Роль конечных продуктов гликирования в патогенезе осложнений сахарного диабета

Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
Роль конечных продуктов
гликирования в патогенезе
осложнений сахарного диабета
N. Ahmed and P.J. Thornalley
Department of Biological Sciences, University of Essex, Central Campus, Wivenhoe Park, Colchester, Essex, CO4 3SQ, UK
Введение
Гликирование – это основная причина спонтанного
нарушения структуры внутриклеточных и внеклеточных
белков различных физиологических систем. В 0,1–0,2%
случаев гликирование проходит по остаткам лизина и
аргинина [1,2]. В некоторых зонах, где метаболизм белков лимитирован (например, в хрусталике глаза), степень их гликирования может повышаться в 10 раз [3]. На
фоне сахарного диабета гликирование белков усиливается, что связано с повышением уровня глюкозы и производных сахаридов как в плазме крови, так и в поврежденных сосудах. Существует множество продуктов присоединения глюкозы к белкам тканей и жидкостей организма in vivo. Наиболее ранним продуктом присоединения глюкозы к белку является Nе–фруктозил–лизин
(ФЛ), при медленной деградации которого образуются
различные конечные продукты гликирования (КПГ).
Выраженной способностью гликировать белки обладают соединения дикарбонила эндогенного происхождения, а также глиоксаль, метилглиоксаль и 3–дезоксиглюкозон. Они формируются при деградации гликированных белков, промежуточных метаболитов гликолиза
и перекисного окисления липидов. Соединения дикарбонила напрямую реагируют с белками с образованием
КПГ (рис. 1а). Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что интенсивность гликирования под действием метилглиоксаля нарастает при
диабете непропорционально увеличению концентрации
глюкозы [4–7]. По–видимому, это обусловлено синтезом метилглиоксаля из триозофосфата, который накапливается в стенках сосудов вследствие гипергликемии
(рис. 2) [8]. В наибольшем количестве в качестве конечных продуктов гликирования образуются гидроимидазолоны, которые являются производными остатков аргинина, подвергшихся модификации глиоксалем, метилглиоксалем и 3–дезоксиглюкозоном (3–DG), –
Nδ–(5–гидро–4–имидазолон–2–ил)орнитин (G–H1),
Nδ–(5–гидро–5–метил–4–имидазолон–2–ил)орнитин
(MG–H1) и Nδ–(5–гидро–5–(2,3,4–тригидроксибутил)–4–имидазолон–2–ил)орнитин и родственные
структурные изомеры (3DG–H) (рис. 1б). Другими широко изученными КПГ являются Nδ–карбоксиметил–лизин
(КМЛ) и Nδ–карбоксиэтил–лизин (КЭЛ), а также производные перекрестного связывания белков – пентозидин
и глюкозепан (рис. 1 в–е) [2,9–12].
Первоначально гликирование считали реакцией
посттрансляционной модификации белков, в первую очередь внеклеточных. Предполагалось, что КПГ медленно
накапливаются в организме в течение всей жизни, а концентрации КПГ отражают процесс аккумулирования продуктов присоединения. Однако это справедливо лишь в
642
отношении химически стабильных КПГ, образующихся из
долгоживущих белков, в то время как в физиологических
условиях ФЛ и некоторые другие КПГ (в частности,
гидроимидазолоны) имеют относительно короткий
период полураспада (2–6 недель) и могут формироваться из внутриклеточных и короткоживущих внеклеточных
белков. Постоянный пул внутриклеточных и некоторых
внеклеточных белков поддерживается за счет протеолиза компонентов с нарушенной структурой и синтеза нормальных белков de novo [13]. При деградации белков с
измененным в результате гликирования строением
высвобождаются продукты гликирования (рис. 3а) [2].
