SNP-экспресс
advertisement
Наборы “SNP– экспресс” для определения полиморфизмов в геномной ДНК человека Челябинск, 2010 Генетический полиморфизм Полиморфизмы: чаще всего это – замены оснований в ДНК, представляющие собой наследуемые генетические варианты (аллели). Полиморфизмы не являются обязательной причиной развития заболевания, но могут обуславливать больший или меньший риск его развития при действии различных факторов Некоторые медицинские сферы применения анализа полиморфизмов ДНК • Оценка индивидуальных рисков развития социально-значимых заболеваний: - системы гемостаза и фибринолиза - онкологических - сахарный диабет I и 2 типа …………………. • Определение индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Первый международный стандарт ВОЗ в _клиническом генетическом тестировании – Лейденская мутация фактора V свертывания крови принят 17 ноября 2004 года Через год в ЕС генетическое тестирование проводили 700 лабораторий и 900 клиник Документ 21, том 8, глава 1, часть 864 – Гематология и патология 16 марта 2004 Система определения Лейденской мутации ДНК фактора V Определение Лейденской мутации фактора V направлено на постановку диагноза у пациентов с подозрением на тромбофилию. Фактор V • Лейденская мутация (FVL) в гене F5 _G-1691-A, Arg 506 Gln _ _Фактор V расщепляется по Arg506 и Arg306 под действием С-белка коагуляция Протромбиназный комплекс FV FVa – активный FVi - неактивный • Распространенность в Европе 3%-8% _ Швеция и Греция: 10%-15%, _ _ Италия и Испания: 2%-3% Россия (СЗ регион): 3,2% • Риск венозных тромбозов: в 3-8 раз выше у гетерозигот _ в 18–80 раз выше у гомозигот • Дополнительные факторы риска: Гормональный статус Повреждения вен Обездвиженность пероральные контрацептивы - в 30 раз ГтЗ, в 100 раз ГоЗ беременность - в 16 раз гормонзаместительная терапия – в 2 - 4 раза катетеризация центральных вен - в 2 - 3 раза хирургические вмешательства в 13 раз авиаперелѐты - Gene Reviews, www.genetests.org by J.Kujovich Кому рекомендовано генетическое тестирование? • При тромбозах глубоких вен (ТГВ) беременным или _ женщинам, принимающим контрацептивы перорально • Пациентам с семейной историей ТГВ • Больным с ТГВ в возрасте до 50 лет • Больным с необычной локализацией ТГВ • Больным с рецидивирующими ТГВ • Курящим женщинам с инфарктом миокарда _ в возрасте до 50 лет Рекомендации Американского колледжа медицинской генетики по тестированию Лейденcкой мутации фактора V свѐртывания крови Genetics in Medicine: vol 3 March/April 2001, 139-148 Кто дополнительно может пройти тестирование? • Родственники пациентов с мутаций Лейден фактора V • Женщины с привычным невынашиванием беременности, беремен_ ные с преэклампсией, с отслоением плаценты, с внутриутробной _ задержкой развития плода или после случая мертворождения Следует ли пациентов с мутацией Лейден фактора V тестировать по другим факторам риска тромбофилий? • Рекомендовано генетическое тестирование по мутации гена _протромбина FII 20210A. • Также рекомендовано генетическое тестирование мутации C677T _(A223V) гена MTHFR, связанной с гипергомоцистеинемией. Рекомендации Американского колледжа медицинской генетики по тестированию Лейденской мутации фактора V свѐртывания крови Genetics in Medicine: vol 3 March/April 2001, 139-148 Фактор II - Протромбин • Мутация G20210A обусловливает вторую наиболее частую _ тромбофилию у европейцев • Гетерозиготное носительство в Европе 2.5% - 3% _В Испании – 6.5% • Риск венозных тромбозов у носителей мутации _в 2.8 раз выше. • Ген F2 _Мутация G20210A расположена в 3’ UTR регуля_торной области, повышает экспрессию гена и тем _самым уровень протромбина GG GA AA Рекомендации для акушеров и гинекологов Великобритания, 2000г. Клинический генетический анализ FVL и протромбина 20210 уместен из-за разных рисков гомозигот и гетерозигот Различают очень высокую, высокую и среднюю степень риска венозных тромбозов у беременных. Высокая степень риска у женщин, гомозиготных по Лейденской мутации FVL или мутации G20210A протромбина или имеющих комбинацию этих мутаций. Показана антикоагуляционная терапия низкомолекулярными гепаринами с начала-середины второго триместра. Средняя степень риска у женщин, гетерозиготных по Лейденской мутации FVL или мутации G20210A. Антикоагуляционная терапия не показана. J Clin Pathol 2000; 53:573-580 I.D.Walker Мутация гена