образование экзополисахаридов на углеводных субстратах

Пирог, Т.П. Образование экзополисахаридов на углеводных субстратах
штаммом Acinetobacter sp. и особенности его С6-метаболизма / Т. П. Пирог, М.
А. Коваленко, Ю. В. Кузьминская // Микробиология. – 2002. – Т.71. № 2. – С.
215–221.
УДК 579.841: 577.15
ОБРАЗОВАНИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ НА УГЛЕВОДНЫХ
СУБСТРАТАХ ШТАММОМ Acinetobacter sp. И ОСОБЕННОСТИ
ЕГО С6-МЕТАБОЛИЗМА
Т.П.Пирог, М.А.Коваленко, Ю.В.Кузьминская
Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук
Украины, Киев
Показана
возможность
синтеза
выращивании штамма Acinetobacter sp.
экзополисахаридов
(ЭПС)
при
на углеводных субстратах (моно- и
дисахариды, меласса, крахмал). Установлено, что катаболизм глюкозы у данных
бактерий осуществляется по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и ЭнтнераДудорова. Пируват вовлекается в цикл трикарбоновых кислот при участии
пируватдегидрогеназы
(КФ
1.2.2.2).
Анаплеротической
реакцией,
обеспечивающей синтез интермедиатов для конструктивного метаболизма при
росте Acinetobacter sp. на С6-субстратах, является карбоксилирование пирувата
(фермент пируваткарбоксилаза, КФ
6.4.1.1). C6-метаболизм Acinetobacter sp.
лимитирован коэнзимом А.
Независимо от источника углеродного питания (глюкоза, этанол) в клетках
Acinetobacter sp. обнаружена высокая активность ключевых ферментов С2- и С6метаболизма.
Исключением
являлась
выращивании бактерий на глюкозе.
активность
изоцитратлиазы
при
Индукторами изоцитратлиазы у
Acinetobacter sp. являются С2-соединения (этанол или ацетат). Внесение С2соединений в среду с глюкозой сопровождалось одновременным потреблением
обоих субстратов, увеличением количества синтезированных ЭПС и повышением
их выхода по отношению к биомассе. Обсуждаются возможные механизмы
интенсификации синтеза ЭПС при культивировании Acinetobacter sp. на смеси С2-
2
С6- субстратов.
Штамм Acinetobacter sp. 12S является продуцентом комплексного
полисахаридного препарата (ЭПС) этаполана [1].
Ранее
была разработана
технология получения этаполана при использовании этанола в качестве источника
углерода,
разработаны
подходы
к
интенсификации
синтеза
управлению его составом и физико-химическими свойствами
этаполана,
[1, 2]. Однако
штамм Acinetobacter sp. 12S может расти и синтезировать ЭПС не только на С2-,
но и на C3-, С4- и С6-субстратах [1]. Это свойство выгодно отличает этот штамм от
других микробных продуцентов, которые синтезируют полисахариды при
выращивании только на углеводах (Xanthomonas campestris, Azotobacter vinelandii,
Scleroticum glucanicum) [1]. Способность Acinetobacter sp. 12S синтезировать ЭПС
на С2-С6-соединениях позволяет создать универсальную гибкую технологию
получения полисахаридов на основе широкого набора углеродных субстратов,
либо комплекс различных технологий, каждая из которых может быть
реализована в зависимости от экономической целесообразности, наличия и
доступности того или иного субстрата, необходимости получения ЭПС с
определенными физико-химическими свойствами.
В связи с изложенным выше целью данной работы являлось изучение
закономерностей роста и синтеза ЭПС штаммом Acinetobacter sp. 12S на
углеводных субстратах, изучение основных этапов метаболизма С6-соединений у
данных бактерий и разработка на основе полученных результатов подходов к
интенсификации синтеза ЭПС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты
исследований.