При сахарном диабете интенсивность процессов внутриклеточного протеолиза в некоторых средах и тканях организма может ослабляться [14]. In vivo пептиды с низкой
молекулярной массой обнаруживаются в небольших концентрациях в плазме крови и в моче, причем они также
могут быть гликированными. При сахарном же диабете
наиболее интенсивно возрастает содержание именно
свободных продуктов гликирования [5,7]. Продукты гликирования белков и пептидов называют «остатками продуктов гликирования», что соответствует номенклатуре
аминокислотных остатков в составе белков. Свободные
продукты гликирования – это гликированные аминокислоты, образовавшиеся при полном протеолизе гликированных белков и при гликировании аминокислот. Они
выводятся с мочой (рис. 3б) [5].
Трудности, возникающие
при количественной оценке КПГ
Количественный анализ продуктов гликирования с
технической точки зрения представляет собой серьезную проблему. Наиболее точным методом их количественного определения является хроматография с
масс–спектрометрической детекцией и количественной
оценкой с использованием стабильных изотопов в качестве заменяемых стандартов, в особенности жидкостная хроматография с тандемной масс–спектрометрией
(ЖХ–МС/МС) [2,15,16]. В большом количестве исследований определение КПГ производилось с помощью
иммунологического анализа [17–20]. Несмотря на то,
что при использовании иммунологических методов
были получены обширные данные, и информация по
диабету продолжает поступать, иммунологический анализ рекомендуется проводить по валидированной методике в сочетании с масс–спектрометрией. Существует
целый ряд серьезных проблем, ограничивающих применение иммунологического анализа для обнаружения
КПГ: 1) недостаточная специфичность антител (например, определение КМЛ и КЭЛ с помощью моноклональных антител 6D12) [21]; 2) фоновые сигналы вследствие
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
ТОМ 17, № 9, 2009
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
присутствия продуктов гликирования белков, добавляемых для повышения специфичности связывания антител (например, блокирующий белковый раствор, приготовленный из восстановленного сухого порошкового
молока, содержит большое количество КПГ) [22]; 3) в
условиях in vivo калибровочные кривые, выстроенные по
белкам, структура которых претерпела значительную
трансформацию в результате гликирования, будут отличаться от аналогичных кривых, построенных по белкам с
малоизмененной структурой [23,24]; 4) влияние свободных продуктов гликирования [25,26]; 5) высокие
температура и рН в процессе анализа образцов [27,28].
Иммунологический анализ позволяет определить уровень КПГ не в абсолютных, а в произвольных единицах с
нормализацией (или без нее) по контрольному КПГ–модифицированному белку, приготовленному in vivo [26].
КПГ также можно идентифицировать по общей
интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения и волны излучения 350 нм и 450 нм соответственно [29]. Последняя модификация этого метода
позволяет определять низкомолекулярные пептиды КПГ
и свободные продукты гликирования [30,31]. Эти методики тем не менее не решают некоторых аналитических
проблем: 1) большинство КПГ количественно не флуо-
Рис. 1. Продукты присоединения глюкозы к белкам в физиологических системах. Приведены продукты свободного гликирования белков. У продуктов гликирования при физиологическом значении рН имеются заряженные терминальные аминогруппы
(–NH3+) и карбоксилатные группы (–СО2–), являющиеся частью пептидных цепочек, которые лежат в основе структуры белков
и пептидов. R = боковая цепь аминокислоты
ТОМ 17, № 9, 2009
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
643
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
ресцируют, поэтому не могут быть определены [2];
2) влияние продуктов окисления и флуорофора, N–формилкинуренина [32]; 3) использование различных флуорофоров влияет на уровень общей флуоресценции, что
делает невозможным построение количественной
калибровки. Если требуется произвести определение
гликированных флуорофоров, лучше всего подвергнуть
их растворению, а затем определить при помощи ВЭЖХ
с флуориметрической детекцией. Количественное
определение осуществляется по калибровочной кривой, построенной на основании стандартов для анализируемых компонентов [33–35]. Величина общей интенсивности флуоресценции КПГ качественно демонстрирует степень повреждения белков вследствие гликирования и влияния продуктов окисления флуорофоров.
