GFP (Green fluorescent Protein) – История. Структура и свойства
advertisement
GFP Green fluorescent Protein История Структура и свойства Применение Получение рекомбинантного GFP Сергей Крат, МБФ История Выделен вместе с другим светящимся белком экворином из медузы Aequorea victoria Осаму Симомурой (Jap) 1960 История • Дуглас Прэшер секвенировал и клонировал ген белка (1992) • Мартин Чалфи экспрессировал последовательность в Escherichia coli и Caenorhabditis elegans (Science, 1994) • Исследования Фредерика Тцуи (конформация) • Нобелевская премия по химии «за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка GFP» (Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Роджер Тсьен, 2008) GFP GFP Флуорофор = Ser65+Tyr66+Gly67 Свойства GFP • • • • • • 238 ако; 26,9 кДа; Пик фл-ии на 498 нм emission/excitation 395/509 ИЭТ [4,6–5,4] гидрофобный Применение GFP • Маркер в клеточной и молекулярной биологии Green fluorescent protein (GFP) as a vital marker for pathogenic development of the dermatophyte Trichophyton mentagrophytes Gil Kaufman, Benjamin A. Horwitz, Ruthi Hadar, others • Исследования в области вирусологии An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. van Remmerden Y, Xu F, van Eldik M, others Применение GFP • Исследования в области генной терапии Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research. Wahlfors J, Loimas S, Pasanen T, Hakkarainen T. • Иммуногистохимия Детекция экспрессии маркеров (оценка способности дифференцироваться у трансплантированных клеток в спинном мозге крысы) Использование GFP как метки в молекулярной биологии FACS Проточная цитометрия • • • • Иммунология Онкология Цитология Гематология Получение рекомбинантного GFP Задачи 1. Провести трансформацию E.Coli с pQE30GFP 2. Выделить плазмиду pQE30GFP 3. Экспрессировать GFP в E.coli 4. Выделить и очистить рекомбинантный GFP 5. Идентифицировать GFP методом иммуноблоттинга (Western-blotting) 6. Отработать методику определения концентрации GFP с использованием флуориметра VersaFluor (Bio-Rad) Провести трансформацию E.Coli Подобрать методику трансформации e.coli, например: Кальциевая трансформация, электропорация методика Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук «Методы генетической. Молекулярное клонирование.» (стр.240, гл.8) Выделить и очистить экспрессированный GFP На данном этапе работы необходимо разрушить клетки и разделить растворимые элементы, от нерастворимых. Далее необходимо из полученного образца выделить GFP. Можно использовать классические методы биохимии (сорбция, молек.сито, ИЭО и пр) в сочетании с более современными методами. Выделить рекомбинантный белок можно с помощью метода металл-аффинной хроматографии (IMAC) Руководство к практикуму по генной инженерии Евроген
