Активность нитрергической системы и поглощение D

ÁÈÎÕÈÌÈß
ÓÄÊ 577.152.199+615.849.19
Î. À. Ìîâñåñÿí, Í. Õ. Àë÷óäæÿí, Í. Î. Ìîâñåñÿí, Ã. À. Ãåâîðêÿí
Àêòèâíîñòü íèòðåðãè÷åñêîé ñèñòåìû è ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû â
êîñòíîì ìîçãå è ñóáïîïóëÿöèÿõ ëåéêîöèòîâ êðîâè êðûñ, ïîäâåðãíóòûõ
îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì è êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì
ïðè êëîñòðèäèàëüíîì ñåïñèñå
(Ïðåäñòàâëåíî àêàäåìèêîì Ê.Ã.Êàðàãåçÿíîì 21/I 2009)
Êëþ÷åâûå ñëîâà: Clostridium perfringens, D-ãëþêîçà, êîñòíûé ìîçã, êðàñíûé
ñâåòîâîé äèîä, ëåéêîöèòû, ïîëóïðîâîäíèêîâûé ëàçåð, ñèíòàçà îêñèäà àçîòà
 ïîñëåäíèå ãîäû â âîçíèêíîâåíèè è ðàçâèòèè ñåïñèñà âñå áîëüøóþ
ðîëü ïðèîáðåòàþò ãðàìïîëîæèòåëüíûå ìèêðîîðãàíèçìû, â ÷èñëå êîòîðûõ
âîçáóäèòåëü ãàçîâîé ãàíãðåíû ñïîðîîáðàçóþùèé àíàýðîá Clostridium perfringens [1].
Âûñîêàÿ ñìåðòíîñòü ïðè ñåïòè÷åñêîì øîêå íåñìîòðÿ íà
âàçîïðåññîðíóþ òåðàïèþ è ëå÷åíèå àíòèáèîòèêàìè îáóñëîâëåíà èíäóêöèåé
÷ðåçìåðíîãî çàùèòíîãî è âîñïàëèòåëüíîãî îòâåòà [2]. Ñîãëàñíî ñîâðåìåííûì
ïðåäñòàâëåíèÿì âûáðîñ öèòîêèíîâ â îòâåò íà èíôåêöèþ èììóíîêîìïåòåíòíûìè êëåòêàìè (ÈÊÊ) âûçûâàåò ãèïåðïðîäóêöèþ óíèâåðñàëüíîãî áèîìåäèàòîðà
îêñèäà àçîòà (NO), ñ ïîñëåäóþùèì ðàçâèòèåì ñåïòè÷åñêîãî øîêà, êîãäà
áîëüøîå êîëè÷åñòâî ìèêðîáîâ, öèðêóëèðóþùèõ â êðîâè, ðåçêî àêòèâèðóåò
ñèíòåç ýòîãî ãàçà, âûçûâàþùåãî äëèòåëüíîå è ñèëüíîå ðàñøèðåíèå ìåëêèõ
êðîâåíîñíûõ ñîñóäîâ è ñíèæåíèå àðòåðèàëüíîãî äàâëåíèÿ, ñ òðóäîì ïîääàþùååñÿ òåðàïåâòè÷åñêîìó âîçäåéñòâèþ [3]. Ýíäîãåííûé ñèíòåç NO èç
àìèíîêèñëîòû L-àðãèíèíà îñóùåñòâëÿþò ôóíêöèîíàëüíî è ôàðìàêîëîãè÷åñêè
ðàçëè÷àþùèåñÿ èçîôîðìû NO ñèíòàçû (NOS): êàëüöèé(Ñà2+ )-êàëüìîäóëèí
(ÑàÌ)-çàâèñèìûå ”êîíñòèòóòèâíûå” èçîôîðìû (ñNOS) (íåéðîíàëüíàÿ, nNOS,
è ýíäîòåëèàëüíàÿ, åNOS) è Ca(II)/CaM-íåçàâèñèìàÿ ”èíäóöèáåëüíàÿ” (iNOS),
ýôôåêòîðíàÿ ìîëåêóëà âðîæäåííîé èììóííîé ñèñòåìû, ðåãóëÿòîðíûé êîìïîíåíò àíòèïàòîãåííîé è ïðîòèâîâîñïàëèòåëüíîé çàùèòû õîçÿèíà [4]. Âñå
6 8
òðè èçîôîðìû îáíàðóæåíû â ÈÊÊ êðîâè è êîñòíîì ìîçãå è ó÷àñòâóþò
â ðåàëèçàöèè èõ ôóíêöèé, íî ìîãóò îêàçûâàòü ðàçíîå âëèÿíèå [5]. Òàê,
NO, ïðîäóöèðóåìûé ñNOS, áëîêèðóåò àêòèâèðîâàíèå ÿäåðíîãî òðàíñêðèïöèîííîãî ôàêòîðà (NF-·B) è òîðìîçèò âûñâîáîæäåíèå ïðîâîñïàëèòåëüíûõ
ìåäèàòîðîâ, â òî âðåìÿ êàê iNOS/NO îêàçûâàåò ïðîòèâîïîëîæíîå äåéñòâèå
[6]. Àêòèâèðîâàíèå iNOS è åå êîìïàðòìåíòàëèçàöèÿ â î÷àãàõ èíôåêöèè è
ýêñïðåññèè ïðîâîñïàëèòåëüíûõ öèòîêèíîâ óáåäèòåëüíî ïðîäåìîíñòðèðîâàíû
íà ìîäåëÿõ ñåïñèñà æèâîòíûõ è ó ïàöèåíòîâ ñ ñåïñèñîì è ñåïòè÷åñêèì
øîêîì [7]. Â òî æå âðåìÿ çàùèòíàÿ ðîëü êîíñòèòóòèâíûõ ôîðì NOS, à
èìåííî: âàçîäèëàòàöèÿ, àíòèîêñèäàíòíîå äåéñòâèå, èíãèáèðîâàíèå àäãåçèè
òðîìáîöèòîâ è ëåéêîöèòîâ ê ñòåíêàì ñîñóäîâ è ïðåïÿòñòâîâàíèå àãðåãàöèè
òðîìáîöèòîâ – óêàçûâàåò íà ïîçèòèâíóþ íàïðàâëåííîñòü ïîâûøåííîé
ïðîäóêöèè NO ïðè èíôåêöèè è ñèñòåìíîì âîñïàëèòåëüíîì îòâåòå [4,5].
