Флуоресцентные белки: свойства и применение

реклама
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ – ПРИРОДНОЕ
РАЗНООБРАЗИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ
Лукьянов С.А.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН
Glowfish
Реализация генетической информации
Дифференциальная экспрессия генов
Изучение экспрессии генов
Изучение
экспрессии
генов
Пробы для
детекции мРНК
in situ
Пробы для
детекции белка
in situ
‘Репортерные
гены’
In vivo
Большинство методов может быть использовано для срезов и для
whole mount гибридизации
Гидромедуза Aequorea victoria
Биолюминесценция
стимул
Фотопротеин
Фотопротеин
Изменение
конформации
белка
Окисленный
люциферин
свет
Гидромедуза Aequorea victoria
Осаму Шимомура и коллеги (1974 г)
Aequorea victoria GFP – вторичный
эмиттер в биолюминесцентной системе
медузы
Открытие:
Клонирование:
Первое использование:
Нобелевская премия:
Shimomura et al. (1962)
Prasher et al. (1992)
Chalfie et al. (1994) and Inouye &Tsuji (1994)
2008 год
4-5 нм
Структура GFP
11 -слоев образуют бочонок с -спиралью в середине (238 ак). Хромофор
образуется внутри глобулы путем автокаталитической циклизации остова
трех аминокислот (Ser65-Tyr66-Gly67)
Автокаталитическая циклизация
хромофора
Хромофор образуется внутри глобулы путем
автокаталитической циклизации остова трех
аминокислот (Ser65-Tyr66-Gly67)
OH Tyr 66
OH
OH
OH
H
N
O
O
NH
O Gly67
O
H
N OH
N
H
Ser 65
O
N
O2 , –H2O2
N
–H2O
O
N
Зеленый флуоресцентный белок, GFP
•
Генетически кодируется
•
Сам образует хромофор
•
Не нуждается в
низкомолекулярных
кофакторах и субстратах
Использование GFP
Анализ экспрессии
генов
Прижизненное мечение
организмов, тканей,
клеток, клеточных
структур и белков
Области применения GFP
Видно, где и когда включается промотор; можно
метить организмы или группы клеток
Области применения GFP
Можно следить за локализацией белков в живых
клетках
Области применения GFP
сигнал
внутриклеточной
локализации
Можно метить клеточные структуры
Эндоплазматический ретикулум
Комплекс Гольджи
Мутанты GFP
Yellow (EYFP, Venus, …) em 528 nm
Green (EGFP, Emerald, …) em 508 nm
Cyan (ECFP, Cerulean, …) em 475 nm
Blue (EBFP) em 448 nm
Wavelength, nm
Использование GFP и его мутантов
Анализ белок-белковых взаимодействий с
помощью резонансного переноса энергии
Фостера (Foster Resonance Energy Transfer,
FRET). Передача энергии от молекулы донора к
молекуле акцептора происходит посредством
диполь–дипольного взаимодействия.
Флуоресценция в дальнекрасной области
спектра предпочтительнее для
визуализации целых организмов (whole
body imaging)
Клонирование генов GFP-подобных
белков из коралловых полипов (1999)
Юлий Лабас
1933-2008
Matz et al., Nat Biotechnol. 1999
Окраска кораллов
Нефлуоресцентная
окраска кораллов также
обусловлена GFPподобными белками
Как возникает окраска
Вещество эффективно
поглощает среднюю
часть спектра видимого
света.
Комбинация оставшегося
синего и красного света
дает характерную
малиновую окраску.
Разноцветные, окрашенные и бесцветные
GFP-подобные белки из медуз
Aequorea coerulescens
(безцветный белок)
Phyalidium sp.
(желтый белок)
Antomedusae
(хромобелок)
Зеленые флуоресцентные белки копепод
(2004)
Mantis shrimp
C. H. Mazel et al., Science, 2004
Зеленый
флуоресцентный
белок ланцетника
(2007)
Эволюция GFP-подобных белков
Annelida
Nematoda
Crustacea
Mollusca
Arthropoda
Branchiostoma
Chordata
Echinodermata
Hydrozoa
Anthozoa
Cnidaria
Typhlocoela
Ctenophora
Porifera
1.0
0
400
450
mTFP1
TagCFP, Cerulean
Azurite, EBFP2
TagBFP
2.0
500
550
mOrange
600
mPlum
TagRFP, TagRFP-T
mStrawberry
mRuby
mCherry
mRaspberry
mKate2
mKO
Venus, TagYFP, Citrine, Topaz, SYFP2, etc.