MTHFR – C677T MTHFR – ген фолатного обмена Гипергомоцистеинемия Нарушение метилирования ДНК Синтез нуклеотидов Метилирование ДНК ТГВ у матери Дефекты развития плода Полиморфизм гена фолатного обмена – MTHFR MTHFR – C677T (Ala222Val) Распространенность мутации у европейцев 10-16% У гомозигот с генотипом T/T активность фермента составляет 35% Сочетание Лейденской мутации и мутации MTHFR увеличивает риск развития венозных тромбозов в 8 раз При приеме оральных контрацептивов – до 30 раз Наличие низкофункционального аллеля в гене фолатного обмена MTHFR повышает риск появления детей c синдромом Дауна в 1.9 раз Полиморфизм генов фолатного обмена связывают с дефектами нервной трубки плода и незаращиванием губы и нѐба Рекомендации для акушеров и гинекологов, США, 2002 • Тромбофилии – распространенное явление. Беременность _провоцирует образование венозных тромбозов и других _сосудистых осложнений. • Наиболее частые тромбофилии включают мутации в генах: _F5 (Лейден), F2 (протромбин), MTHFR и PAI-1. • Сосудистые тромбы могут вызывать патологии в развитии плода. • Предлагается проводить двухстадийный скрининг. Прежде всего _по личной и семейной истории тромбофилий у беременных. При _наличии положительной истории рекомендуют обследование, _включающее ДНК-анализ. http://physicianassistant.medwire.com Оценка риска наследственной тромбофилии методом “подсчѐта баллов” По В.С. Баранову Ген Полиморфизм Оценка Относит. сумма Гены факторов свѐртывания крови F5 G/A 2 F2 G/G 0 FGB A/A 2 F7 G/G 0 4/4 = 1,0 Гены фолатного цикла MTHFR C/T 1 1/1 = 1 Подсчѐт суммы баллов отдельно по группам Деление суммы на общее число полиморфизмов Значение относительной суммы: >1,1 риск повышен 0,9 – 1,1 риск не выражен <0,9 риск минимален SNP - экспресс Наборы для определения полиморфизмов в системе свёртывания крови и фибринолиза Наименование Ген Полиморфизм Генотип Лейден (Коагуляционный фактор V) F5 Arg506Gln Протромбин (Коагуляционный фактор II) F2 20210 G/A Метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFR Ala222Val Ингибитор активатора плазминогена PAI 1 -675 5G/4G Тромбоцитарный гликопротеин 1b, a-субъединица GP1BA Thr145Met AДФ-рецептор тромбоцитов P2Y12 P2RY12 H1/H2 ITGB3 Leu33Pro Интегрин бета-3 Тромбоцитарный рецептор фибриногена GPIIIa Рекомендовано для клинического применения Атеротромбоз – ведущая причина смерти в мире Смертность, % Worldwide defined as Member States by WHO Region (African, Americas, Eastern Mediterranean, European, South-East Asia and Western Pacific) The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001. Полиморфизмы рецепторов тромбоцитов – факторы риска артериальных тромбозов Адгезия тромбоцитов Активация тромбоцитов Агрегация тромбоцитов Инициация адгезии тромбоцитов Стенка сосуда эндотелий Неактивный “Качение тромбоцита” Активированный Полная адгезия Эритроцит адгезия M. Kuwahara et al Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22;329-334 Процесс “качения тромбоцита” опосредуется взаимодействием комплекса GPIb/V/IX с фактором фон Виллебранда (vWF) Связывание vWF замедляет скорость тромбоцита с 1 мм/сек до ~4 мкм/сек, что достаточно для вовлечения других рецепторов vWF – полимерный белок Тромбоцит Фактор фон Виллебранда коллаген с субъединицей, имеющей 3 домена: • домен A1 связывается -_ с рецептором GPIba • домен А3 связывается с _ _ коллагеном субэндотелия Связанный с коллагеном vWF высоко активен в отношении тромбоцитов Полиморфизм гена GPIBA Гликопротеиновый комплекс GPIba/V / IX Тромбоцит GPIba-GPIX-GPV ФВ Met T Thr C C Генетический полиморфизм Ген GPIBA Thr145Met Коллаген Частота встречаемости аллелей - Новосибирск GPIBA 145Thr – 0,93 GPIBA 145Met – 0,07 Cт.-Петербург GPIBA 145Thr – 0,92 GPIBA 145Met – 0,08 Частота встречаемости генотипа в % Cт.-Петербург С/C – 83,6 C/T – 16,0 Т/Т - 0,4 Генотип 145Met является потенциальным фактором риска артериальных тромбозов (острое нарушение мозгового кровообращения, ишемическая болезнь сердца) Активация и привлечение новых тромбоцитов AДФ-рецепторы тромбоцитов P2Y12 и P2Y1 АДФ Активация рецепторов к фибриногену Ген P2RY12 Гаплотипы H1/H2 (Сцепленные полиморфизмы) H1 7 _ _ 139С 744Т нет 52G H2 139Т 744С ins801A 52T Частота встречаемости гаплотипов в Усиление секреции Активация рецепторов к фибриногену Петербурге Н1/H1 H1/H2 H2/H2 72,6% 24.0 3,4 Носители гаплотипа Н2 могут иметь _ повышенный риск артериальных тромбозов “Полиморфизм генов… оказывает влияние не только на риск возникновения, но и на особенности манифестации ВТ, в том числе, на характер его клинических проявлений. Наиболее характерными отличиями группы больных с TГВНК, перенесших ТЭЛА, по сравнению с группой лиц с неосложненным ТГВНК является… увеличение частот встречаемости генотипа P2RY12 H2/H2.” Капустин С.