образующий штамм
Объектами
исследований
являлись
Acinetobacter sp. 12S, описанный нами ранее
ЭПС[1]
и
мутантный штамм Acinetobacter sp.1НГ, не образующий экзополисахариды [3].
Культивирование
Acinetobacter sp.
Бактерии выращивали на жидкой
минеральной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 - 6,8; KOH - 1,8; KCl - 1,4;
NH4NO3 - 0,6; MgSO4x7H2O - 0,4; CaCl2x2H2O - 0,1; FeSO4x7H2O - 0,001. В среду
дополнительно вносили 0,5% (по объему) дрожжевого автолизата и 0,0006%
3
пантотената кальция. В качестве источника углерода и энергии использовали
глюкозу в концентрации 10 г/л (1 масс.%), а также этанол в концентрации 1% (по
объему). При изучении способности штамма Acinetobacter sp. 12S синтезировать
ЭПС на углеводных субстратах в среду вносили маннозу, фруктозу, арабинозу,
галактозу, рамнозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гидролизованные мелассу и
крахмал ДЭ-60 в количествах, эквимолярных по углероду концентрации этанола.
Гидролиз мелассы осуществляли следующим образом: к 100 г мелассы добавляли
дистиллированную воду до конечного объема 200 мл, в полученный раствор
вносили 20 мл 1 н Н2SO4, после чего стерилизовали при 1120С в течение 30 мин.
Гидролиз крахмала ДЭ-60 осуществляли путем ферментативной обработки с
помощью амилазы и глюкоамилазы, как описано в работе [1].
Культивирование бактерий осуществляли также на среде, содержащей 1%
глюкозы, в которую дополнительно вносили этанол в концентрации 0,01 - 1%
(по объему) или ацетат в концентрации 0,02%. Ацетат вносили в среду в виде 20%
раствора ацетата натрия.
Бактерии Acinetobacter sp. выращивали в колбах на качалке (220 об/мин)
при 30оС, рН 6,8-7,0 в течение 16 - 96 ч. В качестве посевного материала
использовали суточную культуру, выращенную на смешанной агаризованной
среде: мясо-пептонный агар (МПА) и сусло-агар (СА) в соотношении 1:1.
Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности клеточной
суспензии
с последующим пересчетом на абсолютно сухой вес клеток по
калибровочному графику.
Количество синтезированных ЭПС устанавливали весовым методом [4].
Концентрацию пирувата в культуральной жидкости определяли по методу,
описанному в работе [5].
Концентрацию
хроматографии
на
этанола
хроматографе
определяли
«Цвет-4»
методом
с
пламенно
газо-жидкостной
ионизационным
детектором (колонка 2 м, твердый носитель целит-545, неподвижная жидкая
фаза полиэтиленгликоль ПЭГ-400 (20%), газ-носитель - гелий, температура
1500С).
Концентрацию
глюкозы
в
жидкости
4
определяли
Бактериальную
суспензию,
культуральной
глюкозооксидазным методом [6] .
Получение
бесклеточных
экстрактов.
полученную после культивирования Acinetobacter sp. 1НГ в жидкой минеральной
среде, центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС). Полученный осадок клеток
дважды отмывали от остатков среды 0,05 М трис-НСl
буфером (рН 7,0),
центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые клетки ресуспендировали в 0,05
М трис-НСl буфере (рН 7,0) и разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 30 с при
4оС на аппарате УЗДН-1. Полученный дезинтеграт центрифугировали (12000 g, 30
мин., 4оС), осадок отбрасывали, надосадочную жидкость использовали в качестве
бесклеточного экстракта.
Для получения бесклеточных экстрактов использовали клетки, находящиеся
в середине экспоненциальной фазы роста (16-18 ч культивирования на среде,
содержащей глюкозу и/или этанол в качестве источника углеродного питания).
Энзиматические
2.7.1.11)
[7],
анализы.