Различия физиологических эффектов
белков, структура которых
подверглась минимальным
и значительным изменениям
вследствие гликирования
Эффекты, возникающие при гликировании белков in
vivo, можно смоделировать in vitro путем гликирования
альбумина и других белков. Результаты количественного
определения продуктов гликирования и измерения молекулярной массы белков плазмы крови и тканей организма
in vivo сходны с аналогичными данными для белков,
структура которых трансформировалась в результате
гликирования незначительно (один или два продукта на
одну молекулу белка) [2,36,37]. Приготовление КПГ–модифицированных белков in vitro часто приводит к образованию 30–40 продуктов на каждую молекулу белка, масса
которых доходит до 7000 Да [23,38]. Так, при внутривенном введении слабо гликированного альбумина крысам с
сахарным диабетом и крысам контрольной группы
период его полураспада оказался одинаковым с периодом полураспада негликированного альбумина. При этом
такие альбумины не связывались с рецепторами печени
[39], в отличие от белков, подвергшихся сильному гликированию, у которых к тому же значительно снижался
период полураспада [40]. Последние исследования распределения гликированных белков плазмы крови в печени человека не объясняют захватывания их печенью in
vivo [24]. Таким образом, наблюдается противопоставление эффектов и физиологических функций белков, гликированных в разной степени – от минимальной до сверхвысокой. In vivo вряд ли можно ожидать, что белки внезапно претерпят выраженную трансформацию вследствие гликирования – за исключением белков, потребляемых в составе некоторых видов термически обработанной пищи [7,22], и белков, участвующих в формировании базальной мембраны брюшины (отмечается у больных, находящихся на перитонеальном диализе, что
сопряжено с воздействием диализной жидкости, содержащей высокие концентрации глюкозы) [41]. Физиологические эффекты высокогликированных белков пищи
ограничены, что связано с их низкой биодоступностью [7]
– они устойчивы к действию протеаз [42], а некоторые
продукты гликирования способны блокировать кишечные
Рис. 2. Механизм усиленного образования метилглиоксаля, митохондриальной недостаточности и активации НАДФ–оксидазы
за счет снижения содержания глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназы в ответ на повреждение ДНК
644
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
ТОМ 17, № 9, 2009
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
протеазы [43]. Физиологическую значимость клеточного
ответа на воздействие гликированного альбумина интерпретировать весьма трудно. Например, активация нейтрофилов у человека была достигнута их инкубацией с
альбумином, подвергшимся выраженному гликированию
in vitro (константа диссоциации KD ассоциированого
рецептора 3,7 нмоль [44]). В качестве фактора активации
использовались остатки КМЛ [45]; концентрация остатков КМЛ на белках сыворотки крови здорового человека
не превышает 1–2 мкмоль [5]. Таким образом, чтобы
проанализировать физиологическую значимость эффек-
тов белков, гликированных и идентифицированных in
vitro, необходимо вначале установить, соответствовала
ли поставленным задачам использованная модель
КПГ–трансформированного белка и правильно ли дана
оценка достоверности эмпирических результатов.
Рецепторы КПГ
на поверхности клетки
В качестве специфических рецепторов КПГ–модифицированных белков рассматриваются различные
а)
CO2–
OH
+
O
NH2
(CH2)4 CH
OH
HO
OH
NH3+
Nε–(1–дезокси–D–фруктоз–1–ил)лизин
CO2–
+
(CH2)4–NH2CH2CO2–
HC
NH3+
Nε–карбоксиметил–лизин (КМЛ)
CO2–
HN
HC (CH2)3
H
NH
N
+
NH3
CH3
O
MG-H1
Остатки продуктов гликирования
(молекулярная масса >12 кД)
Пептиды продуктов гликирования
(молекулярная масса <12 кД)
Свободные продукты гликирования
(молекулярная масса <500 кД)
Рис. 3. Формирование и физиологические превращения продуктов гликирования белка.