Íåîáõîäèìîñòü èçáèðàòåëüíîãî ïîäõîäà ïðè èíãèáèðîâàíèè ôåðìåíòíûõ
ñèñòåì, ãåíåðèðóþùèõ NO, ïîäòâåðæäàåòñÿ íåóäà÷íûìè ïîïûòêàìè òåðàïèè
ñåïòè÷åñêîãî øîêà íåñåëåêòèâíûìè èíãèáèòîðàìè NOS [8].
Èçó÷åíèå
ìåõàíèçìîâ êëîñòðèäèàëüíîãî ñåïñèñà íà óðîâíå èçîôåðìåíòîâ NOS, à òàêæå
ïîèñê íîâûõ íåôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñïîñîáîâ èçáèðàòåëüíîãî âîçäåéñòâèÿ íà
íèõ ÿâëÿåòñÿ îäíèì èç ïîäõîäîâ ê ðåøåíèþ ïðîáëåìû ãðàìïîëîæèòåëüíîãî
ñåïñèñà, êîòîðûé ãîðàçäî ìåíåå èçó÷åí ïî ñðàâíåíèþ ñ ãðàìîòðèöàòåëüíûì.
Ïî ïîñëåäíèì äàííûì ñèñòåìà NOS/NO îïîñðåäóåò òåðàïåâòè÷åñêèå
ýôôåêòû íèçêîèíòåíñèâíîãî êðàñíîãî ëàçåðíîãî è ñâåòîäèîäíîãî îïòè÷åñêîãî èçëó÷åíèÿ, ïðè êîòîðîì ïîâûøåíèå êîíöåíòðàöèè âíóòðèêëåòî÷íîãî
êàëüöèÿ îêàçûâàåò âîçäåéñòâèå íà èçîôîðìû NOS [9]. Ýëåêòðîìàãíèòíîå èçëó÷åíèå ìîæåò âëèÿòü íà ìåìáðàííóþ ïðîíèöàåìîñòü ÷åðåç NO è íèòðèò/íèòðàòû, ñòàáèëüíûå ïðîäóêòû åãî îêèñëåíèÿ, êîòîðûå, ÿâëÿÿñü õàîòðîïíûìè
àãåíòàìè, èçìåíÿþò ñâîéñòâà êëåòî÷íûõ ìåìáðàí è îêàçûâàþò âîçäåéñòâèå
íà ñâÿçûâàíèå è ïîãëîùåíèå êëåòêàìè D-ãëþêîçû, âûñîêèå êîíöåíòðàöèè
êîòîðîé â ðàçíîé ñòåïåíè èíãèáèðóþò àêòèâíîñòü èçîôîðì NOS è ïîäàâëÿþò
èõ ñèíòåç de novo [10]. Â ïðåäñòàâëåííîé ðàáîòå íà ìîäåëè êëîñòðèäèàëüíîãî
ñåïñèñà êðûñ èçó÷åíî âëèÿíèå èçëó÷åíèÿ â êðàñíîé îáëàñòè ñïåêòðà
ïîëóïðîâîäíèêîâîãî ëàçåðà è ñâåòîäèîäà íà àêòèâíîñòü èçîôîðì NOS è
ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû â êîñòíîì ìîçãå (ÊÌ) è èììóíîêîìïåòåíòíûõ êëåòêàõ
êðîâè.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Ýêñïåðèìåíòû ïðîâîäèëè íà ìîëîäûõ áåñïîðîäíûõ ñàìöàõ áåëûõ êðûñ ìàññîé 100-150 ã, ñîäåðæàâøèõñÿ â âèâàðèè â åñòåñòâåííûõ óñëîâèÿõ îñâåùåíèÿ è ïðè ñâîáîäíîì äîñòóïå âîäû è ïèùè. Ìîäåëü
êëîñòðèäèàëüíîãî ñåïñèñà ïîëó÷àëè îäíîðàçîâîé âíóòðèáðþøèííîé èíúåêöèåé 0.25 ìë âçâåñè êëåòîê êëèíè÷åñêîãî øòàììà ãðàìïîëîæèòåëüíîé àíàý6 9
ðîáíîé ñïîðîîáðàçóþùåé áàêòåðèè C. perfringens (â äîçå ËÄ 50, 106 êëåòîê/ìë).