Активность
6-фосфофруктокиназы
6-фосфоглюконатдегидратазы
(КФ
4.2.1.12)
(КФ
[7],
фосфоенолпируваткарбоксилазы (КФ 4.1.1.31) [8] и пируваткарбоксилазы (КФ
6.4.1.1) [9] определяли по окислению НАДН+ при 340 нм.
Активность
глюкозодегидрогеназы
(КФ
1.1.1.118
и
КФ
1.1.1.119)
определяли по восстановлению НАД+ или НАДФ+ при 340 нм [7]. Активность
глюкозодегидрогеназы
(КФ
1.1.99.10)
определяли
по
восстановлению
дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметосульфата при 600 нм [10].
Активность
пируватдегидрогеназы
кетоглутаратдегидрогеназы
(КФ
1.2.4.2)
(КФ
[12],
1.2.2.2)
[11],
-
малатдегидрогеназы
(декарбоксилирующей) (КФ 1.1.1.38) [13] определяли по восстановлению НАД+
при 340 нм.
Активность алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.), альдегиддегидрогеназы
(КФ 1.2.1.3 и КФ 1.2.1.4) и изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) определяли как описано
в работе [14].
Активность ферментов определяли при температуре 28-30оС, оптимальной
5
для роста Acinetobacter sp., и выражали в нмоль/мин мг белка. Содержание белка
в бесклеточных экстрактах определяли по Bradford [15].
Определение скорости окисления субстратов интактными клетками
Acinetobacter sp. Скорость окисления этанола, ацетальдегида, ацетата калия и
глюкозы интактными клетками Acinetobacter sp. 1 НГ (скорость дыхания
интактных клеток в присутствии субстратов)
потребления
определяли по скорости
кислорода в реакционной смеси полярографически при помощи
электрода закрытого типа на полярографе ППТ-1 при температуре 28-30оС,
оптимальной для роста Acinetobacter sp. Удельную скорость потребления
кислорода выражали в нмоль О2/мин мг клеток. Концентрация субстратов
составляла 10 мМ.
Клетки Acinetobacter sp. 1НГ, полученные после культивирования в жидкой
минеральной
среде
с
глюкозой
(1%)
или
этанолом
(1%)
(16-18
ч,
экспоненциальная фаза роста), центрифугировали (4000 g, 15 мин., 4оС).
Полученный осадок клеток дважды отмывали от остатков среды 0,05 М
К+-
фосфатным буфером (рН 7,0) центрифугируя (4000 g, 15 мин., 4оС). Отмытые
клетки ресуспендировали в 0,05 М К+-фосфатном буфере (рН 7,0). Для инкубации
клеток при определении скорости окисления субстратов использовали трис-HCl
буфер (0,05 M, pH 7,0).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из представленных в табл. 1 данных видно, что
Acinetobacter sp.12S
растет и синтезирует ЭПС на многих углеводных субстратах, включая моно-,
дисахариды, а также мелассу и крахмал. В данных экспериментах
бактерии
выращивали на углеводных средах, не содержащих пантотеновую кислоту
(витамин В3), которая необходима при росте Acinetobacter sp. на С2-субстратах.
Следует отметить, что Acinetobacter sp. является ауксотрофом по этому витамину
[1]. Наиболее низкий уровень биомассы и ЭПС наблюдался при выращивании
бактерий на рамнозе и галактозе. При культивировании Acinetobacter sp. 12S на
средах, содержащих сахарозу, лактозу и мальтозу количество синтезированных
ЭПС было ниже, чем на некоторых моносахаридах (глюкозе, фруктозе, маннозе,
6
арабинозе). По-видимому, это обусловлено низкой активностью у Acinetobacter
sp. ферментных систем, осуществляющих гидролиз дисахаридов. В связи с этим
при использовании крахмала или мелассы в качестве источника углерода для
Acinetobacter sp. 12S эти субстраты были предварительно прогидролизованы.