а) Классификация остатков продуктов гликирования белка, пептидов и свободных продуктов гликирования.
б) Схема распределения свободных продуктов гликирования белка в организме, направления их преобразования и экскреции
646
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
ТОМ 17, № 9, 2009
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
белки. Среди рецепторов, располагающихся на клеточной поверхности, к ним относятся рецептор фагоцитов,
рецептор конечных продуктов гликирования (РКПГ) и
галектин–3. Другие КПГ–связывающие белки локализованы в цитоплазме и, возможно, не являются рецепторами для КПГ [46]. Рецепторы фагоцитов распознают
только белки, подвергшиеся выраженной трансформации в процессе гликирования [24,39,40,47], за исключением альбумина, гликированного под действием КМЛ
[48]. Таким образом, рецепторы фагоцитов могут и не
участвовать во взаимодействиях между КПГ–модифицированными белками in vivo.
РКПГ экспрессируется перицитами и эндотелиоцитами микрососудов человека с помощью трех методов
сплайсинга: усечение с N–конца, усечение с С–конца и
полноразмерный метод. Только две последние изоформы рецептора могут связывать КПГ–модифицированные белки [49]. На фоне сахарного диабета экспрессия
РКПГ в эндотелиоцитах усиливается [50], способствуя
тем самым возникновению хронического воспалительного процесса [51]. Экспрессия усеченного с С–конца
РКПГ (сРКПГ) увеличивается под действием ингибитора
ангиотензин–превращающего фермента рамиприла
[52]. Мыши с экспериментальным сахарным диабетом,
у которых отмечается усиление экспрессии РКПГ, имеют
склонность к развитию нефропатии [53], а гомозиготные РКПГ–неэкспрессирующие мыши, напротив, обладают устойчивостью к заболеванию [54]. Эти данные
подтверждают роль РКПГ в развитии диабетической
нефропатии. Не исключено, что РКПГ опосредует патогенез и других сосудистых осложнений сахарного диабета. В качестве лигандов, стимулирующих РКПГ при
сахарном диабете, могут выступать измененные под
влиянием КПГ белки, кальгранулины или белок высокомобильной группы HMGB–1 (амфотерин). Считается,
что антигенной детерминантой РКПГ служат остатки
КМЛ [45], хотя способность к связыванию с этими
рецепторами КПГ–трансформированного альбумина
объясняется скорее не наличием КМЛ, а высокой степенью гликирования [55]. Развивающиеся в эндотелиальных клетках провоспалительные реакции, обусловленные КПГ–модифицированными белками/взаимодействием с РКПГ, пронаблюдать не удается, если такие
белки получали в среде, не содержавшей эндотоксин (в
этом случае рецепторы активировались под действием
кальгранулина) [56]. Белки семейства S100 кальгранулина – S100A12 и S100b – выступают в качестве лигандов для РКПГ [57]. У мышей с экспериментальным диабетом экспрессия белков этого семейства в почках усиливается вне зависимости от характера экспрессии
РКПГ [53]. Еще один лиганд РКПГ – протеин HMGB–1,
который является одним из ключевых медиаторов воспалительных реакций. Он взаимодействует не только с
РКПГ, но и с Toll–подобными рецепторами типа 2 и 4,
TLR2 и TLR4, которые активируют NF– B (роль РКПГ в
этом процессе минимальна) [58]. Активация HMGB–1
эндотелиальных клеток пуповины человека, на фоне
которой усиливается экспрессия молекул адгезии
ICAM–1, VCAM–1 и Е–селектина, а также секреция ИЛ–8
и Г–КСФ, частично ингибируется антителами к РКПГ
[59]. HMGB–1 также восприимчив и к гликированию
ТОМ 17, № 9, 2009
[60]. До сих пор не установлено, связывает ли РКПГ
незначительно гликированные белки и активирует ли он
клетки сосудов in vivo. Считается, что при сахарном диабете активацию РКПГ in vivo вызывают скорее белки
семейства S100 кальгранулинов, а не гликированные
белки.
