêÀ
40
C
CH O
NH2
Ìåòèîíèí
CH2 (CH2)4 OH
C
CH2 CH
O
S S
Ëèïîåâàÿ êèñëîòà
C
O
NH2
OH
NH C
CH
NH
CH2 O
C
(CH2)2
O
CH
C
CH2
O
SH
Ãëóòàòèîí
O CH2 NH
2
HO S
CH2
O
Òàóðèí
Ðèñ. 1. Ñòðóêòóðíûå ôîðìóëû öèñòåèíà, öèñòèíà, ìåòèîíèíà,
ãëóòàòèîíà, ëèïîåâîé êèñëîòû è òàóðèíà.
pH = 6,86. Ñìåñü ñîñòîÿëà èç 0,1 ìã ôåíàçèíìåòàñóëüôàòà (ÔÌÑ, Sigma), 14,2 ìã âîññòàíîâëåííîé ôîðìû
íèêîòèíàìèäàäåíèíäèíóêëåîòèäà (ÍÀÄÍ, Sigma) è
4 ìã íèòðîñèíèÿ òåòðàçîëèÿ (ÍÑÒ, Sigma). Çàòåì îòáèðàëè àëèêâîòó (0,1 ìë) ðåàêöèîííîé ñìåñè è âíîñèëè
â êþâåòó. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ïðè äîáàâëåíèè â êþâåòó 0,9 ìë ôîñôàòíîãî áóôåðà pH = 6,86 [13].
Ìåòîäèêà îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀÑÑ ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè. 10 ìë
ôîñôàòíîãî áóôåðà ïîìåùàëè â ýëåêòðîõèìè÷åñêóþ
ÿ÷åéêó. Èññëåäîâàíèå àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ
îñóùåñòâëÿëè ïðè ïîìîùè ðåãèñòðàöèè âîëüòàìïåðîãðàìì êàòîäíîãî âîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà áåç è ñ
ïîñëåäóþùèì äîáàâëåíèåì ðàñòâîðîâ èññëåäóåìûõ
âåùåñòâ ïðè ïîñòîÿííîòîêîâîé âîëüòàìïåðîìåòðèè
ïðè ñëåäóþùèõ óñëîâèÿõ: èíäèêàòîðíûé ýëåêòðîä —
ñòåêëîãðàôèòîâûé, ýëåêòðîä ñðàâíåíèÿ — õëîðñåðåáðÿíûé, âñïîìîãàòåëüíûé — õëîðñåðåáðÿíûé, îáëàñòü
ïîòåíöèàëîâ E = îò 0 äî –1,2 Â. Ñêîðîñòü ðàçâåðòêè
ïîòåíöèàëà — 0,04 Â/ñ.
Ìåòîäèêà îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀCC ìåòîäîì ñïåêòðîôîòîìåòðèè. Èññëåäîâàíèå àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀCC îñóùåñòâëÿëè
10
5
0
0
0,2
0,4
0,6
E, Â
0,8
1,0
1,2
Ðèñ. 2. Âîëüòàìïåðîãðàììû òîêà ÝÂ Î2: (1) — â ôîíîâîì ýëåêòðîëèòå (ôîñôàòíûé áóôåð pH 6,86) è â ïðèñóòñòâèè ãëóòàòèîíà C = 1 × 10 – 5 ìîëü/ë (2 ), C = 5 × 10 – 5 ìîëü/ë, (3 )
C = 8 × 10 – 5 ìîëü/ë (4 ); ëèíèÿ îñòàòî÷íîãî (ôîíîâîãî) òîêà â
îòñóòñòâèå êèñëîðîäà â ðàñòâîðå (5 ). Ñêîðîñòü ðàçâåðòêè ïîòåíöèàëà — 0,04 Â/ñ.
ïóòåì èçìåðåíèÿ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðåàêöèîííîé
ñìåñè áåç äîáàâëåíèÿ è ñ ïîñëåäóþùèì äîáàâëåíèåì
èññëåäóåìûõ âåùåñòâ ïðè äëèíå âîëíû 540 íì.
