380 ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6 ÓÄÊ 577.175.8 ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÓÃËÅÂÎÄ-ÐÀÑÏÎÇÍÀÞÙÈÕ ÖÅÍÒÐΠÀÍÃÈÎÒÅÍÇÈÍ-ÏÐÅÂÐÀÙÀÞÙÈÕ ÔÅÐÌÅÍÒΠÁÛÊÀ È ×ÅËÎÂÅÊÀ 1 1 2 2 1 ×åìîäàíîâà Å.Å. , Îðò Ò.À , Íàñîíîâ Â.Â. , Áîâèí Í.Â. , Êîñò Î.À. *. 1 ( Õèìè÷åñêèé ôàêóëüòåò, Ìîñêîâñêèé Ãîñóäàðñòâåííûé Óíèâåðñèòåò èì. Ì. Â. Ëîìîíîñîâà, Ìîñêâà 119899, Ðîññèÿ; 2Èíñòèòóò Áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà, ÐÀÍ, óë. Ìèêëóõî-Ìàêëàÿ, 16/10, Ìîñêâà 117871, Ðîññèÿ, Fax: (7 ) (095) 9395417. Phone: (7) (095) 9393417. E-mail: [email protected]) Ïîêàçàíî, ÷òî àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèå ôåðìåíòû (ÀÏÔ) áûêà è ÷åëîâåêà ìîãóò ñóùåñòâîâàòü â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë, ìîäåëèðóþùèõ ìåìáðàííîå îêðóæåíèå ôåðìåíòà, êàê â ìîíîìåðíîé, òàê è äèìåðíîé ôîðìàõ ñ ñîõðàíåíèåì êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Äèìåðèçàöèÿ ÿâëÿåòñÿ îáðàòèìûì ïðîöåññîì è ñïåöèôè÷íî êîíòðîëèðóåòñÿ óãëåâîäàìè. Èçó÷åíî âëèÿíèå óãëåâîäîâ ðàçëè÷íîé ñòðóêòóðû íà îáðàçîâàíèå äèìåðîâ ÀÏÔ. Ñïåöèôèêà äåéñòâèÿ óãëåâîäîâ íà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ïðàêòè÷åñêè îäèíàêîâà. Ðàçëè÷èÿ íàáëþäàþòñÿ ëèøü âî âëèÿíèè íåêîòîðûõ îëèãîñàõàðèäîâ, òàêèõ êàê 3′′SiaLac, 6′′SiaLac, Lac-ol. Ïîêàçàíî, ÷òî àñèàëî- è àãàëàêòî-ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ñïîñîáíû ê ôîðìèðîâàíèþ äèìåðîâ â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë, â òî âðåìÿ êàê àñèàëî-àãàëàêòî-ÀÏÔ íå îáðàçóåò äèìåðà. Ñîìàòè÷åñêèé àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèé ôåðìåíò (ÀÏÔ, ïåïòèäèë-äèïåïòèäãèäðîëàçà, ÊÔ 3.4.15.1) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îäèí èç ôèçèîëîãè÷åñêè âàæíûõ ãëèêîïðîòåèíîâ â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà è æèâîòíûõ. Îäíîé èç íàèáîëåå èçó÷åííûõ ôèçèîëîãè÷åñêèõ ôóíêöèé ÀÏÔ ÿâëÿåòñÿ ó÷àñòèå â ðåãóëÿöèè êðîâÿíîãî äàâëåíèÿ è âîäíî-ñîëåâîãî îáìåíà [1]. Ñîìàòè÷åñêèé ÀÏÔ N-ãëèêîçèëèðîâàí; ñîäåðæàíèå óãëåâîäîâ (733%), êîëè÷åñòâî ñàéòîâ ãëèêîçèëèðîâàíèÿ, à òàêæå ñòðóêòóðà îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé ñèëüíî çàâèñÿò îò èñòî÷íèêà âûäåëåíèÿ ôåðìåíòà [2, 3]. ÀÏÔ ÷åëîâåêà è áûêà èìåþò 17 è 16 ïîòåíöèàëüíûõ ñàéòîâ äëÿ N-ãëèêîçèëèðîâàíèÿ, ñîîòâåòñòâåííî [4, 5], íî êîëè÷åñòâî ðåàëüíî ãëèêîçèëèðîâàííûõ ñàéòîâ äëÿ ÀÏÔ ÷åëîâåêà, êðûñû, êðîëèêà è ìîðñêîé ñâèíêè áûëî îöåíåíî ðàâíûì 78 [3]. Ñâîè îñíîâíûå ôèçèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè ÀÏÔ âûïîëíÿåò â ñîñòàâå áèîëîãè÷åñêèõ ìåìáðàí.  