ЭПС-синтезирующая способность исследуемого штамма при выращивании на
углеводных субстратах сравнима с таковой при росте на этаноле, однако при
культивировании на С6-соединениях наблюдали снижение рН культуральной
жидкости до 5,5-5,7 (табл.1).
Для выяснения возможных причин, обусловливающих снижение рН
культуральной жидкости при выращивании бактерий на углеводах, исследовали
основные этапы метаболизма С6-соединений у Acinetobacter sp. Для проведения
энзимологических исследований использовали мутантный штамм Acinetobacter
sp. 1 НГ, не образующий ЭПС. Клетки исходного ЭПС-синтезирующего штамма
оказались непригодными для таких исследований ввиду невозможности их
отделения от высоковязкого ЭПС с высокой молекулярной массой. Ранее такой
подход был применен нами при изучении особенностей С2-метаболизма у данных
бактерий [14], что позволило усовершенствовать технологию получения
этаполана на основе этанола.
Эксперименты показали, что основным путем расщепления глюкозы у
Acinetobacter sp. является
путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз, 1,6-
фруктозобифосфатный путь), часть глюкозы может ассимилироваться через путь
Энтнера-Дудорова (КДФГ-путь) (табл. 2). Об этом свидетельствовала высокая
активность 6-фосфофруктокиназы – одного из ключевых ферментов гликолиза и
6-фосфоглюконатдегидратазы – одного из ключевых ферментов КДФГ-пути. В
данной работе не исследовали активности ферментов пентозофосфатного цикла,
поскольку он не является основным путем катаболизма гексоз у бактерий, а
служит поставщиком НАДФН для реакций конструктивного метаболизма и
рибозы – для синтеза нуклеотидов [16, 17].
Известно, что у некоторых бактерий глюкоза расщепляется через
глюконат при участии
НАД(Ф)+- или пирролохинолинхинон-зависимых
7
глюкозодегидрогеназ [16, 18]. В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ не
обнаружена
НАД(Ф)+-зависимая
глюкозодегидрогеназная
активность,
а
активность пирролохинолинхинон-зависимой глюкозодегидрогеназы была крайне
низкой и не превышала 0,2 нмоль/мин мг белка (табл. 2).
Штаммы Acinetobacter sp. 12S и 1 НГ являются В3-зависимыми [1, 3]. В
бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1 НГ обнаружена пируватдегидрогеназная активность (табл. 2), причем при культивировании бактерий на
углеводных средах, не содержащих В3, активность данного фермента была в два
раза ниже, чем в присутствии В3 (табл. 3). Известно, что реакция, катализируемая
пируватдегидрогеназой,
требует
наличия
коэнзима
А,
предшественником
которого является витамин В3 [16]. Таким образом, снижение рН культуральной
жидкости при выращивании Acinetobacter sp. на углеводсодержащих средах без
В3 (табл. 1) могло быть обусловлено накоплением пирувата. Действительно, в
этом случае в культуральной жидкости был обнаружен пируват в концентрации
40-50 мМ (табл. 3). Внесение в глюкозосодержащую среду экзогенного витамина
В3 позволило предотвратить накопление пирувата и снижение рН культуральной
жидкости. Скорость дыхания в присутствии пирувата интактных клеток,
выращенных на среде, содержащей В3, была существенно выше, чем клеток,
культивируемых в отсутствие этого витамина (табл. 3). Таким образом, С6метаболизм бактерий, как и С2-метаболизм, лимитирован коэнзимом А.
Наличие в бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1 НГ активности  кетоглутаратдегидрогеназы (табл. 2) может свидетельствовать о том, что
данных
бактерий, вероятно,
у
функционирует полный цикл трикарбоновых
кислот.
В бесклеточном экстракте Acinetobacter sp.1НГ обнаружена высокая
активность пируваткарбоксилазы - одного из трех известных ферментов, которые
восполняют пул интермедиатов для реакций конструктивного метаболизма при
росте
на
С6-субстратах
[16,
17]
(табл.
2).
