ЭЮС Абакан-2012 - Сибирский федеральный университет
реклама
СРАВНЕНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАНТНОГО АЛЛЕЛЯ В ПУЛИРОВАННЫХ ОБРАЗЦАХ Е.Е.Ануфриева Научный руководитель – Т.Н. Субботина, к.б.н, доцент, Н.М Титова, к.б.н, профессор Сибирский Федеральный Университет, Красноярский филиал ФГБУ Гематологический научный Центр Минздравсоцразвития России, г. Красноярск [email protected] Соматические мутации, а так же мутации, вызывающие наследственные болезни – гаметические мутации, могут затрагивать структурные, транспортные и эмбриональные белки, ферменты. Наличие мутации увеличивает риск развития определенного заболевания, и ранняя диагностика позволяет корректировать образ жизни человека с уменьшением данного риска и начать раннее наблюдение у врача. Наиболее значимым критерием в диагностике миелопролиферативных заболеваний является соматическая мутация V617F в гене Янус-киназы 2 (Jak 2), который кодирует нерецепторную тирозинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки, и экспрессирован в ранних предшественниках гемопоэза. Мутация вызывает нарушение структуры тирозинкиназы, сближение киназных доменов, их самоактивацию и появление высокой активности тирозинкиназы, что приводит к активации пролиферации клетки и блокаде процессов апоптоза Мутация Лейдена в гене FV вызывает резистентность к активированному белку С. Риск развития венозных тромбозов у гетерозиготных носителей мутации Лейдена увеличен в 3 – 5 раз. Мутация распространена среди европейского населения (2 – 6%), ответственна за 20—25% всех случаев изолированных тромбозов и за 40 – 45% всех случаев семейных тромбозов При наличии мутации в гене FII G20210A у пациентов происходит увеличение уровня протромбина в плазме. У гетерозиготных носителей мутации G20210A риск развития венозных тромбозов увеличен в 3 раза. Среди европейского населения мутация встречается с частотой 2 – 3% и ответственна за 6,2% всех случаев тромбозов. Для более эффективного скрининга данных мутаций и уменьшения затрат времени и средств на проведение анализа используются различные методы пулирования. При приготовлении пула есть вероятность попадания образца с мутацией в образцы дикого типа, поэтому существует необходимость в чувствительных тест-системах, способных зарегистрировать мутантный аллель в образце пула. Целью исселедования явилось провести сравнительную характеристику методов выявления мутантного аллеля в пулированных образцах. Объектом исследования являлась геномная ДНК из таких биологических объектов, как цельная кровь людей с диагнозом лейкоз или миелопролиферативное заболевание, ишемический и геморрагический инсульт. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводилось с использованием набора реагентов «ДНК-сорб-В» (АмплиСенс),концентрацию ДНК измеряли с использованием реагентов QuantiT™ ssDNA Assay Kit и флуориметра Qubit (Invitrogen) В работе использовались следующие методы: Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с системой детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени «iCycler iQ5» (BioRad) с использованием комплекта реагентов для амплификации «SNP-экспресс-РВ» НПФ Литех; гибридизация на биологическом микрочипе «ФИБР - БИОЧИП» («БИОЧИП-ИМБ»); одновременный биолюминесцентный анализ на основе PEXT реакции (Институт Биофизики СО РАН, г. Красноярск) Мы анализировали пулы, где соотношение мутантного аллеля к образцам дикого типа составляло 1:9. Для приготовления отбирали образцы ДНК, в которых ранее были выявлены искомые мутации. Пул для определения соматической мутации готовили, смешивая образцы ДНК каждого пациента, а для гаметических мутаций готовили пулы на основе ДНК и аликвот крови с равным числом лейкоцитов и последующим выделением ДНК из пробы. Наиболее чувствительной к мутантному аллелю тест-системой является гибридизация на биологичеком микрочипе для наследственных мутаций, а для соматических мутаций – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. При проведении ПЦР для определения гаметических мутаций не происходило регистрации мутантного аллеля. Одновременный биолюминесцентный анализ на основе PEXT реакции для гаметических мутаций показал синал слабее, чем чем при гибридизации на биологическом микрочипе.