ýòèõ óñëîâèÿõ ñâîéñòâà ôåðìåíòà ìîãóò ñóùåñòâåííî îòëè÷àòüñÿ îò åãî ñâîéñòâ â âîäíîé ãîìîãåííîé ñðåäå. Äëÿ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíîãî âëèÿíèÿ ìåìáðàííîãî ìèêðîîêðóæåíèÿ íà õàðàêòåðèñòèêè ôåðìåíòà èñïîëüçóþò ìîäåëüíûå ñèñòåìû, òàêèå êàê ñèñòåìà îáðàùåííûõ ìèöåëë ÀÎÒâîäàîêòàí [6]. Êàòàëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ôåðìåíòîâ â ýòîé ñèñòåìå çàâèñèò îò ñòåïåíè ãèäðàòàöèè W0 ïàðàìåòðà, îïðåäåëÿþùåãî ðàçìåðû âíóòðåííåé ïîëîñòè ìèöåëë. Ïîäîáíûå çàâèñèìîñòè îáû÷íî èìåþò êîëîêîëîîáðàçíûé âèä, ãäå îïòèìóì àêòèâíîñòè ïðèõîäèòñÿ íà ñòåïåíü ãèäðàòàöèè, êîòîðàÿ îòâå÷àåò ðàäèóñó âíóòðåííåé ïîëîñòè ìèöåëëû, ñîâïàäàþùåìó ñ ðàäèóñîì ãëîáóëû ôåðìåíòà [6]. Èñïîëüçîâàíèå ýòîé ñèñòåìû ïîçâîëèëî ïîêàçàòü, ÷òî ÀÏÔ èç ëåãêèõ áûêà ìîæåò ôóíêöèîíèðîâàòü â ìîíîìåð- *Àäðåñàò äëÿ ïåðåïèñêè. íîé è äèìåðíîé ôîðìàõ, ïðè÷åì îáðàçîâàíèå äèìåðà ñïåöèôè÷íî êîíòðîëèðóåòñÿ óãëåâîäàìè [7]. Ýòè äàííûå ïîçâîëèëè ïðåäïîëîæèòü ñóùåñòâîâàíèå íà ìîëåêóëå ôåðìåíòà óãëåâîä-ðàñïîçíàþùåãî öåíòðà.  íàñòîÿùåé ðàáîòå îöåíåíû ñòðóêòóðíûå òðåáîâàíèÿ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà. Ìàòåðèàëû è ìåòîäû Íåéðàìèíèäàçà (Å.Ñ. 3.2.1.18) èç Vibrio cholerae è β-ãàëàêòîçèäàçà èç Aspergillus oryzae («Serva», Ãåðìàíèÿ). Ôóðèëàêðèëîèë-L-ôåíèëàëàíèë-ãëèöèë-ãëèöèí (FA-Phe-GlyGly) («Sigma», ÑØÀ). Íàòðèåâàÿ ñîëü äè-(2-ýòèë)ãåêñèëîâîãî ýôèðà ñóëüôîÿíòàðíîé êèñëîòû (àýðîçîëü ÎÒ, ÀÎÒ) («Fluka», Àâñòðèÿ). Ìîíîñàõàðèäû, ìåòèëãëèêîçèäû, ëàêòîçà, ñèàëèëëàêòîçû, ñèàëèëëàêòîçàìèí («Sigma», ÑØÀ). Îëèãîñàõàðèäíûå öåïè ÀÏÔ áûêà, α1-êèñëîãî ãëèêîïðîòåèíà ÷åëîâåêà, îâàëüáóìèíà, ôåòóèíà, èììóíîãëîáóëèíà G è α-ôèáðèíîãåíà ïîëó÷åíû ãèäðàçèíîëèçîì. Ïîëó÷åíèå ÀÏÔ. ÀÏÔ âûäåëÿëè èç ëåãêèõ áûêà èëè ìåìáðàííîé ôðàêöèè ïî÷åê ÷åëîâåêà ýêñòðàêöèåé â 50 ìM ôîñôàòíîì áóôåðå (ðÍ 7,5), ñîäåðæàùåì 150 ìM NaCl, 1 ìêM ZnCl2, 0,1% Òðèòîí X-100. Çàòåì ôåðìåíòû î÷èùàëè äî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ãîìîãåííîñòè ïîñðåäñòâîì àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè íà ëèçèíîïðèë-àãàðîçå [8]. Ïðè âûäåëåíèè ÀÏÔ ÷åëîâåêà áîðàòíûé áóôåð ñîäåðæàë 0,1% Tðèòîíà Õ-100. Ïîëó÷åíèå àñèàëî-ÀÏÔ. Äåñèàëèðîâàíèå ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ íåéðàìèíèäàçû (0,3 åä. íà 0,05 ìã ÀÏÔ) ïî [8]. Ïîëó÷åíèå àãàëàêòî-ÀÏÔ. Äåãàëàêòîçèëèðîâàíèå íàòèâíîãî ÀÏÔ èëè àñèàëî-ÀÏÔ îñóùåñòâëÿëè β-ãàëàêòîçè- ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6 äàçîé (0,1 åä. íà 0,05 ìã ÀÏÔ) â 0,5 ìë 0,05 Ì öèòðàòíîôîñôàòíîãî áóôåðà ïðè ðÍ 6,0. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â òå÷åíèå 24 ÷ ïðè 37°. Êèíåòè÷åñêèå ýêñïåðèìåíòû â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ òðîéíîé ñèñòåìû ÀÎÒâîäàîêòàí ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî â [7]. Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå 381 A0, % % 100 80  ðàáîòå ìû èññëåäîâàëè ÀÏÔ, âûäåëåííûé èç ëåãêèõ áûêà, è ÀÏÔ, âûäåëåííûé èç êîðû ïî÷åê ÷åëîâåêà. Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû ôåðìåíòîâ áûëè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè ãîìîãåííûìè. Cîäåðæàíèå àêòèâíûõ ìîëåêóë äëÿ îáîèõ ôåðìåíòîâ ñîñòàâëÿëî 9597%.  âîäíûõ ðàñòâîðàõ ôåðìåíò îáû÷íî ôóíêöèîíèðóåò â âèäå ìîíîìåðà [9], íî åñòü äàííûå î òîì, ÷òî â ýêñòðàêòàõ è êîíöåíòðèðîâàííûõ ðàñòâîðàõ [10] ÀÏÔ ìîæåò àãðåãèðîâàòü. Áîëåå òîãî, ïðîâåäåíèå ýëåêòðîôîðåçà â íåäåíàòóðèðóþùèõ óñëîâèÿõ ïîêàçàëî [3],÷òî ÀÏÔ èç íåñêîëüêèõ èñòî÷íèêîâ ñïîñîáíû äèìåðèçîâàòüñÿ. Ðàíåå ìû ïðîäåìîíñòðèðîâàëè ñïîñîáíîñòü ÀÏÔ áûêà ôîðìèðîâàòü äèìåð â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ òðîéíîé ñèñòåìû ÀÎÒâîäàîêòàí [7].  äàííîé ðàáîòå ìû ïðèìåíèëè ýòîò ïîäõîä äëÿ ôåðìåíòà ÷åëîâåêà. Äëÿ îáîèõ ôåðìåíòîâ íà çàâèñèìîñòè êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè îò ñòåïåíè ãèäðàòàöèè íàáëþäàëîñü äâà îïòèìóìà ïðè W0 = 27 è 31 (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1), óêàçûâàþùèå íà ñóùåñòâîâàíèå 1 60 2 3 40 20 25 30 35 W0, [H2O]/[AOT] Ðèñ. 2. Âëèÿíèå íà îáðàçîâàíèå äèìåðà ÀÏÔ ÷åëîâåêà â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû (Neu5Ac), ìM: 1 1; 2 6 ; 3 10 (0,3 Ì ÀÎÒ â îêòàíå, 50 ìÌ Hepes-áóôåð c pH 7,5, ñîäåðæàùèé 150 ìÌ NaCl, 10 ìêÌ ZnCl2, êîíöåíòðàöèÿ ÀÏÔ 108 Ì, êîíöåíòðàöèÿ ñóáñòðàòà 7,5⋅10 5 Ì) Òàáëèöà 1 Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà A0, % Óãëåâîäû 100 Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé íå íàáëþäàåòñÿ îáðàçîâàíèå äèìåðà ôåðìåíòà, Ì ÀÏÔ áûêà ÀÏÔ ÷åëîâåêà Ìîíîñàõàðèäû 80 1 60 Glc, GalNAc GlcNAc Man, Neu5Acβ–OMe Fuc Galβ–OÌe Gal Galβ–OÌe Neu5Ac Neu5Acα–OÌe 10–1 10–2 10–3 10–4 10–4 10–5 10–5 10–5 10–5 10–1 10–2 10–3 10–4 10–4 10–5 10–5 10–5 10–5 10–3 10–5 10–5 10–6 10–6 10–6 10–3 10–4 10–6 10–5 10–6 10–6 10–7 10–7 10–7 10–6 10–3 10–7 10–7 10–7 10–5 10–3 Îëèãîñàõàðèäû 40 2 20 25 30 35 W0, [H2O]/[AOT] Ðèñ. 1. Çàâèñèìîñòü êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÀÏÔ îò ñòåïåíè ãèäðàòàöèè â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ òðîéíîé ñèñòåìû ÀÎÒâîäàîêòàí (àêòèâíîñòü ÀÏÔ ïðè ñòåïåíè ãèäðàòàöèè W î = 27 ïðèíÿòà çà 100%): 1 íàòèâíûé, àñèàëî- èëè àãàëàêòî-ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà; 2 ïîñëåäîâàòåëüíî àñèàëèðîâàííûé, àãàëàêòîçèëèðîâàííûé ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà (0,3 Ì ÀÎÒ â îêòàíå, 50 ìÌ Hepesáóôåð c pH 7,5, ñîäåðæàùèé 150 ìÌ NaCl, 1 ìêÌ ZnCl2, êîíöåíòðàöèÿ ÀÏÔ 10 8 Ì, êîíöåíòðàöèÿ ñóáñòðàòà 7,5⋅10 5 Ì) Lac Lac-ol 6'SiaLac 3'SiaLac 3'SiaLac-ol 3'SiaLacNAc Ïóë îëèãîñàõàðèäîâ* OSagp Osfg OSIgG OSf Osov * Ïóë N-öåïåé α 1-êèñëîãî ãëèêîïðîòåèíà (OSagp ); àñèàëî-áèàíòåííûå öåïè α-ôèáðèíîãåíà (OSfg) èëè èììóíîãëîáóëèíà G (OSIgG); òðèàíòåííûå öåïè ôåòóèíà (OSf); âûñîêîìàííîçíûå öåïè îâàëüáóìèíà (OSov). 382 äâóõ ôîðì ôåðìåíòà. Ðåçóëüòàòû ñåäèìåíòàöèîííîãî àíàëèçà, ïðîâåäåííûå äëÿ ÀÏÔ áûêà [7] ïîêàçàëè, ÷òî ïðè ñòåïåíÿõ ãèäðàòàöèè íèæå W0 << 30 â ñèñòåìå íàõîäèòñÿ ìîíîìåðíàÿ ôîðìà ÀÏÔ, à ïðè W 0 >> 30 òîëüêî åãî äèìåðíàÿ ôîðìà. Òàêèì îáðàçîì, ïåðâûé ìàêñèìóì àêòèâíîñòè ïðè W0 = 27 ñîîòâåòñòâóåò ôóíêöèîíèðîâàíèþ â ñèñòåìå ìîíîìåðà, à âòîðîé ìàêñèìóì ïðè W0 =31 ôóíêöèîíèðîâàíèþ äèìåðà ôåðìåíòà. Òàêèì îáðàçîì, ñïîñîáíîñòü ê îáðàçîâàíèþ êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíîé äèìåðíîé ôîðìû ÿâëÿåòñÿ îáùèì ñâîéñòâîì ñîìàòè÷åñêèõ äâóäîìåííûõ àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèõ ôåðìåíòîâ èç ðàçëè÷íûõ èñòî÷íèêîâ. Äèìåðèçàöèþ íàòèâíîãî ñîìàòè÷åñêîãî ÀÏÔ ìîæíî íàðóøèòü äîáàâëåíèåì ñâîáîäíûõ óãëåâîäîâ â ðåàêöèîííóþ ñðåäó. Äëÿ ÀÏÔ ÷åëîâåêà áûëè ïîëó÷åíû äàííûå, äåìîíñòðèðóþùèå âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà ôîðìèðîâàíèå âòîðîãî îïòèìóìà ïðè W0 = 31, ñîîòâåòñòâóþùåãî ôóíêöèîíèðîâàíèþ äèìåðà. Òàê, íàïðèìåð, óâåëè÷åíèå ñîäåðæàíèÿ N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû â ñèñòåìå ïðèâîäèëî ê ïîñòåïåííîìó óìåíüøåíèþ è, íàêîíåö, èñ÷åçíîâåíèþ âòîðîãî ïèêà àêòèâíîñòè ÀÏÔ (ðèñ. 2), àíàëîãè÷íî íàáëþäàåìûì ðàíåå ðåçóëüòàòàì [7] äëÿ ÀÏÔ áûêà. Ïîëó÷åííûå äàííûå ïîçâîëÿþò çàêëþ÷èòü, ÷òî îáðàçîâàíèå äèìåðîâ îáîèõ ôåðìåíòîâ îñóùåñòâëÿåòñÿ çà ñ÷åò îäèíàêîâûõ âçàèìîäåéñòâèé ñ ó÷àñòèåì ñîáñòâåííûõ îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé ÀÏÔ, ò.å. âçàèìîäåéñòâèå ÀÏÔÀÏÔ ïðîèñõîäèò çà ñ÷åò îáðàçîâàíèÿ óãëåâîä-áåëêîâûõ êîíòàêòîâ ñ ó÷àñòèåì óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ýòèõ ôåðìåíòîâ. Ñâîáîäíûå óãëåâîäû, äîáàâëåííûå â ðåàêöèîííóþ ñðåäó, êîíêóðèðóþò ñ îëèãîñàõàðèäíûìè öåïÿìè îäíîé ìîëåêóëû ÀÏÔ çà öåíòð ñâÿçûâàíèÿ íà äðóãîé. Òàêèì îáðàçîì, ñâîáîäíûå óãëåâîäû ìîãóò áûòü ðàññìîòðåíû êàê èíãèáèòîðû äèìåðèçàöèè ÀÏÔ, à ïîäàâëåíèå äèìåðèçàöèè ÀÏÔ óãëåâîäàìè ðàçíîãî ñòðîåíèÿ, â ñâîþ î÷åðåäü, ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî êàê ïîäõîä äëÿ èçó÷åíèÿ ñïåöèôè÷íîñòè è ñòðóêòóðû óãëåâîä-ðàñïîçíàþùåãî öåíòðà íà ìîëåêóëå ôåðìåíòà. Äàííûå ïî ñïåöèôèêå âëèÿíèÿ óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ïðèâåäåíû â òàáë. 1. Çà ýôôåêòèâíîñòü èíãèáèðóþùåé ñïîñîáíîñòè óãëåâîäîâ áûëà âçÿòà êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, íåîáõîäèìàÿ äëÿ ïîëíîãî ïîäàâëåíèÿ äèìåðèçàöèè. Îêàçàëîñü, ÷òî ñòåïåíü âëèÿíèÿ óãëåâîäîâ ñèëüíî çàâèñèò îò èõ ñòðóêòóðû. Èç ìîíîñàõàðèäîâ íàèáîëüøåé èíãèáèòîðíîé ñïîñîáíîñòüþ îáëàäàþò ãàëàêòîçà è N-àöåòèëíåéðàìèíîâàÿ êèñëîòà, ÿâëÿþùèåñÿ êîíöåâûìè â îëèãîñàõàðèäíûõ öåïÿõ êîìïëåêñíîãî òèïà N-ãëèêîïðîòåèíîâ. Ëàêòîçà îáëàäàåò äîâîëüíî ñëàáîé èíãèáèðóþùåé ñïîñîáíîñòüþ ïî îòíîøåíèþ ê äèìåðèçàöèè ÀÏÔ, íî ëàêòèòîë èíãèáèðóåò äèìåðèçàöèþ ôåðìåíòà ãîðàçäî áîëåå ýôôåêòèâíî (îñîáåííî ïî îòíîøåíèþ ê ôåðìåíòó áûêà). Òàêèì îáðàçîì, î÷åâèäíî, îñòàòîê ãëþêîçû â ýòîì äèñàõàðèäå íàðóøàåò ñâÿçûâàíèå ñ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì ôåðìåíòà. Åùå áîëåå ýôôåêòèâíûìè îêàçàëèñü ñèàëèëëàêòîçû, ïðè÷åì 3′-ñèàëèë- ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6 