Не
выявлена
активность
фосфоенолпируваткарбоксилазы и малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей).
Наличие у Acinetobacter sp. пируваткарбоксилазы объясняет тот факт, что
8
бактерии способны расти на среде, содержащей пируват в качестве единственного
источника углерода и энергии [1]. Кроме того, при выращивании на пирувате
штамм Acinetobacter sp. 12S синтезирует ЭПС [1]. В этом плане интересны
исследования, проведенные с бактериями Xanthomonas campestris. Из литературы
известно, что эти бактерии хорошо растут на глюкозе и синтезируют при этом
большое количество полисахарида ксантана [19]. В тоже время использование
пирувата в качестве единственного источника углерода
обеспечивает лишь
слабый рост X. campestris при полном отсутствии синтеза ксантана [20]. Это,
однако, не означает, что бактерии не способны поглощать и утилизировать
экзогенный пируват, так как в присутствии глюкозы он вовлекается в метаболизм
[21]. Слабый рост на пирувате бактерий X. campestris и неспособность
синтезировать при этом ЭПС, вероятнее всего, связаны с отсутствием или низкой
активностью глюконеогенетической ветви обмена веществ.
Способность Acinetobacter sp.
расти и ситезировать ЭПС на С2-С3-
субстратах [1] свидетельствует о высокой активности у данных бактерий процесса
глюконеогенеза. Суть глюконеогенеза заключается в том, что из двух молекул С 3соединения образуется одна молекула фосфорилированной гексозы - глюкозо-6фосфата или фруктозо-6-фосфата [17]. При росте Acinetobacter sp. на С2соединениях синтез С4-дикарбоновых кислот (предшественников глюконеогенеза)
происходит в глиоксилатном цикле [14], одним из ключевых ферментов которого
является изоцитратлиаза.
Дальнейшие эксперименты показали, что интактные клетки Acinetobacter
sp. 1НГ, выращенные на этаноле, окисляли глюкозу, а клетки, выращенные на
глюкозе, были способны окислять также этанол, ацетальдегид и ацетат (табл. 4).
Активность ключевых ферментов метаболизма глюкозы при культивировании
Acinetobacter sp. 1 НГ на этаноле и ключевых ферментов трансформации этанола
при выращивании бактерий на глюкозе
оказались достаточно высокими, за
исключением активности изоцитратлиазы (табл. 2), что, возможно, связано с тем,
что
индукторами изоцитратлиазы являются С2-соединения [16, 22]. Чтобы
проверить
это,
были проведены эксперименты
с
внесением
различных
9
концентраций этанола в среду, содержащую 1% глюкозы. Установлено, что
активность изоцитратлиазы увеличивалась в 2 - 15 раз, причем наиболее высокая
изоцитратлиазная активность
отмечалась при низких концентрациях этанола
(табл. 5). Увеличение активности изоцитратлиазы до 50-60 нмоль/мин мг белка
наблюдалось также при внесении в среду с глюкозой ацетата (0,02%).
При
внесении С2-соединений активность пируваткарбоксилазы практически не
изменялась (табл. 5).
Следует отметить, что при выращивании бактерий на смеси этанола и
глюкозы не наблюдалось катаболитной репрессии: оба субстрата потреблялись
одновременно (рисунок).
Полученные данные послужили предпосылкой для
исследования
возможности интенсификации синтеза ЭПС штаммом Acinetobacter sp. 12S. В
результате было установлено, что при культивирования штамма Acinetobacter sp.
12S на среде
с глюкозой (1%) внесение этанола привело к увеличению
количества синтезированных ЭПС и их выхода по отношению к биомасе (табл. 6).
Причем по мере повышения в среде содержания С2-субстрата концентрация ЭПС
повышалась. Интересным оказался тот факт, что увеличение синтеза ЭПС
наблюдали при внесении в среду с глюкозой низких (0,02%) концентраций
ацетата. Как и в случае мутантного штамма 1 НГ, при культивировании ЭПСобразующего штамма на смешанном субстрате не отмечалось катаболитной
репрессии.