Галектин–3 также рассматривается в качестве
рецептора КПГ, о чем свидетельствует наличие у высокогликированного альбумина способности взаимодействовать с рекомбинантным галектином–3, а также специфический захват галектина–3 макрофагами мышей
линии RAW тем же самым лигандом [61]. Попытка блокировать связывание моноцитов человека и альбумина
с незначительно КПГ–модифицированной структурой in
vitro с помощью антител к антигалектину–3 не принесла
результатов [62]. Прогрессирование диабетической
нефропатии у мышей с геном галектина–3 указывает на
возможность взаимодействия между галектином–3 и
КПГ–трансформированными белками [63], однако нельзя исключать, что это опосредовано и другими факторами. In vitro галектин–3 обеспечивает защиту мезангиальных клеток, предотвращает атаку инфильтрирующих
макрофагов и цитотоксическое воздействия ТФР–β
[64], влияет на взаимодействие протеогликанов в ходе
ангиогенеза [65], а также оказывает другие внутриклеточные и внеклеточные эффекты in vivo [66,67]. Маловероятно, что побочные явления удаления гена галектина–3 обусловлены разрушением связей с гликированными белками. Действительно, галектин–3 обладает
провоспалительным действием: при диабетической нефропатии галектин–3+ инфильтрирует макрофаги в
дистальных канальцах и клубочках почек, причем характер этой инфильтрации коррелирует с тяжестью нефропатии [68].
Таким образом, белки, классифицируемые как рецепторы КПГ, участвуют в патогенезе сосудистых
осложнений сахарного диабета, однако так до конца и
неизвестно, усиливается ли функциональная активность этих рецепторов под влиянием КПГ–модифицированных белков in vivo.
Конечные продукты гликирования
и контроль гликемии
КПГ могут образовываться в результате деградации
фруктозаминов, которые сами по себе выступают в
качестве маркеров гликемического контроля [69,70].
При количественном определении КПГ методом
масс–спектрометрии вносится поправка на ассоциацию их остатков с индикаторами контроля гликемии. У
пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа с
сохраненной функцией почек, количество остатков КМЛ
в составе белков плазмы крови и гемоглобина, G–H1 в
составе белков плазмы крови и пентозидина в составе
гемоглобина напрямую коррелирует с уровнем HbA1c.
Наличие остатков КМЛ в структуре гемоглобина и пентозидина в структуре белков плазмы крови коррелирует
с содержанием глюкозы в крови натощак, а наличие
остатков КМЛ в цепях плазменных белков и пентозидина в цепях гемоглобина – со средней концентрацией
глюкозы в крови в течение 24 часов [5]. Аналогичная
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
647
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
корреляция с уровнем контроля гликемии была установлена для пентозидина посредством ВЭЖХ с флуориметрическим методом детекции [35]. КПГ в составе гемоглобина были выявлены с помощью иммунологических
методов по ранее неидентифицированным эпитопам
(антигенным детерминантам) [71,72], при этом была
продемонстрирована их корреляция с HbA1c. Очевидно, что остатки КМЛ можно определять, примененяя
иммунологические методы [73], но результаты анализа
получаются завышенными в 10 раз [74] по сравнению с
абсолютной количественной оценкой на основании
ЖХ–МС/МС [5]. Аналог КПГ, Nα–карбоксиметил–валин,
продукт распада Nα–фруктозилвалина (ключевой фруктозамин в структуре HbA1c [75]), определяли в составе
гемоглобина методом газовой хроматографии в сочетании с масс–спектрометрией; процент модифицированного Hb составил приблизительно 0,06% [73]. Следовательно, эти остатки КПГ в составе белков плазмы крови
и гемоглобина могут выполнять роль замещающих индикаторов контроля гликемии в среднесрочном периоде времени. Наличие остатков КМЛ и пентозидина в
структуре коллагена кожи (белка с крайне медленным
метаболизмом) служит маркером гликемического контроля в течение гораздо большего периода времени
[15,76]. Существует, однако, ряд КПГ – КЭЛ и MG–H1,
образующиеся из метилглиоксаля, и 3DG–H, образующийся из 3–DG, которые не могут рассматриваться в
качестве индикаторов контроля гликемии [5]. Более
того, в экспериментальном сахарном диабете снижение
уровня этих продуктов гликирования без изменения
контроля глюкозы предотвращало развитие сосудистых
осложнений [6]. Следовательно, несмотря на то, что некоторые остатки КПГ (КМЛ и пентозидин) могут участвовать в патогенезе сосудистых осложнений сахарного
диабета как замещающие индикаторы гликемического
контроля, нарушение структуры белков вследствие гликирования является, по–видимому, ведущим фактором
риска возникновения таких осложнений.