Òàáëèöà 2 Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà íàòèâíîãî, àãàëàêòî- è àñèàëî-ÀÏÔ áûêà Óãëåâîäû Neu5Ac Gal Lac 3'SiaLac Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé íå íàáëþäàåòñÿ îáðàçîâàíèå äèìåðà ôåðìåíòà, Ì Íàòèâíûé ÀÏÔ 10−5 10−5 10−3 8⋅10−7 àãàëàêòî-ÀÏÔ 6⋅10−6 4⋅10−5 2⋅10−3 4⋅10−7 àñèàëî-ÀÏÔ 5⋅10−5 5⋅10−6 5⋅10−4 2⋅10−6 Òàáëèöà 3 Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà íàòèâíîãî, àãàëàêòî- è àñèàëî- ÀÏÔ ÷åëîâåêà Óãëåâîäû Neu5Ac Gal Lac 3′SiaLac Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé íå íàáëþäàåòñÿ îáðàçîâàíèå äèìåðà ôåðìåíòà, Ì Íàòèâíûé ÀÏÔ, Ì àãàëàêòî-ÀÏÔ, Ì àñèàëî-ÀÏÔ, Ì 9⋅10−6 8⋅10−6 10−3 9⋅10−6 5⋅10−6 10−4 10−2 5⋅10−6 6⋅10−5 2⋅10−6 2⋅10−4 4⋅10−5 ëàêòîçà áîëåå ýôôåêòèâíî èíãèáèðîâàëà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ áûêà, à 6′-ñèàëàëëàêòîçà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ ÷åëîâåêà. Áîëåå ýôôåêòèâíîå äåéñòâèå îëèãîñàõàðèäîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìîíîñàõàðèäàìè ñâèäåòåëüñòâóåò î íàëè÷èè ïðîòÿæåííûõ êîíòàêòîâ ïðè âçàèìîäåéñòâèè ÀÏÔ ñ óãëåâîäîì. Ïðè ýòîì ïåðâûé è âòîðîé óãëåâîäíûå îñòàòêè â îëèãîñàõàðèäíîé öåïè îêàçûâàþòñÿ íàèáîëåå âàæíûìè äëÿ âçàèìîäåéñòâèÿ ñ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì ÀÏÔ. Ñòðóêòóðíûå âàðèàöèè â ãëþêîçíîì îñòàòêå òðèñàõàðèäà 3′SiaLac (3′SiaLac, 3′SiaLac-ol, 3′SiaLacNAc) íå âëèÿëè íà èíãèáèðîâàíèå äèìåðèçàöèè ÀÏÔ áûêà, îäíàêî âëèÿëè íà èíãèáèðîâàíèå ÀÏÔ ÷åëîâåêà, ÷òî ìîæåò óêàçûâàòü íà ñâÿçûâàíèå òðåòüåãî îñòàòêà â îëèãîñàõàðèäíîé öåïè óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì ÀÏÔ ÷åëîâåêà, íî íå áûêà. Ñ äðóãîé ñòîðîíû, äàííûå ïî âëèÿíèþ Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc, Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAc, Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc ïîêàçûâàþò íåçíà÷èòåëüíîå âëèÿíèå òðåòüåãî ìîíîñàõàðèäà íà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ ÷å–6 –6 –6 ëîâåêà (8⋅10 M, 9⋅10 M è 5⋅10 M ñîîòâåòñòâåííî). Íàèáîëåå ñèëüíûìè èíãèáèòîðàìè äèìåðèçàöèè ÀÏÔ êàê áûêà, òàê è ÷åëîâåêà îêàçàëèñü îëèãîñàõàðèäíûå áèàíòåííûå öåïè êîìïëåêñíîãî òèïà, âûäåëåííûå èç äðóãèõ ãëèêîïðîòåèíîâ (òàáë. 1). Òîò ôàêò, ÷òî óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèé öåíòð ýôôåêòèâíî ñâÿçûâàåò òåðìèíàëüíûå îñòàòêè Gal è Neu5Ac N-öåïåé êîìïëåêñíîãî òèïà è ñàìè êîìïëåêñíûå öåïè, ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî êðèòè÷åñêóþ ðîëü â àññîöèàöèè ìîíîìåðîâ ôåðìåíòîâ èãðàþò óãëåâîäíûå öåïè ÀÏÔ ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6 êîìïëåêñíîãî òèïà, à èìåííî âõîäÿùèé â íèõ òåðìèíàëüíûé äèñàõàðèä Neu5Acα2-3Galβ. Íåçíà÷èòåëüíûå îòëè÷èÿ â ñïåöèôè÷íîñòè óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà óêàçûâàþò íà òî, ÷òî ýòîò öåíòð ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé êîíñåðâàòèâíûé ó÷àñòîê íà áåëêîâîé ãëîáóëå. Êàê óæå áûëî îòìå÷åíî, ðàçíûå ïî ñòðóêòóðå ìîíîñàõàðèäû Gal è Neu5Ac – ïðîÿâëÿþò îäèíàêîâîå ñðîäñòâî ê ìîëåêóëå ÀÏÔ. Îäíèì èç îáúÿñíåíèé ýòîìó ôàêòó ìîãëî áûòü ñóùåñòâîâàíèå íà áåëêå äâóõ ðàçíûõ óãëåâîäðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ñ ðàçíûìè ñòðóêòóðíûìè òðåáîâàíèÿìè, èç êîòîðûõ ïåðâûé ñïåöèôè÷åí ê Gal, à âòîðîé ê Neu5Ac. Îäíàêî, åñëè áû ÀÏÔ èìåë äâà öåíòðà, òî äèìåð àñèàëî-ÀÏÔ ôîðìèðîâàëñÿ áû çà ñ÷åò âçàèìîäåéñòâèÿ êîíöåâûõ ãàëàêòîçèëüíûõ îñòàòêîâ îäíîé ìîëåêóëû ôåðìåíòà è Gal-ñâÿçûâàþùåãî öåíòðà äðóãîé. Ýòîò äèìåð íå áûë áû ÷óâñòâèòåëåí ê ïðèñóòñòâèþ â ñðåäå Neu5Ac. Äèìåð æå àãàëàêòî-ÀÏÔ ôîðìèðîâàëñÿ áû â ýòîì ñëó÷àå çà ñ÷åò êîíöåâûõ îñòàòêîâ N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû îäíîé ìîëåêóëû ôåðìåíòà è Neu5Ac-ñâÿçûâàþùåãî öåíòðà äðóãîé ìîëåêóëû. Äèìåð ýòîãî ôåðìåíòà íå áûë áû ÷óâñòâèòåëåí ê ïðèñóòñòâèþ â ñðåäå Gal. Íàìè áûëè ïîëó÷åíû êàê äåñèàëèðîâàííûé, òàê è äåãàëàêòîçèëèðîâàííûé ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà. Îêàçàëîñü, 383 ÷òî ýòè ôåðìåíòû, êàê è èõ íàòèâíûå ïðåäøåñòâåííèêè, ôóíêöèîíèðóþò â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë êàê â âèäå ìîíîìåðà, òàê è â âèäå äèìåðà (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1), ò.å. îòùåïëåíèå êîíöåâûõ îñòàòêîâ ñèàëîâûõ êèñëîò èëè ãàëàêòîçû îò îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé ÀÏÔ íå íàðóøàëî ñïîñîáíîñòè ôåðìåíòà ê îáðàçîâàíèþ äèìåðà (òàáë. 2). Îêàçàëîñü, ÷òî, äåéñòâèòåëüíî, äëÿ äåñèàëèðîâàííîãî ÀÏÔ áîëåå ýôôåêòèâíû óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå ãàëàêòîçó, è ìåíåå ýôôåêòèâíû óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå Neu5Ac, ïî ñðàâíåíèþ ñ íàòèâíûì ÀÏÔ (òàáë. 2).  