Мы предполагаем, что при выращивании Acinetobacter sp. 12S на смеси С2и С6-субстратов интенсификация синтеза ЭПС может быть обусловлена
следующими причинами.
1. При внесении С2-соединений в глюкозосодержащую среду повышается
активность
ферментов
глиоксилатного
цикла
-
дополнительной
анаплеротической последовательности реакций, приводящей к синтезу С4дикарбоновых кислот (см. табл. 5). Вполне вероятно, что образовавшиеся в
глиоксилатном цикле С4-дикарбоновые кислоты могут вовлекаться в процесс
глюконеогенеза, т.е. присутствие С2-соединений в среде с глюкозой может
10
индуцировать глюконеогенез. Такой механизм интенсификации синтеза ЭПС
представляется особо привлекательным при низких (0,01-0,02%) концентрациях
С2-соединений (этанола или ацетата) в среде с глюкозой, поскольку в этих
случаях активность изоцитратлиазы повышалась почти в 15 раз (по сравнению с
активностью данного фермента при выращивании на глюкозе).
2. При достаточно высоких концентрациях этанола (более 0,5%)
в
глюкозосодержащей среде этанол может использоваться бактериями в качестве
дополнительного источника энергии. Известно, что при росте на глюкозе около
40% углерода субстрата расходуется на окисление до СО2 с целью получения
энергии, необходимой для реакций конструктивного метаболизма [16]. Вполне
вероятно, что в присутствии этанола, который является «энергетически
избыточным» субстратом [14], существенно снижается расход углерода глюкозы
на энергетическое обеспечение процессов конструктивного метаболизма и
наблюдается более эффективная трансформация этого субстрата в ЭПС. Проверка
этих предположений будет являться целью наших дальнейших исследований.
Таким образом, в результате проведенной работы:
- показана возможность роста и синтеза ЭПС бактериями Acinetobacter sp.
12S на С6-соединениях;
- с использованием мутантного штамма Acinetobacter sp. 1 НГ, не
образующего ЭПС, определены основные пути катаболизма глюкозы в клетках
бактерий – гликолиз и КДФГ-путь. «Узким местом» метаболизма глюкозы у
Acinetobacter sp. является реакция, катализируемая пируватдегидрогеназой. С6метаболизм у исследованных бактерий, подобно С2-метаболизму, лимитирован
коэнзимом
А.
Анаплеротической
реакцией,
обеспечивающей
синтез
интермедиатов для конструктивного метаболизма при росте данного штамма. на
С6-соединениях, является карбоксилирование пирувата;
- в клетках Acinetobacter sp.1 НГ, выращенных на этаноле, обнаружена
высокая активность ключевых ферментов метаболизма глюкозы, а у бактерий,
выращенных на глюкозе – высокая активность ключевых ферментов метаболизма
этанола, за исключением изоцитратлиазы. Индукторами изоцитратлиазы у
11
Acinetobacter sp. являются С2-соединения;
- внесение С2-соединений в глюкозосодержащую среду
увеличивало
количество синтезированных ЭПС и повышало их выход по отношению к
биомассе Acinetobacter sp. 12S. При культивировании бактерий на смеси С2-С6субстратов не наблюдалось катаболитной репрессии;
- полученные результаты являются основой для разработки технологии
получения этаполана на углеводах, а также на смеси С2- и С6-субстратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный
синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. Киев: Наук. думка, 1992. 212 с.
2. Пирог Т.П. Принципы регуляции состава и физико-химических свойств
экзополисахаридов, синтезируемых Acinetobacter sp. Дисс… д-ра биол. наук.
Киев, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, 1999. 450 с.
3. Пирог Т.П., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. Получение и исследование
мутантных штаммов Acinetobacter sp., не образующих экзополисахариды //
Микробиология. 2000. 69, N 5. С. 674-680.