EGFP, EmGFP, AcGFP1, Wasabi, TagGFP2, etc.
Sirius
Fluorecence, a.u.
Флуоресцентные белки: цветовое разнообразие
650
700
Wavelength, nm
Структура хромофоров природных
флуоресцентных белков
Расширение возможностей: использование GFPподобных белков для многоцветного мечения
внутриклеточных структур
HeLa
HeLa
HeLa
Окрашивание частей клетки с помощью
разноцветных флуоресцентных белков
Фиолетовый митохондрии
Синий цитоскелет
Зеленый микротрубочки
Желтый – аппарат
Гольджи
Красный - ядро
Whole body imaging
Сравнение в эмбрионах Xenopus laevis.
Трансгенные эмбрионы Xenopus laevis
экспрессирующие Катюшу и DsRed-Express
под контролем кардио-актинового промотера.
(a,с) Катюша, стадия эмбриона 33
(b,d) Головная часть, на срезе
(e-h) DsRed-Express, аналогичные фото.
Сердце визуализуется только на срезе
(i) 2.5 месячные лягушки.
Трансгенная мышь,
экспрессирующая
дальне-красный
флуоресцентный
белок Katushka в
поджелудочной
железе (островки
Лангенгарса)
Diéguez-Hurtado et al., 2010
Использование флуоресцентных белков
для скрининга лекарственных препаратов
Получение
флуоресцентных
стабильных
клеточных линий
Прививание
опухолей
Стабильно-трансфецированные
опухолевые клетки
Отбор и проверка
прототипов лекарственных
препартов
Визуализация
опухолей
Терапия
контроль
Контроль
Препарат 1
Препарат 2
опыт
Мечение опухолевых клеток в мыши
Рак простаты PC-3-RFP
Глиома U87-RFP
Глиома U87-RFP and GFP
Рак груди MDA-MB-435-GFP
Рак поджелудочной железы
MIA-PaCa-2-RFP
Рак кишечника HCT-116-RFP
Дальнекрасный белок mKate
mKate:
Excitation max - 588 nm
Emission max- 635 nm
Quantum yield - 0.36
Extinction coefficient 45,000 M-1cm-1
Connexin 43
Alpha-tubulin
Alpha-actinin
Vinculin
EB3 protein
Images were kindly provided by Michael W. Davidson (Florida State University)
mKate2-EB3 fusion
(microtubule end-binding protein)
By Michael W. Davidson (Florida State University)
mKate2.7- alpha actinin
Развитие Drosophila
Steltzer lab, Nat. Meth. 2007
Развитие рыбки Danio rario
Ras-GFP
мембрана
Гистон
H2B-RFP
наложение
Steltzer lab, Nat. Meth. 2007
Технология ―Brainbow‖
Livet et al. Nature 2007
~100 colors!
‗‗Fucci‘‘- индикатор клеточого цикла
Miyawaki lab, Cell 2008
Часы клеточного цикла в голове
эмбриона мыши
GFP — Cdt1, G1 фаза
RFP — Geminin, S/G2/M фазы
Miyawaki A. Cell, 2008
Флуоресцентный таймер
DIC
FITC
rhodamine
overlay
5
Mid-age
organelles
2h
4
Old
organelles
Young
organelles
5h
3
Early
expression
2
10h
1
50h
500
600
Wavelength, nm
Late
expression
700
Terkikh et al., 2000; Verkhusha et al., 2004
Фотоактивируемые
флуоресцентные
белки (2002)
«Фотоактивация» флуоресценции asulCP
asulCP – природный «разгорающийся»
флуоресцентный белок определяющий
пурпурную окраску щупалец морского
анемона Anemonia sulcata.
asulCP становиться ярко флуоресцентным
под действием зеленого света и гаснет под
действием синего.