ñëó÷àå äåãàëàêòîçèëèðîâàííîãî ÀÏÔ áîëåå ýôôåêòèâíû ñèàëèðîâàííûå óãëåâîäû, à óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå Gal, ìåíåå ýôôåêòèâíû.  òî æå âðåìÿ ïîëó÷åííûå äàííûå íå ñîãëàñóþòñÿ ñ ãèïîòåçîé î ñóùåñòâîâàíèè äâóõ ïðîñòðàíñòâåííî ðàçäåëåííûõ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ñ ðàçíûìè òðåáîâàíèÿìè ê ñòðóêòóðå óãëåâîäà, íî ñîãëàñóþòñÿ ñ âåðîÿòíûì íàõîæäåíèåì â ñîñòàâå áåëêîâîé ãëîáóëû ÀÏÔ îäíîãî öåíòðà, óçíàþùåãî ìîòèâ Neu5Aca2-3Galb. Íà ýòó âîçìîæíîñòü ïðÿìî óêàçûâàþò ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ñ ïîñëåäîâàòåëüíî äåñèàëèðîâàííûì, äåãàëàêòîçèëèðîâàííûì ÀÏÔ. Ýòîò ôåðìåíò ôóíêöèîíèðóåò â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë òîëüêî â âèäå ìîíîìåðà (ðèñ. 1, êðèâàÿ 2), ò.å. ïîñëåäîâàòåëüíîñòü Neu5Aca2-3Gal êðèòè÷íà äëÿ ôåðìåíò-ôåðìåíòíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ 1. Corvol P., Williams T.A., Soubrier F. // Methods Enzymol. 1995. 248. Ð. 283. 2. Ehlers M.R.W., Chen Y.P., Riordan J.F. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. 183. Ð. 199. 3. Ripka J.E., Ryan J.W., Valido F.A., Chung A.Y.K., Peterson C.M., Urry R.L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 196. Ð. 503. 4. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John H., Tregear G., Corvol P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. 85. Ð. 9386. 5. Shai Sh.-Y., Fishel R.S., Martin B.M., Berk B.C., Bernstein K.E. // Circ. Res. 1991. 70. Ð. 1274. 6. Klyachko N.L., Levashov A.V., Kabanov A.V., Khmelnisky Yu.L., Martinek K. / Surfactant science series: Kinetics and catalysis in microheterogeneous systems. Eds. M. Gratzel and K. Kalyanasundaram, N. Y., 1991. 38. Ð. 135. 7. Kost O.A., Orth T.A., Nikolskaya I.I., Nametkin S.N., Levashov A.V. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. 44. Ð. 535. 8. Orth T., Voronov S., Binevski P., Saenger W., Kost O. // FEBS Lett. 1998. 431. Ð. 255. 9. Meng Q. Ch., King S.J., Chen Y.-F., Delucas L.J., Oparil S. // J. Chromatogr. 1989. 461. Ð. 271. 10. Lanzillo J.J., Stevens J., Dasarathy Y., Yotsumoto H., Fanburg B.L. // J. Biol. Chem. 1985. 260. Ð. 14938. Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 20.06.00