Æèâîòíûå áûëè ðàçäåëåíû íà ãðóïïû (n=5/ãðóïïó): 1) çäîðîâûå (êîíòðîëü);
2) èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens; 3) èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ýíåðãèÿ 600 ìÄæ); 4)
èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ýíåðãèÿ 900 ìÄæ); 5) èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è
ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì (ýíåðãèÿ 900 ìÄæ).
Ïðîöåäóðà îáëó÷åíèÿ. Îäíîðàçîâîå îáëó÷åíèå ïðîâîäèëè ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ÏÏË), ðàáîòàþùèì â íåïðåðûâíîì ðåæèìå (äëèíà
âîëíû 654 íì) è/èëè êðàñíûì ñâåòîäèîäîì (ÊÑÄ). Íà èçîëèðîâàííîå è
ôèêñèðîâàííîå æèâîòíîå íàïðàâëÿëñÿ ïó÷îê ñ ýíåðãèåé èçëó÷åíèÿ 600 è/èëè
900 ìÄæ ÏÏË è 900 ìÄæ ÊÑÄ, ìîùíîñòüþ 1.5 ìÂò è äëèòåëüíîñòüþ
ýêñïîçèöèè 10 ìèí.
Âûäåëåíèå íåéòðîôèëîâ è ìîíîíóêëåàðîâ êðîâè. Êðîâü ñîáèðàëè â
ïëàñòèêîâûå ïðîáèðêè, ñòàáèëèçèðîâàëè àíòèêîàãóëÿíòîì (5% Na2 -EDTA, â
ñîîòíîøåíèè 5:1), ñìåøèâàëè ñ 6% äåêñòðàíîì, ïðèãîòîâëåííûì íà 0.9% NaCl
(â ñîîòíîøåíèè 2:1) è èíêóáèðîâàëè ïðè 37o Ñ 1 ÷. Ïîñëå ñåäèìåíòàöèè
ýðèòðîöèòîâ îòäåëÿëè âåðõíèé ñëîé, ñîäåðæàùèé ëåéêîöèòû, èç êîòîðîãî
ïîëó÷àëè ñóáïîïóëÿöèè ëåéêîöèòîâ öåíòðèôóãèðîâàíèåì â äâóõñòóïåí÷àòîì
ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîë-âåðîãðàôèíà (1.129 è 1.087 ã/ñì3 ) ïðè 3000
îá/ìèí 20 ìèí [11]. Ìîíîíóêëåàðû è íåéòðîôèëû ïîëó÷àëè èç âåðõíåãî
è íèæíåãî èíòåðôàçíîãî êîëüöà, ñîîòâåòñòâåííî, è ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì
äâàæäû ïðîìûâàëè 20 ìÌ HEPES áóôåðîì ðÍ 7.4.
Âûäåëåíèå êîñòíîãî ìîçãà. ÊÌ âûäåëÿëè èç òðóá÷àòûõ êîñòåé (áåäðåííîé è áîëüøîé áåðöîâîé), ãîìîãåíèçèðîâàëè â 20 ìÌ HEPES áóôåðå ðÍ 7.4,
ñîäåðæàùåì 2 ìÌ äèòèîòðåèòîëà è 3 ìÌ MgCL2 ¢6H2 O. Ãîìîãåíàò ïðîïóñêàëè
÷åðåç ôèëüòð ñ äèàìåòðîì ïîð 70 ìêì è ïîëó÷åííóþ âçâåñü êëåòîê ÊÌ
èñïîëüçîâàëè äëÿ èññëåäîâàíèÿ. Æèçíåñïîñîáíîñòü ôîðìåííûõ ýëåìåíòîâ
êðîâè è ïîïóëÿöèé êëåòîê ÊÌ ñîñòàâëÿëà >95% ïðè îïðåäåëåíèè îêðàñêîé
òðèïàíîâûì ñèíèì (”Chemapol”, ×åõèÿ). Ýôôåêòèâíîñòü ðàçäåëåíèÿ êëåòîê
êðîâè îöåíèâàëè îêðàøèâàíèåì ïî Ìåé-Ãðþíâàëüäó – Ãèìçå.
Îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè èçîôîðì NOS. Àêòèâíîñòü NOS îïðåäåëÿëè
ïî ïðîäóêöèè àêòèâíûõ ôîðì àçîòà (NO è åãî ñòàáèëüíûõ èíòåðìåäèàòîâ,
îêèñëîâ àçîòà (NO2¡ , NO3¡ , N2 O4 , N2 O3 ), íèòðîçîòèîëîâ è íèòðîçàìèíîâ)
ïðè äîëãîâðåìåííîé èíêóáàöèè (24 ÷, 37o Ñ) èññëåäóåìûõ îáðàçöîâ â 20 ìÌ
HEPES áóôåðå pH 7.4, ñîäåðæàùåì 2 ìÌ äèòèîòðåèòîë, 3 ìÌ MgCl2 ¢6H2 O. Â
èíêóáàöèîííóþ ñìåñü â çàâèñèìîñòè îò óñëîâèé îïûòà ââîäèëè 1.15 ìÌ EDTA
èëè 1.73 ìÌ CaCl2 . Îáùàÿ àêòèâíîñòü NOS îïðåäåëÿëàñü èíêóáèðîâàíèåì
ïðîá â ïðèñóòñòâèè 1.73 ìÌ CaCl2 , àêòèâíîñòü iNOS – èíêóáèðîâàíèåì
7 0
ïðîá â ïðèñóòñòâèè 1.15 ìÌ EDTA.  ïàðàëëåëüíûõ ýêñïåðèìåíòàõ ïðîáû
èíêóáèðîâàëè â ïðèñóòñòâèè 5.25 ìM L-àðãèíèíà è êîôàêòîðîâ NOS: 0.126 ìM
NADPH, 20.07 ìêÌ (6R)-5,6,7,8-òåòðàãèäðî-L-áèîïòåðèí äèãèäðîõëîðèäà, 6.08
ìêÌ FAD, 5.53 ìêÌ FMN. Àêòèâíîñòü ñNOS âû÷èñëÿëàñü ïî ðàçíîñòè ìåæäó
îáùåé àêòèâíîñòüþ NOS è òàêîâîé iNOS. Àêòèâíîñòü NOS âûðàæàëè â íìîëü
(NO2¡ )¢ ìã¡1 áåëêà¢24 ÷¡1 . Êîíöåíòðàöèÿ áåëêà îïðåäåëÿëàñü ïî ìåòîäó Ëîóðè
[12].
Îïðåäåëåíèå àêòèâíûõ ôîðì àçîòà. Ñîäåðæàíèå àêòèâíûõ ôîðì àçîòà â
ñóïåðíàòàíòàõ äåïðîòåèíèçèðîâàííûõ ïðîá (îñàæäåíèå áåëêîâ îñóùåñòâëÿëè
0.5 N NaOH è 10% ZnSO4 ) îïðåäåëÿëè ðåàêöèåé äèàçîòèðîâàíèÿ (ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåàêòèâà Ãðèññà – Èëîñâàÿ ) ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè äëèíå âîëíû
546 íì [13].
Ðàäèîìåòðè÷åñêîå îïðåäåëåíèå ñâÿçûâàíèÿ D-ãëþêîçû. Äëÿ èçó÷åíèÿ
ïðîöåññîâ ñïîíòàííîãî çàõâàòà D-ãëþêîçû èññëåäóåìûå îáðàçöû (200 ìêë)
íàãðóæàëè ìêÊè 14 Ñ[U]-ãëþêîçû (óäåëüíàÿ ðàäèîàêòèâíîñòü 260 ìêÊè/ììîëü)
â 250 ìêë 20 ìÌ HEPES áóôåðà pH 7.4, ñîäåðæàùåì 2 ìÌ äèòèîòðåèòîë,
3 ìÌ MgCl2 ; ¢6Í2 Î, è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 37o Ñ. Áåëêè
â ïðîáàõ îñàæäàëèñü òðåõêðàòíûì îáú¸ìîì 30% ÒÕÓ; ñâîáîäíûå ëèãàíäû
îòäåëÿëè îò ñâÿçàííûõ ïðîïóñêàíèåì ÷åðåç ôèëüòðû (äèàìåòð ïîð 0.65
ìêì, ”Millipore”, USA) ñ äâóêðàòíîé ïðîìûâêîé 96% ýòàíîëîì.
Ïîñëå
âûñóøèâàíèÿ ôèëüòðû ïîìåùàëè â ñöèíòèëëÿöèîííûå ôëàêîíû, ðàñòâîðÿëè
â 0.5 ìë äèìåòèëñóëüôîêñèäà è âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 24 ÷ ïðè êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå, çàòåì ââîäèëè 10 ìë ñöèíòèëëÿòîðà Áðåÿ (2,6-äèôåíèëoêñaçîë
è 1,4-äè-(5-ôåíèë-2-îêñàçîëèëáåíçîëà) ðàñòâîðåííûå â ïðîïîðöèè 10:1 â
ñöèíòèëëÿöèîííîì òîëóîëå). Ñïåöèôè÷åñêîå ñâÿçûâàíèå ëèãàíäà îïðåäåëÿëîñü ðàçíîñòüþ ìåæäó îáùèì óðîâíåì ðàäèîàêòèâíîñòè è ïîñëå èíêóáàöèè
îáðàçöîâ ñ 14 Ñ-D-ãëþêîçîé. Ðàäèîàêòèâíîñòü îïðåäåëÿëè ìåòîäîì æèäêîé
ñöèíòèëëÿöèîííîé ñïåêòðîñêîïèè íà ñïåêòðîìåòðå SL-4221 (Roche Bioelectronique Kontron, Ôðàíöèÿ) ñ ýôôåêòèâíîñòüþ ñ÷¸òà 70% (ïî 14 Ñ). Ïîãëîùåíèå
ãëþêîçû ïåðåñ÷èòûâàëîñü â íìîëü 14 Ñ-D-ãëþêîçû¢ìã¡1 áåëêà.
Ñòàòèñòè÷åñêàÿ îáðàáîòêà ðåçóëüòàòîâ. Äëÿ âûÿâëåíèÿ ñòåïåíè çàâèñèìîñòè îòäåëüíûõ èññëåäóåìûõ ïîêàçàòåëåé ïðèìåíÿëñÿ êîððåëÿöèîííûé
àíàëèç (êîýôôèöèåíò ëèíåéíîé êîððåëÿöèè Ïèðñîía, r). Äîñòîâåðíîñòü
ðàçëè÷èé ñðåäíèõ çíà÷åíèé ïàðàìåòðîâ è êîððåëÿöèé ïî ãðóïïàì îöåíèâàëè
ïî t-êðèòåðèþ Ñòüþäåíòà. Ðàçëè÷èÿ ìåæäó âûáîðêàìè ñ÷èòàëè äîñòîâåðíûìè
ïðè P < 0 :0 5 .