4. Williams A.G., Wimpenny W.T. Exopolysaccharide production by
Pseudomonas NCIB 11264 grown in continuous culture // J. Gen. Microbiol. 1978.
104. P. 47 – 57.
5. Sloneker J.N., Orentas D.G. Pyruvic acid a unique component of an exocellular
bacterial polysaccharide // Nature. 1962. 194, N 4827. P.478-479.
6. Лукомская И.С., Городецкий В.К. Применение микроцида
(глюкозооксидазы) для определения глюкозы крови в норме и при диабете //
Биохимия. 1961. 26, № 3. С. 477-482.
7. Wheller P.R. Catabolic pathways for glucoce, glycerol and 6-phosphogluconate
in Mycobacterium leprae grown in Armadillo tissues // J. Gen. Microbiol. 1983. 129,
N 5. P.1481-1495.
8. Utter M.F., Kurahashi K. Mechanism of action of oxalacetic carboxylase // J.
Biol. Chem. 1954. 207, N 2. P. 821-841.
9. Utter M.F., Keech D.B. Pyruvate Carboxylase. I. Nature of the reaction // J.
Biol. Chem. 1963. 238, N 8. P. 2603-2608.
10. Hauge J.G. Glucose dehydrogenation in bacteria: a comparative study // J.
Bacteriol. 1961. 82, N 4. P. 609-614.
11. Reed L. J., Willms C. R. Purification and resolution of the pyruvate
dehydrogenase complex (Escherichia coli) // In: Methods in enzymology (Ed.Wood
W.A.). New York and London: Acad. Press, 1966. Vol. 9. P. 247-265.
12. Mukherjee B. B., Matthews J., Horney D. L.,
Reed L.J. Resolution and
reconstitution of the Escherichia coli  -ketoglutarate dehydrogenase complex // J.
Biol. Chem. 1965. 240, N 5. P. 2268-2269.
12
13. Ochoa S. “Malic enzyme” // In: Methods in enzymology (Ed. Colowick S.P.
and Kaplan N.O.). New York: Acad. Press, 1955. Vol. 1. P. 739-753.
14. Пирог Т.П., Соколов И.Г., Кузьминская Ю.В., Малашенко Ю.Р.
Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter
sp., не образующего экзополисахариды // Микробиология. 2001. (В печати).
15. Bradford M. М. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding // Anal.
Biochem. 1976. 72. P. 248-254.
16. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. Москва: Мир, 1982. 312 с.
17. Малашенко Ю.Р., Соколов И.Г., Романовская В.А. Микробный
метаболизм неростовых субстратов. Киев: Наук. думка, 1987. 192 с.
18. Neijssel O.M., Hommes R.W.J., Postma P.W., Tempest D.W. Physiological
significanse and bioenergetic aspects of glucose dehydrogenase // Antonie van
Leeuwenhoek. 1989. 56, N 1. P. 51-61.
19. Jeans A., Pittsley J.E., Senti F.R. Polysaccharide B-1459; a new hydrocolloid
polyelectrolyte produced from glucose by bacterial fermentation // J. Appl. Polym.Sci.
1961. 5. P.519-526.
20. Pat. 4245046 USA, 103 C 09 J 3/02. Process for the fermentative production
of xanthan gum with organic acids / A.Z.Demain, P.Souw. – Publ.13.01.81.
21. Souw P. The effect of citrate and other organic acids in xanthan production //
Adv. Biotechnol. Proc. 6th Int. Ferment.Symp., London (Canada), July 20-25, 1980.
Toronto etc., 1981. Vol.3. P. 447-453.
22. Honer Zu Bentrup K., Miczak A., Swenson D. L., Russell D. G.
Characterization of activity and expression of isocitrate lyase in Mycobacterium avium
and Mycobacterium tuberculosis // J. Bacteriol. 1999. 181, N 23. P.7161-7167.