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
Äëÿ èññëåäîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòíûõ ñâîéñòâ ÁÀÑÑ
ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè èñïîëüçîâàëàñü ìîäåëüíàÿ ðåàêöèÿ ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà (ÝÂ
O2), ïðîòåêàþùàÿ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå â
îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ îò 0 äî –1,2  ïî ìåõàíèçìó, àíàëîãè÷íîìó âîññòàíîâëåíèþ êèñëîðîäà â æèâûõ êëåòêàõ [14].
k
O2 + e– D k O2·–
(1)
O2·– + H+ D HO2·
(2)
HO2·– + Í+ + e– D H2O2
(3)
H2O2 + 2H+ + 2e– D 2H2O
(4)
Ïðè ââåäåíèè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé â ýëåêòðîõèìè÷åñêóþ ÿ÷åéêó òîê Ý O2 ïåðâîíà÷àëüíî âîçðàñòàåò â ñâÿçè ñ ðåçêèì ñìåùåíèåì ðàâíîâåñèÿ â ñòîðîíó îáðàçîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí ðàäèêàëà O2·–, à
çàòåì óìåíüøàåòñÿ ïðè ïîñëåäóþùèõ äîáàâêàõ âåùå-
Òàáëèöà 1
Çíà÷åíèÿ êîýôôèöèåíòîâ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé è íåêîòîðûõ ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ (n = 3)
Ñîåäèíåíèå
Àñêàðáèíîâàÿ êèñëîòà
Äèãèäðîêâåðöåòèí
Ñåëèíèò íàòðèÿ
Ãëóòàòèîí
Öèñòåèí
Öèñòèí
Ìåòèîíèí
Ëèïîåâàÿ êèñëîòà
Òàóðèí
54
K, ìêìîëü/ë × ìèí
1,15 ± 0,04
0,65 ± 0,03
1,28 ± 0,02
4,35 ± 0,03
3,44 ± 0,05
2,81 ± 0,03
1,02 ± 0,03
4,86 ± 0,02
2,30 ± 0,04
Òàáëèöà 2
Çíà÷åíèå % áëîêèðîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ êèñëîðîäà ñåðóñîäåðæàùèìè àíòèîêñèäàíòàìè è êðèòåðèÿ IC50
(n = 3)
Ñîåäèíåíèå
Ãëóòàòèîí
Öèñòåèí
Öèñòèí
Ìåòèîíèí
Ëèïîåâàÿ êèñëîòà
Òàóðèí
% áëîêèðîâàíèÿ
17,80 ± 0,04
12,87 ± 0,02
8,33 ± 0,03
2,65 ± 0,02
19,32 ± 0,05
8,34 ± 0,07
IC 50 × 10 – 3 , ìîëü/ë
2,80 ± 0,05
3,88 ± 0,02
6,00 ± 0,05
10,88 ± 0,03
2,58 ± 0,06
5,99 ± 0,08
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010
ñòâà â ðàñòâîð, ÷òî ñâÿçàíî ñ âçàèìîäåéñòâèåì ÁÀÑÑ ñ
àíèîí-ðàäèêàëîì êèñëîðîäà ïî ìåõàíèçìó:
Î2 + 2RSH D O2·– + R-SS-R + H+,
(5)
O2·– + 2RSH D R-S-S-R + HO2·–.
(6)
C0 æ
I ö
ç 1 - ÷,
t è I0 ø
(7)
ãäå I — òîê ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîðå, ìêÀ, I0 —
òîê ýëåêòðîâîññòàíîâëåíèÿ êèñëîðîäà â îòñóòñòâèå
èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîðå, ìêÀ, C0 – èñõîäíàÿ
êîíöåíòðàöèÿ êèñëîðîäà â ðàñòâîðå, ìêìîëü/ë, t —
âðåìÿ ïðîòåêàíèÿ ðåàêöèè, ìèí.
Ïî ðåçóëüòàòàì îïðåäåëåíèé ñòðîèëè ãðàôèê çàâèñèìîñòè ôóíêöèè (1 – I/I0) îò âðåìåíè (t ), çàòåì ïî
ôîðìóëå (7) îïðåäåëÿëè êîýôôèöèåíò ÀÎÀ èññëåäóåìûõ âåùåñòâ K [15].