Взаимосвязь КПГ с развитием
сосудистых осложнений
сахарного диабета
Участие КПГ в патогенезе сосудистых осложнений
подтверждается следующими экспериментальными
данными: 1) накопление остатков КПГ в местах сосудистых повреждений; 2) экспозиция предшественников
КПГ или гликированных белков в экспериментальных
условиях приводит к возникновению диабетоподобной
сосудистой патологии; 3) на фоне изменения структуры
белков клеток сосудов под влиянием КПГ in vitro отмечается дисфункция клеток; 4) ингибиторы образования
КПГ подавляют развитие сосудистых осложнений (по
данным проведенных экспериментов и клинических
исследований). Получены убедительные доказательства в пользу того, что остатки КПГ аккумулируются в
зонах возникновения сосудистых поражений – в клубочках почек, сетчатке глаза и периферических нервах [2].
Клетки сосудов находятся в среде, насыщенной свободными продуктами гликирования [5,25]. После восстановления гликемического контроля (например, путем
648
трансплантации островков поджелудочной железы [77,
78]) или после назначения препаратов, препятствующих
образованию КПГ, – тиамина, аминогуанидина или
пиридоксамина [79–81], – количество остатков КПГ в
этих зонах может сократиться. Эта информация имеет
большую ценность, поскольку становится очевидным,
что благоприятного эффекта можно достичь путем терапевтических мероприятий вне зависимости от продолжительности заболевания. Кроме этого, существуют
данные о том, что введение прекурсора КПГ – метилглиоксаля [82] – и гликированных белков способно индуцировать развитие сосудистой патологии, напоминающей сахарный диабет [83–85]. При этом доза вводимого метилглиоксаля была примерно в 10 раз выше, чем
предполагаемый уровень метилглиоксаля, образующегося при сахарном диабете, а гликированные белки
отличались по своей природе и степени модифицированности структуры от белков, обнаруживаемых in vivo
[2,42]. Согласно результатам опытов in vitro, в ходе которых эндотелиальные клетки, перициты и гладкомышечные клетки сосудов инкубировали в смоделированных
условиях гипергликемии, на фоне гликирования белков
происходит нарушение биохимических процессов, что и
обусловливает осложнения диабета. Данные исследований, указывающих на возникновение целого спектра
биохимических нарушений в эндотелиоцитах [8] и развитие реакций в ответ на активацию РКПГ, представлены выше. Также получены доказательства возможности
профилактики осложнений диабета с помощью агентов,
которые блокируют образование КПГ (аминогуанидин,
тиамин и бенфотиамин, пиридоксамин) [79–81]. Все эти
агенты оказывают множество благоприятных эффектов
в отношении рассматриваемого заболевания. Таким
образом, нельзя с однозначной уверенностью говорить
о том, в какой степени отклик на терапию зависит от
торможения синтеза КПГ.