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå. Â ÈÊÊ êðîâè è ÊÌ â óñëîâèÿõ in vitro â
àäàïòèðîâàííîé íàìè ñèñòåìå äîëãîâðåìåííîãî èíêóáèðîâàíèÿ áèîìàòåðèàëà
(ñì. Ìàòåðèàëû è ìåòîäû) óñïåøíî äåòåêòèðóåòñÿ ñèíòåç NO, êîòîðûé
7 1
ïîëíîñòüþ áëîêèðóåòñÿ ïðè ââåäåíèè â ñîñòàâ ðåàêöèîííîé ñðåäû 2.5 ìÌ NG ìîíîìåòèë-L-àðãèíèíà, êîíêóðåíòíîãî íåñåëåêòèâíîãî èíãèáèòîðà èçîôîðì
NOS, ÷òî ïîäòâåðæäàåò ôóíêöèîíèðîâàíèå ìåòàáîëè÷åñêîãî ïóòè L-àðãèíèí
NO (äàííûå íå óêàçàíû).
Ðèñ. 1. Àêòèâíîñòü èçîôîðì NOS â ñóáïîïóëÿöèÿõ ëåéêîöèòîâ êðîâè è êîñòíîì
ìîçãå êðûñ, èíôèöèðîâàííûõ C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûõ îáëó÷åíèþ
ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì è/èëè êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì. cNOS’è iNOS’ aêòèâíîñòü, îïðåäåëÿåìàÿ â ïðèñóñòâèè L-àðãèíèíà è êîôàêòîðîâ NOS (ñì.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû). 1 - çäîðîâûå êðûñû (êîíòðîëü); 2 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå
C. ðerfringens; 3 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå
îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ýíåðãèÿ 600 ìÄæ); 4 - êðûñû,
èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì
ëàçåðîì (ýíåðãèÿ 900 ìÄæ); 5 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è
ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì (ýíåðãèÿ 900 ìÄæ).
Íà ðèñ. 1 ïðåäñòàâëåíû ñäâèãè â àêòèâíîñòè èçîôîðì NOS â ìîíîíóêëåàðàõ êðîâè è îáùåé ôðàêöèè ïðè ðàçâèòèè ãåíåðàëèçîâàííîãî âîñïàëåíèÿ ó
êðûñ, èíôèöèðîâàííûõ C. ðerfringens è ïîñëå îáëó÷åíèÿ ÏÏË è/èëè ÊÑÄ.
 íåéòðîôèëàõ è ìîíîíóêëåàðàõ çäîðîâûõ êðûñ îáíàðóæèâàåòñÿ òîëüêî
àêòèâíîñòü iNOS, à â ÊÌ äîìèíèðóåò cNOS, ïðåâûøàÿ iNOS â 4 ðàçà. Ýòî
ñîãëàñóåòñÿ ñ ïîëó÷åííûìè íåäàâíî äàííûìè î ðîëè êîíñòèòóòèâíûõ èçîôîðì
7 2
NOS â ÊÌ, ãäå eNOS èãðàåò ðîëü â ìîáèëèçàöèè ïðîãåíèòîðîâ è ñòâîëîâûõ
êëåòîê è nNOS äåéñòâóåò êàê ïàðàêðèííûé ýôôåêòîð ðåãóëÿöèè ãåìîïîåçà
[14].
Ôóíêöèîíàëüíàÿ ðîëü iNOS/NO â ñòâîëîâûõ êëåòêàõ, âîçìîæíî,
ñâÿçàíà ñ åãî àíòèîêñèäàíòíûìè ñâîéñòâàìè, à òàêæå ñ ïîääåðæàíèåì
àíòèïðîëèôåðàòèâíîãî òîíà, íàöåëåííîãî íà ïðåäîòâðàùåíèå ïðåæäåâðåìåííîé ãèáåëè ïðè ñòðåññîâûõ âîçäåéñòâèÿõ [15]. Â ýòîé ñâÿçè çàñëóæèâàþò
èíòåðåñ ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå î òîì, ÷òî ïðè ââåäåíèè â ñðåäó äîëãîâðåìåííîãî èíêóáèðîâàíèÿ L-àðãèíèíà è êîôàêòîðîâ NOS (ñì. Ìàòåðèàëû è
ìåòîäû) àêòèâíîñòü iNOS â ÊÌ ïîâûøàåòñÿ äî óðîâíÿ ñNOS; ïî-âèäèìîìó,
òàêîé ìåõàíèçì ðåãóëèðîâàíèÿ ìîæåò äåéñòâîâàòü in vivo.
Ýòî âàæíî,
ïîñêîëüêó iNOS â îòëè÷èå îò ñNOS ñïîñîáíà â òå÷åíèå íåñêîëüêèõ äíåé
ïðîäóöèðîâàòü NO è ïîääåðæèâàòü åãî âûñîêèé óðîâåíü, çàïóñêàÿ ìåõàíèçìû
èììóíîñóïðåññèè [16].