 òàáë. 1 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ êîýôôèöèåíòîâ ÀÎÀ äëÿ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ
ñîåäèíåíèé è ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ â èõ íàèáîëåå ýôôåêòèâíûõ êîíöåíòðàöèÿõ (C = 1 × 10 – 3
ìîëü/ë).  êà÷åñòâå ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ âûáðàíû àñêîðáèíîâàÿ êèñëîòà, äèãèäðîêâåðöåòèí è ñåëåíèò íàòðèÿ [16].
Êàê âèäíî èç òàáë. 1, ÁÀÑÑ ïðîÿâèëè õîðîøóþ
ÀÎÀ îòíîñèòåëüíî ñòàíäàðòíûõ àíòèîêñèäàíòîâ. Ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí ïîêàçàëè íàèáîëüøèå çíà÷åíèÿ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ëèòåðàòóðíûì äàííûì [17].
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010
1
0,3
2
3
0,2
Ïðè ýòîì ïîòåíöèàë ïîëóâîëíû êèñëîðîäà ñäâèãàåòñÿ â ïîëîæèòåëüíóþ îáëàñòü (ðèñ. 2).
Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî â îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ 0
äî –1,2  íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå èññëåäóåìûå âåùåñòâà îêàçàëèñü ýëåêòðîõèìè÷åñêè íå àêòèâíûìè. Êðîìå òîãî, îòñóòñòâèå åìêîñòíûõ òîêîâ â äàííîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèé ÁÀÑÑ ñâèäåòåëüñòâóþò îá îòñóòñòâèè àäñîðáöèè
èññëåäóåìûõ âåùåñòâ íà äàííîì ýëåêòðîäå.  ëèòåðàòóðíûõ èñòî÷íèêàõ òàêæå îòñóòñòâóåò èíôîðìàöèÿ îá
àäñîðáöèè ÁÀÑÑ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå â
óêàçàííîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ.
Ïàðàëëåëüíûå ðåàêöèè äèñóëüôèäíûõ ôîðì òèîëîâûõ ñîåäèíåíèé (R-S-S-R) â ðàáîòå íå ðàññìàòðèâàëèñü ââèäó ýëåêòðîõèìè÷åñêîé íåàêòèâíîñòè äàííûõ
âåùåñòâ â èññëåäóåìîé îáëàñòè ïîòåíöèàëîâ íà ñòåêëîãðàôèòîâîì ýëåêòðîäå. Ýòî ïîçâîëèëî èññëåäîâàòü
àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ÁÀÑÑ ìåòîäîì âîëüòàìïåðîìåòðèè.
 ðàáîòå ïðîâåäåíà îöåíêà àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ïðè íàèáîëåå èõ
ýôôåêòèâíîé êîíöåíòðàöèè C = 1 × 10 – 3 ìîëü/ë ñ èñïîëüçîâàíèåì êèíåòè÷åñêîãî êðèòåðèÿ [15], îòðàæàþùåãî êîëè÷åñòâî àêòèâíûõ êèñëîðîäíûõ ðàäèêàëîâ,
ïðîðåàãèðîâàâøèõ ñ àíòèîêñèäàíòîì çà ìèíóòó âðåìåíè, K (ìêìîëü/ë × ìèí):
K =
À
0,4
4
5
0,1
6
7
0
0
1
2
3
t, ìèí
4
5
6
Ðèñ. 3. Çàâèñèìîñòü îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðàñòâîðîâ (A ) îò
âðåìåíè ïðîöåññà (t, ìèí) áåç àíòèîêñèäàíòà â ðåàêöèîííîé
ñìåñè (1 ) è â ïðèñóòñòâèè ÁÀÑÑ ñ êîíöåíòðàöèåé C = 1 × 10 – 3
ìîëü/ë: ìåòèîíèíà (2 ); öèñòèíà (3 ); òàóðèíà (4 ); öèñòåèíà (5 );
ãëóòàòèîíà (6 ); ëèïîåâîé êèñëîòû (7 ).