Anemonia sulcata
Lukyanov et al., JBC 2000
Разжигание и гашение флуоресценции
asulCP
Палитра фотоактивируемых
флуоресцентных белков
PS-CFP2
Chudakov et al., Nat. Biotechnology, 2004
Перемещение белков
Скорость и направление
движения
Коэффициент диффузии
Выявление мобильных и
стабильных фракций
Обмен между
компартментами
Скорость обращения
Перемещение органелл
Скорость и направление
движения
Скорость обмена
содержимого
Деление и слияние
Перемещение клеток
Скорость и направление
движения
Локализация
Частота делений
Форма и объем
Время
Перемещение химерного белка PSCFP-hDAT внутри филоподий HEK293
клеток (в течение 15 мин)
Мониторинг фибрилларина с помощью
Dendra (точечная активация 488 нм лазером)
Дифракционный барьер
PALM/STORM и тд.
200 нм
10 нм
Аппрокимация:
функция рассеяния точки
(PSF)
Сверхразрешающая микроскопия: photoactivation
localization microscopy, PALM
Новая микроскопия позволяет преодолеть
дифракционный барьер.
Метод основан на повторяющихся циклах
фотоактивации, детекции и гашения
флуоресценции
Разрешение более чем 20 нм!
Betzig E, et al., Science 2006
Двухцветная PALM
PALM с использованием TagRFP
Большинство
флуоресцентных белков
время
TagRFP
время
Быстрое обесцвечивание - выход на “плато” фотоактивации
TagRFP-zyxin,
живые клетки HeLa,
активация одним лазером
Фрагмент 80x80 пикселей
Реконструкция
TagRFP-zyxin, живые клетки
TagRFP-zyxin
TagRFP-тубулин, фиксированные клетки
Зеленые флуоресцентные белки –
светоиндуцируемые доноры
электронов
Oxygen-independent green-to-red EGFP photoconversion in presence of electron acceptors ―oxidative redding‖
Fluorescence, %
Oxidative redding
100
0
Compound
E´0, V
n
K3[Fe(CN)6]
Benzoquinone
Cytochrome c
MTT
Glucose oxidase (FAD)
FMN
NAD+
0.42
0.29
0.22
-0.11
-0.22
-0.22
-0.32
1
2
1
2
2
2
2
EC50 for green
fluorescence
decrease, M
60
70
400
1200
10
100
n.d.
Excitation/ Emission
575 nm 607 nm
Wavelength
EC50 for red
fluorescence
increase, M
500
2000
>1500
4000
15
150
n.d.
Relative
redding
efficiency
100
80
5
80
4
15
0.5
Bogdanov et al., Nature Chem.Biol. 2009
Oxidative ―reddening‖ of EGFP
Bogdanov et al, Nat. Chem. Biol. 2009
Cytochrome c reduction by EGFP
0.7
Absorbance
0.6
0.5
0.4
CytC (+3)
0.3
CytC (+2)
0.2
EGFP
0.1
0
350
400
450
500
550
600
Wavelength, nm
Yield of reduced cyt c ~ 1,7!
EGFP reddening in mammalian cells
Redding of an endogenous green
fluorescent protein in vivo
Button polyp Zoanthus
Confocal optical section through tentacle
Zooxantella
50 m
488
Биологическая
роль GFPподобных
белков
Annelida
Nematoda
Crustacea
Mollusca
Arthropoda
Branchiostoma
Chordata
Echinodermata
Hydrozoa
Anthozoa
Cnidaria
Typhlocoela
Ctenophora
Porifera
1.
2.
3.
Вторичный эмиттер в биолюминесцентных системах
Защита от солнца для симбиотических водорослей кораллов
Окраска
4.
Трансфер электронов
Основные области применения флуоресцентных
белков
Glowfish
и другие…
Z. Gong et al.,
BBRC 2003;
S. Ding et al., Cell,
2005
X.Y.Yin et al., Biol.
Rep., 2007
Институт биоорганической химии им.
академиков М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова
Лаборатория Молекулярных технологий
Лаборатория Биофотоники
Группа Флуоресцентных инструментов
Лаборатория Молекулярных основ
эмбриогенеза
Лаборатория Ренгеноструктурного анализа
Группа Химии хромопротеинов
Институт Биохимии им. А.Н.Баха РАН
Нижегородская государственная
медицинская академия
Скачать