Îòìåòèì, ÷òî âêëþ÷åíèå L-àðãèíèíà è êîôàêòîðîâ NOS â ðåàêöèîííóþ
ñìåñü ïîìîãàåò òî÷íåå îöåíèòü àêòèâíîñòü NOS, ïîñêîëüêó êàæäûé èç íèõ
âíîñèò ñâîé âêëàä â êàòàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü è ñòàáèëèçàöèþ êîíôîðìàöèè
ôåðìåíòà, òîãäà êàê ïðè èñ÷åðïûâàíèè èõ ïóëà èëè ñóáíàñûùàþùèõ
êîíöåíòðàöèÿõ (îñîáåííî àðãèíèíà è òåòðàãèäðîáèîïòåðèíà) âñå èçîôîðìû
NOS ìîãóò, îêèñëÿÿ NADPH, ïðîäóöèðîâàòü òàêèå àãðåññèâíûå ïðîäóêòû, êàê
¡
Í2 Î2 , Ρ
2 è íèòðîêñèëüíûé ðàäèêàë NO , îêàçûâàÿ ïîâðåæäàþùåå äåéñòâèå
íà òêàíè [17].
Ó èíôèöèðîâàííûõ êðûñ àêòèâíîñòü iNOS ÊÌ âîçðàñòàåò ïî÷òè â 10
ðàç ñ îäíîâðåìåííûì ïîëíûì ïîäàâëåíèåì ñNOS; L-àðãèíèí è êîôàêòîðû
NOS ÷àñòè÷íî ïîâûøàþò àêòèâíîñòü ïîñëåäíåé, íî îíà îñòàåòñÿ ïî÷òè â 19
ðàç íèæå êîíòðîëüíûõ çíà÷åíèé, à àêòèâíîñòü iNOS â èõ ïðèñóòñòâèè äàæå
íåñêîëüêî ñíèæàåòñÿ. Èçìåíåíèÿ âî âëèÿíèè L-àðãèíèíà è êîôàêòîðîâ NOS
íàáëþäàþòñÿ è â ÈÊÊ êðîâè: â íîðìå ïðè âêëþ÷åíèè èõ â èíêóáàöèîííóþ
ñðåäó â íåéòðîôèëàõ âûÿâëÿåòñÿ àêòèâíîñòü ñNOS – ó èíôèöèðîâàííûõ
æèâîòíûõ îíà íå îáíàðóæèâàåòñÿ, îñëàáëÿåòñÿ è èõ àêòèâèðóþùåå âîçäåéñòâèå íà iNOS íåéòðîôèëîâ, êîòîðàÿ ïðè èíôåêöèè âîçðàñòàåò â 2.4 ðàçà.
Èíòåðåñíî, ÷òî iNOS ìîíîíóêëåàðîâ èíôèöèðîâàííûõ êðûñ ñíèæàåòñÿ â
1.3 ðàçà, íî L-àðãèíèí è êîôàêòîðû NOS âîññòàíàâëèâàþò åå íîðìàëüíûé
óðîâåíü. Ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î ìåòàáîëè÷åñêèõ ïåðåñòðîéêàõ ïðè êëîñòðèäèàëüíîì ñåïñèñå, çàòðàãèâàþùèõ â ÷àñòíîñòè àðãèíèíìåòàáîëèçèðóþùèå ñèñòåìû êðîâè è ÊÌ.
Àêòèâèðîâàíèå iNOS â ÈÊÊ êðîâè è ÊÌ ïðè êëîñòðèäèàëüíîì ñåïñèñå
ïðèâîäèò ê íàðóøåíèþ ñáàëàíñèðîâàííîãî ñèíòåçà NO â ñòîðîíó åãî
ãèïåðïðîäóêöèè, à ïðè îäíîâðåìåííîì àêòèâèðîâàíèè ïðîäóêöèè àêòèâíûõ
ôîðì êèñëîðîäà ñîïðîâîæäàåòñÿ îáðàçîâàíèåì ìîùíîãî îêñèäàíòà ïåðîê7 3
ñèíèòðèòà (OONO¡ , ÏÍ), êîòîðûé ìîæåò èíèöèèðîâàòü êàñêàä ðåàêöèé:
íåîáðàòèìîå èíãèáèðîâàíèå àêîíèòàçû, æåëåçî-ñåðíûõ öåíòðîâ I-III êîìïëåêñîâ äûõàòåëüíîé öåïè, íèòðîçèëèðîâàíèå ìåìáðàííûõ òèîëîâ ñ îòêðûòèåì
ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû [17]. ÏÍ â îòëè÷èå îò NO àêòèâíî íèòðîçèëèðóåò
ëèïèäû, áåëêè, ÄÍÊ, îêàçûâàÿ äåñòðóêòèâíîå âîçäåéñòâèå íà ìåìáðàíû è
ôóíêöèè êëåòîê [18]. Âäîáàâîê iNOS ñïîñîáíà ïîäàâëÿòü ïðîòåêòîðíûå
ìåõàíèçìû, îïîñðåäóåìûå åNOS â ïàòîãåíåçå ñåïñèñà [19].
Ïðè èíôåêöèè C. ðerfringens â ÊÌ ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû ñíèæàåòñÿ
âäâîå, â ìîíîíóêëåàðàõ – â 1.5 ðàçà, à â íåéòðîôèëàõ âîçðàñòàåò â 1.38 ðàçà
(ðèñ. 2).