Ìåòèîíèí ïðîÿâèë ìèíèìàëüíóþ àíòèîêñèäàíòíóþ
àêòèâíîñòü.
Ìåòîä ñïåêòðîôîòîìåòðèè ÿâëÿåòñÿ êëàññè÷åñêèì
äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé àêòèâíîñòè ÁÀÂ.
Ïîýòîìó îí áûë âçÿò â êà÷åñòâå ñðàâíåíèÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ äîñòîâåðíîé èíôîðìàöèè îá àíòèîêñèäàíòíûõ
ñâîéñòâàõ ÁÀÑÑ. Êðîìå òîãî, è â ìåòîäå âîëüòàìïåðîìåòðèè, è â ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîì ìåòîäå èñïîëüçóåòñÿ îäíà è òà æå ìîäåëüíàÿ ñèñòåìà: ãåíåðàöèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ êèñëîðîäà. Ìåòîä îñíîâàí
íà ñïîñîáíîñòè ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ êîíêóðèðîâàòü ñ íèòðîñèíèì òåòðàçîëèåì (ÍÑÒ) çà ñóïåðîêñèä àíèîíû êèñëîðîäà, îáðàçóþùèåñÿ â ðåçóëüòàòå
àýðîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ âîññòàíîâëåííîé ôîðìû
(ÍÀÄÍ) è ôåíàçèíìåòàñóëüôàòà (ÔÌÑ). Â ðåçóëüòàòå
ýòîé ðåàêöèè ÍÑÒ âîññòàíàâëèâàåòñÿ ñ îáðàçîâàíèåì
ãèäðàçèíòåòðàçîëèÿ. Â ïðèñóòñòâèè ñåðóñîäåðæàùèõ
àíòèîêñèäàíòîâ ïðîöåíò âîññòàíîâëåíèÿ ÍÑÒ óìåíüøàåòñÿ [13]. ÁÀÑÑ áûñòðî âçàèìîäåéñòâóþò ñ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëàìè îòíîñèòåëüíî ÍÑÒ, ÷òî âèçóàëüíî îòðàæàåòñÿ â óìåíüøåíèè îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè ðåàêöèîííîé ñìåñè (ðèñ. 3).
Îöåíêà ÀÎÀ ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ïðè èõ
íàèáîëåå ýôôåêòèâíûõ êîíöåíòðàöèÿõ 1 × 10 – 3 ìîëü/ë
Òàáëèöà 3
Çíà÷åíèÿ ÀÎÀ ÁÀÑÑ â åäèíèöàõ K*(ORAC), äëÿ âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêîãî è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî ìåòîäîâ
K*, ORAC
Ñîåäèíåíèå
Ãëóòàòèîí
Öèñòåèí
Öèñòèí
Ìåòèîíèí
Ëèïîåâàÿ êèñëîòà
Òàóðèí
âîëüòàìïåðîìåò- ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä ðè÷åñêèé ìåòîä
1,00
0,79
0,64
0,23
1,11
0,53
1,00
0,72
0,58
0,26
1,08
0,47
D, %
1,00
9,27
9,83
12,24
2,74
12,00
55
îñíîâûâàëàñü íà èñïîëüçîâàíèè % áëîêèðîâàíèÿ ñóïåðîêñèä àíèîí-ðàäèêàëîâ. Ðàñ÷åò âåëè ïî ôîðìóëå [13]:
A 0 - A ïð
A0
×100 % = % áëîêèðîâàíèÿ,
(8)
ãäå A0 — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü ðåàêöèîííîé ñìåñè â
îòñóòñòâèå àíòèîêñèäàíòà â ðàñòâîðå â ñîñòîÿíèè ðàâíîâåñèÿ, íì; Aïð — îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü ðåàêöèîííîé ñìåñè â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ñîñòîÿíèè ðàâíîâåñèÿ, íì.
Ïî ðåçóëüòàòàì èññëåäîâàíèé áûë ðàññ÷èòàí êðèòåðèé IC50, îòðàæàþùèé êîëè÷åñòâî àíòèîêñèäàíòîâ
(ìîëü/ë), èíãèáèðóþùèõ ñèãíàë íà 50 % â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ ïðåäñòàâëåíû â
òàáë. 2.