И., РосНИИГиТ, Санкт-Петербург, 2007 Агрегация тромбоцитов Рецептор фибриногена GPIIb/IIIa Хромосома 17 Leu33 ген экзоны T C Встречаемость аллеля Pro33 - у европейцев 10-15% - в Ст.-Петербурге 17% рецептор фибриногена Pro33 GPIIb/IIIa интегрин aIIb/b3 гетеродимер Связь аллеля Pro33 (1565C, PlA2) c развитием тромботических осложнений и чувствительность к некоторым антитромботическим препаратам Влияние генетических полиморфизмов на активность клопидогреля • Клопидогрел – блокирует AДФ-рецептор __тромбоцитов (P2RY12) _ • _ _ _ _ Показания: пациентам при повышенном риске артериальных тромбозов совместно с аспирином (инфаркт миокарда, стентирование, нечувствительность к аспирину при предупреждении инсульта) “Комбинированное использование инги_ биторов агрегации тромбоцитов… АСК и клопи_ догрела… показано всем больным” _ Рекомендации ВНОК по ИМ с подъемами ST- 2008 • 2e место по продажам лекарственных препа_ ратов в мире: 8 млрд $ • Продемонстрирована связь аллельных вариан- тов генов, модулирующих • абсорбцию - ген ABCB1, • метаболическую активацию - геныCYP2C19 _и CYP3A5, • биологическую активность клопидогреля P2RY12 и ITGB3 с риском смерти от ИМ или И за 1 год наблюдения T.Simon et al NEJM 2009 _ КЛОПИДОГРЕЛ (пролекарство) Абсорбция Эстеразы Неактивные метаболиты 85% Метаболизм Активные метаболиты 15% рецептор рецептор Тромбоцит T.Simon et al, N Engl J Med 2009; 360:363-375 Наборы для определения полиморфизмов в геноме человека методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами SNP-экспресс • Доступность анализа для разных _ _ по оснащенности лабораторий Детекция результатов в режиме _ реального времени и методом _ электрофореза • Простой и быстрый анализ Не требует рестриктаз или _ дополнительного анализа кривых _ плавления Длительность постановки в режи-_ _ ме реального времени – 1 час • Широкий спектр профилей Более 130 наборов Профили предрасположенности Система свѐртывания крови и фибринолиза Сердечно-сосудистые заболевания - инсульт, инфаркт – нарушения липидного обмена - гипертензия Индивидуальное лекарство – подбор дозы варфарина – детоксикация – переносимость алкоголя Онкология Женское здоровье – рак молочной железы, яичников Различные онкологические заболевания Индивидуальное лекарство – химиотерапия Репродуктивное здоровье Женское здоровье – привычное невынашивание беременности Мужское здоровье – нарушение репродуктивной функции Риск развития заболеваний Нижних дыхательных путей, воспалительных заболеваний ки_ шечника, сахарного диабета и ожирения, остеопороза, дегене_ рации сетчатки, нарушений иммунитета Наследственные заболевания Рекомендации для клинического применения ЭФ-детекция результатов амплификации Анализ проводится параллельно в 2 пробирках Результат детектируется в агарозном геле М МУТАЦИЯ Н K- Отрицательный контроль 1 Нормальная гомозигота 2 Гетерозигота 3 Мутантная гомозигота С 2010 г. “SNP-экспресс” выпускается с флуоресцентной детекцией для ПЦР в реальном времени SNP-экспресс Реагенты для проведения амплификации (ПЦР): 10х реакционная смесь “Норма” 10х реакционная смесь “Патология” Taq-полимераза Разбавитель Контрольная ДНК Минеральное масло Реакционная смесь “Норма” • ПЦР-буфер • MgCl2 • дНТФ • Праймер 1 • Праймер 3 Реакционная смесь “Патология” • ПЦР-буфер • MgCl2 • дНТФ • Праймер 2 • Праймер 3 Выделение геномной ДНК из лейкоцитов цельной крови реагентом “ДНК-экспресс-кровь” Материал для анализа 1 мл цельной крови Принцип метода – термокоагуляционный Нагревание 15 минут при 98 оС Образец для исследования – супернатант после центрифугирования Комплект реагентов для детекции полморфизмов 1. Реагент для выделения ДНК из крови–“ДНК-экспресс-кровь” - окрашенный для ЭФ - неокрашенный для ПЦР-РВ 2. Реагенты для проведения ПЦР - с ЭФ-детекцией - с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 3. Реактивы для электрофоретической детекции Спасибо за внимание! Телефон: 8 495 589 14 03