Ðèñ. 2. Ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû ñóáïîïóëÿöèÿìè ëåéêîöèòîâ êðîâè è êëåòêàìè
êîñòíîãî ìîçãà êðûñ, èíôèöèðîâàííûõ C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûõ îáëó÷åíèþ
ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì è/èëè êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì. 1 - çäîðîâûå êðûñû
(êîíòðîëü); 2 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens; 3 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå
C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ýíåðãèÿ
600 ìÄæ); 4 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå C. ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ
ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (ýíåðãèÿ 900 ìÄæ); 5 - êðûñû, èíôèöèðîâàííûå C.
ðerfringens è ïîäâåðãíóòûå îáëó÷åíèþ êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì (ýíåðãèÿ
900 ìÄæ).
Ñîîáùàëîñü, ÷òî íåáîëüøèå äîçû ëàçåðíîãî îáëó÷åíèÿ âûçûâàþò àêòèâèðîâàíèå ñóïåðîêñèääèñìóòàçû, ñíèæàþùåé óðîâåíü àêòèâíûõ ôîðì
êèñëîðîäà, à ïîâûøåíèå äîçû óæå ÷åðåç ñóòêè ïîñëå îáëó÷åíèÿ âûçûâàåò
èíãèáèðîâàíèå ñóïåðîêñèääèñìóòàçû è íàêîïëåíèå ÏÍ, êîòîðûé äåéñòâóåò,
êàê àíòàãîíèñò NO, ñïîñîáñòâóÿ ñïàçìó ñîñóäîâ è îêèñëèòåëüíîìó ïîâðåæäåíèþ òêàíåé [20]. Â íàøèõ ýêñïåðèìåíòàõ îäíîðàçîâîå âîçäåéñòâèå
ýëåêòðîìàãíèòíîãî èçëó÷åíèÿ ÏÏË è ÊÑÄ ÷åðåç 24 ÷ òàêæå îêàçûâàåò
íîðìàëèçóþùåå äåéñòâèå íà àêòèâíîñòü èçîôîðì NOS è çàõâàò D-ãëþêîçû
ÈÊÊ êðîâè è ÊÌ (ðèñ. 1, 2). Ïðè÷åì ïîâûøåíèå ýíåðãèè ïîëóïðîâîäíèêîâîãî
7 4
ëàçåðíîãî îáëó÷åíèÿ ñ 600 äî 900 ìÄæ óñèëèâàåò ýôôåêò ÏÏË.  òî æå
âðåìÿ êîððèãèðóþùåå âëèÿíèå ÊÑÄ ñ ýíåðãèåé 900 ìÄæ ïðåâîñõîäèò ÏÏË ñ
ýíåðãèåé 600 ìÄæ è óñòóïàåò ïðè 900 ìÄæ. Ïðè ýòîì â ìîíîíóêëåàðàõ ìåæäó
ïîãëîùåíèåì D-ãëþêîçû è àêòèâíîñòüþ iNOS íàáëþäàåòñÿ ïîëîæèòåëüíàÿ
êîððåëÿöèÿ (r = 0 :8 1 3 1 ), à äëÿ ñNOS – îòðèöàòåëüíàÿ (r = ¡0 :6 8 4 1 ), êîòîðóþ
óñèëèâàþò L-àðãèíèí è êîôàêòîðû NOS (r = ¡0 :9 0 9 2 ), âåñüìà íåçíà÷èòåëüíî
âëèÿÿ íà êîððåëÿöèþ iNOS. Â íåéòðîôèëàõ êàðòèíà îáðàòíàÿ: ìåæäó
ïîãëîùåíèåì D-ãëþêîçû è àêòèâíîñòüþ iNOS êîððåëÿöèÿ îòðèöàòåëüíàÿ (r =
¡0 :4 8 5 8 ), à äëÿ ñNOS – ïîëîæèòåëüíàÿ(r = 0 :4 9 3 1 ), è â ýòîì ñëó÷àå L-àðãèíèí
è êîôàêòîðû NOS ìåíÿþò çíà÷åíèÿ êîýôôèöèåíòà ëèíåéíîé êîððåëÿöèè äëÿ
ñNOS (r = ¡0 :6 6 0 4 ), ïðàêòè÷åñêè íå âëèÿÿ íà iNOS. Ìåæäó ïîãëîùåíèåì Dãëþêîçû è àêòèâíîñòüþ iNOS êîñòíîãî ìîçãà ñâÿçü îáðàòíàÿ (r = ¡0 :5 4 4 7 ), ÷òî
íàáëþäàåòñÿ è äëÿ ñNOS (r = ¡0 :4 9 4 6 ), íî òîëüêî ïîä âëèÿíèåì L-àðãèíèíà
è êîôàêòîðîâ NOS. Ñëîæíóþ êàðòèíó âçàèìîñâÿçè ìåæäó èçîôîðìàìè
NOS è ñâÿçûâàíèåì D-ãëþêîçû êëåòêàìè êðîâè è ÊÌ, ïî-âèäèìîìó, ìîæíî
îáúÿñíèòü ðàçíîíàïðàâëåííûìè ñäâèãàìè â àêòèâíîñòè èçîôîðì NOS è
ìèêðîîêðóæåíèÿ, ÷òî ïðîÿâëÿåòñÿ in vitro â äèôôåðåíöèðîâàííîì âëèÿíèè
ñóáñòðàòà è êîôàêòîðîâ NOS. Ïî âñåé âåðîÿòíîñòè, ýëåêòðîìàãíèòíîå
èçëó÷åíèå îêàçûâàåò êàê ïðÿìîå, òàê è îïîñðåäîâàííîå âîçäåéñòâèå íà ýòè
ïðîöåññû.