Êàê âèäíî èç òàáë. 2, èññëåäóåìûå ñåðóñîäåðæàùèå
âåùåñòâà â òîé èëè èíîé ñòåïåíè ïðîÿâèëè ÀÎÀ. Ìèíèìàëüíûì çíà÷åíèåì êðèòåðèÿ IC50, èç ïðåäñòàâëåííûõ, îáëàäàþò ëèïîåâàÿ êèñëîòà è ãëóòàòèîí, ÷òî ãîâîðèò î âûñîêîé ÀÎÀ äàííûõ ñîåäèíåíèé. Äëÿ ìåòèîíèíà êðèòåðèé IC50 èìååò ìàêñèìàëüíîå çíà÷åíèå, ÷òî
ñâèäåòåëüñòâóåò î íåáîëüøîé ÀÎÀ äàííîãî ñîåäèíåíèÿ îòíîñèòåëüíî äðóãèõ èññëåäóåìûõ ñåðóñîäåðæàùèõ àíòèîêñèäàíòîâ. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû õîðîøî
ñîãëàñóþòñÿ ñ ðåçóëüòàòàìè âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêèõ
èçìåðåíèé.
Äëÿ ñðàâíåíèÿ ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ áûë ïðèìåíåí ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé ÀÎÀ ÁÀÂ, âûðàæåííûé â åäèíèöàõ ORAC (oxygen radical absorbance capacity), îòíîñèòåëüíî ãëóòàòèîíà, êàê ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà, K*, ðàññ÷èòàííûé ïî ôîðìóëå:
K* =
I 0 - I â - âà
,
I 0 - I ñò
(9)
ãäå I0 — àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë (ýëåêòðîõèìè÷åñêèé
èëè îïòè÷åñêèé) â îòñóòñòâèå àíòèîêñèäàíòà â ðàñòâîðå; Iâ-âà — àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë ïðè äîáàâëåíèè èññëåäóåìûõ âåùåñòâ â ðàñòâîð; Iñò — àíàëèòè÷åñêèé
ñèãíàë â ïðèñóòñòâèè ñòàíäàðòíîãî âåùåñòâà â ðàñòâîðå. Ðåçóëüòàòû ïðåäñòàâëåíû â òàáë. 3.
Èç òàáë. 3 âèäíî, ÷òî ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå 2 ìåòîäàìè, êîððåëèðóþò ìåæäó ñîáîé. Îòêëîíåíèå ìåæäó ðåçóëüòàòàìè íå ïðåâûøàåò 13 %.
Òàêèì îáðàçîì, èñïîëüçîâàíèå âîëüòàìïåðîìåòðè÷åñêîãî è ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî ìåòîäîâ ïîçâîëèëî íàèáîëåå ïîëíî èññëåäîâàòü àíòèîêñèäàíòíûå
ñâîéñòâà ÁÀÑÑ, âûÿâèòü íàèáîëåå àêòèâíûå ñîåäèíåíèÿ, ñðàâíèòü ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû, èñïîëüçóÿ ìåæäóíàðîäíûé êðèòåðèé ORAC, ïðåäïîëîæèòü âåðîÿòíûé ìåõàíèçì âçàèìîäåéñòâèÿ ñåðóñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé ñ àêòèâíûìè ôîðìàìè êèñëîðîäà.
Ë È Ò Å ÐÀ Ò Ó ÐÀ
1. S. Ñhevion, M. Roberts and M. Ñhevion, Free Red. Biol. Med.,
28, 860 – 870 (2000).
2. R. Singh, G. M. Whitesides, S. Patai and Z. Rappoport, The
Chemistry of Sulphur-containing Functional Group, John Wiley
and Sons, Chichester, UK (1993), pp. 82 – 89.
3. G. Atmaca, Yonsei Med. J., 45(5), 776 – 788 (2004).
4. Í. Ã. Õðàïîâà, Èññëåäîâàíèå ñèíòåòè÷åñêèõ è ïðèðîäíûõ
àíòèîêñèäàíòîâ in vitro è in vivo, Íàóêà, Ìîñêâà (1992), cc.
110 – 114.
5. Â. Ô. Öåïàëîâ, Èññëåäîâàíèå ñèíòåòè÷åñêèõ è ïðèðîäíûõ
àíòèîêñèäàíòîâ in vitro è in vivo, Íàóêà, Ìîñêâà (1992), cc.
112 – 118.
6. Ã. È. Êàëèíêèíà, Ñ. È. Ïèñàðåâà, Õèì.-ôàðì. æóðí., 26(1),
65 – 66 (1992).
7. V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo and A. Ritieni, Agric. Food
Chem., 47(3), 1035 – 1040 (1999).
8. È. Ô. Àáäóëèí, Å. Í. Òóðîâà, Ã. Ê. Áóäíèêîâ, Æóðí. àíàëèò.
õèìèè, 56(6), 627 – 629 (2001).
9. À. À. Áóìáåð, È. Â. Êîðíèåíêî, È. À. Ïðîôàòèëîâà è äð.,
Æóðí. îáù. õèìèè, 71(8), 1387 – 1390 (2001).
10. J. Psotova, J. Zahalkova, J. Hrbac, et al., Biomed. Pap., 145(2),
81 – 83 (2001).
11. L. Campanella, A. Bonanni, B. Bellantoni, J. Pharm. Biomed.
Anal., 35(2), 303 – 320 (2004).
12. Å. È. Êîðîòêîâà, Þ. À. Êàðáàèíîâ, Î. À. Àâðàì÷èê, Èçâ.
âóçîâ. Õèìèÿ è õèì. òåõíîë., 45(3), 110 – 112 (2002).
13. Ñ. ×åâàðè, È. ×àáà, É. Ñåêåé, Ëàá. äåëî, 11, 678 – 681
(1985).
14. E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, A. V. Shevchuk, J. Electroanal. Chem., 518, 56 – 60 (2002).
15. Å. È. Êîðîòêîâà, Î. À. Àâðàì÷èê, Ì. Ñ. Þñóáîâ è äð.,
Õèì.-ôàðì. æóðí., 37(9), 55 – 56 (2003).
16. E. I. Korotkova, O. A. Avramchik, T. M. Angelov, et al., Electrochim. Acta, 36(5), 1246 – 1248 (2005).
17. Â. Ç. Ëàíêèí, À. Ê. Òèõàçå, Þ. Í. Áåëåíêîâ, Ñâîáîäíîðàäèêàëüíûå ïðîöåññû â íîðìå è ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèÿõ, Ìîñêâà (2001), ññ. 278 – 290.
Ïîñòóïèëà 06.10.08
STUDYING ANTIOXIDANT PROPERTIES OF SULFUR-CONTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE
SUBSTANCES BY VOLTAMMETRY AND SPECTROPHOTOMETRY TECHNIQUES
E. V. Dorozhko and E. I. Korotkova
Tomsk State Polytechnical University, Tomsk, Russia;
e-mail: [email protected]; [email protected].
Sulfur-containing biologically active substances demonstrate pronounced antioxidant properties. Special positions among sulfur-containing antioxidant compounds belong to glutathione, cysteine, cystine, methionine, taurine and lipoic acid. The antioxidant properties of these sulfur-containing biologically active
substances have been characterized and analyzed using the data of voltammetry and spectrophotometry. All the studied substances showed more or less pronounced antioxidant activity. Lipoic acid and glutathione exhibited the maximum antioxidant activity, which agrees with data published in the literature. Methionine showed a minimum antioxidant activity in the group of investigated substances. The antioxidant activity was compared on the basis of the international criterion of antioxidant properties of sulfur-containing biologically active substances – oxygen radical absorbance capacity (ORAC) with respect to a reference antioxidant (glutathione). Correlation between the results of voltammetric and spectrophotometric analysis has been found.
Key words: sulfur-containing biologically active substances, antioxidant activity, spectrophotometry, voltammetry
56
Õèìèêî-ôàðìàöåâòè÷åñêèé æóðíàë. Òîì 44, ¹ 10, 2010