Òàêèì îáðàçîì, êðàñíîå èçëó÷åíèå ïîëóïðîâîäíèêîâîãî ëàçåðà è ñâåòîäèîäà ìîæíî èñïîëüçîâàòü â öåëÿõ íåìåäèêàìåíòîçíîé êîððåêöèè èììóííîãî
íèòðåðãè÷åñêîãî îòâåòà è ýíåðãîîáåñïå÷åíèÿ ÈÊÊ êðîâè è ÊÌ ïðè ãðàìïîëîæèòåëüíîé èíôåêöèè. Ïîëó÷åíû äàííûå î ïðåèìóùåñòâå ëàçåðíîãî
âîçäåéñòâèÿ ïåðåä ñâåòîäèîäíûì, ÷òî, ïî-âèäèìîìó, ñâÿçàíî ñ òàêèìè ñïåöèôè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè ëàçåðíîãî èçëó÷åíèÿ, êàê êîãåðåíòíîñòü, ïîëÿðèçóåìîñòü è âûñîêàÿ ñòåïåíü ìîíîõðîìàòè÷íîñòè, âåðîÿòíî, âëèÿþùèìè íà ìåòàáîëè÷åñêèå ïðîöåññû â îðãàíèçìå.
Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. Ã.Õ. Áóíÿòÿíà ÍÀÍ ÐÀ
Î. À. Ìîâñåñÿí, Í. Õ. Àë÷óäæÿí, Í. Î. Ìîâñåñÿí, Ã. À. Ãåâîðêÿí
Àêòèâíîñòü íèòðåðãè÷åñêîé ñèñòåìû è ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû â êîñòíîì ìîçãå è
ñóáïîïóëÿöèÿõ ëåéêîöèòîâ êðîâè êðûñ, ïîäâåðãíóòûõ îáëó÷åíèþ
ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì è êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì ïðè êëîñòðèäèàëüíîì
ñåïñèñå
Clostridium perfringens-èíôèöèðîâàííûõ êðûñ ïîäâåðãëè îáëó÷åíèþ ïîëóïðîâîäíèêîâûì ëàçåðîì (¸ = 6 5 4 nm) è/èëè êðàñíûì ñâåòîâûì äèîäîì. Âûÿâëåíî èõ
7 5
ìîäóëèðóþùåå âëèÿíèå íà êàëüöèé-çàâèñèìóþ – êàëüöèé-íåçàâèñèìóþ àêòèâíîñòü
NO-ãåíåðèðóþùåé ýíçèìàòè÷åñêîé ñèñòåìû è ïîãëîùåíèå D-ãëþêîçû â êîñòíîì
ìîçãå è ñóáïîïóëÿöèÿìè ëåéêîöèòîâ êðîâè (ìîíîíóêëåàðû è íåéòðîôèëû). Ïîëó÷åíû äàííûå î ïðåèìóùåñòâå ïîëóïðîâîäíèêîâîãî ëàçåðà ïåðåä êðàñíûì ñâåòîäèîäîì
â îòíîøåíèè êîððèãèðóþùåãî âîçäåéñòâèÿ íà ýíåðãåòè÷åñêèé îáìåí è íèòðåðãè÷åñêóþ ñèñòåìó êðîâè è êîñòíîãî ìîçãà ïðè êëîñòðèäèàëüíîì ñåïñèñå.
Ð. ². Øáíë»ëÛ³Ý, Ü. Ê. ²ÉãáõçÛ³Ý, Ü. Ð. ØáíëÇëÛ³Ý, ¶. ². ¶¨áñ·Û³Ý
ÎÇë³Ñ³Õáñ¹ã³ÛÇÝ É³½»ñÇ áõ ϳñÙÇñ Éáõë³¹Çá¹Ç ׳鳷³ÛÃÙ³Ý ³½¹»óáõÃÛáõÝÁ
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³ÏïÇíáõÃÛ³Ý áõ D-·ÉÛáõÏá½Ç ÏɳÝÙ³Ý íñ³ ÏÉáëïñÇ¹Ç³É ë»åëÇëÇ Å³Ù³Ý³Ï
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H. A. Movsesyan, N. Kh. Alchujyan, N. H. Movsisyan, G. A. Kevorkian
Nitrergic System Activity and D-Glucose Uptake of Leucocyte Subpopulations and Bone
Marrow of Rats Treated with Half-Conducted Laser and Red Light Diode in Clostridial
Sepsis
Rats were infected with Clostridium perfringens and treated with half-conducted
laser (¸ = 6 5 4 nm) and/or red light diode. Irradiation caused changes in the activity
of calcium-dependent and calcium-independent NO-generating enzymatic system and Dglucose uptake of leucocyte subpopulations (mononuclears and neutrophils). We have
suggested the preference of half-conducted laser irradiation upon that of red-light diode
in the modulation of nitrergic system and energy metabolism during clostridial sepsis.
Ëèòåðàòóðà
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