В заключение, предотвращение повреждения
структуры белков остатками КПГ в ключевых функциональных зонах при сахарном диабете может рассматриваться в качестве превентивной терапии осложнений
диабета вне зависимости от того, является ли этот
эффект специфическим или случайным.
Терапевтические подходы
к снижению уровня КПГ:
гипергликемический контроль,
тиамин, дикарбонил и пиридоксамин
В ходе контрольного исследования осложнений
сахарного диабета и проспективного исследования по
диабету в Великобритании было установлено, что гипергликемический контроль служит фактором риска
развития микрососудистых осложнений при сахарном
диабете как первого, так и второго типа [86]. Взаимосвязь гипергликемии с макрососудистыми осложнениями не столь очевидна, однако различные исследования
продемонстрировали, что гипергликемия повышает
также и риск возникновения патологии крупных сосудов
[86]. Поэтому гликемический контроль может замедлить
образование КПГ и, как следствие, уменьшить риск
сосудистых осложнений.
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
ТОМ 17, № 9, 2009
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
Реактивные соединения дикарбонила, такие как
глиоксаль, метилглиоксаль и 3–DG служат предшественниками основных остатков КПГ в зонах развития
осложнений диабета. В экспериментальных и клинических условиях нарушение структуры белков под действием остатков MG–H1 происходит в 27 раз и 15 раз
чаще соответственно (определение производилось по
уровню экскреции MG–H1 в течение 24 ч) [5,7]. Лекарственные вещества, препятствующие образованию
метилглиоксаля и других α–оксоальдегидов (или способствующие их элиминации), могут выступать в качестве средств профилактики осложнений диабета. Так,
на модели сахарного диабета показано, что тиамин и
бенфотиамин в высоких дозах тормозят процессы образования КПГ из метилглиоксаля, не влияя на контроль
уровня гликемии [6,87]. Возможно, это обусловлено
уменьшением содержания триозофосфатов на фоне
коррекции дефицита тиамина при диабете, который лечат в курсе общей терапии заболевания [79].
Изучение свойств аминогуанидина (Пимагедин) в
качестве средства профилактики микрососудистых
осложнений сахарного диабета показало, что он также
способен эффективно удалять метилглиоксаль из организма. Эффективность препарата ограничивается его
коротким периодом полураспада. Кроме того, он обладает высокой токсичностью и не может применяться в клинической практике [80]. Фенацилтиазолия бромид, предполагаемый элиминатор КПГ [88], также эффективно
удаляет метилглиоксаль. Он потенцирует эффекты эндогенного тиамина in vitro [88,90], однако является нестабильным и разрушается до неактивных производных [91].
Элиминирующие свойства дикарбонила и потенцирование эффектов тиамина объясняют благоприятное влияние нейтрализаторов КПГ in vivo [92,93], поскольку нет
никаких данных о том, что эти агенты способны расщеплять перекрестные связи между КПГ in vivo [91,94].
Пиридоксамин, который изначально считался ингибитором процессов деградации фруктозамина до КПГ
[95], тормозит образование остатков КПГ и других продуктов, образовавшихся из альдегидов в результате
перекисного окисления липидов [96]. У подопытных
крыс с диабетом, индуцированным стрептозоцином
(STZ), использование пиридоксамина позволяет скорректировать дислипидемию [97] (равно как и тиамин в
высоких дозах [98]) и предупредить возникновение
микрососудистых осложнений [99]. Пиридоксамин
подавляет развитие ретинопатии и нейропатии у крыс
со
стрептозоцин–индуцированным
диабетом.
Непонятно лишь то, в какой степени эти эффекты обусловлены обратимой недостаточностью пиридоксаль–5’–фосфа-та, отмечаемой в экспериментальном
диабете [100,101]. В печени и в кишечнике пиридоксамин превращается в пиридоксамин–5–фосфат и пиридоксаль–5’–фосфат [102,103]; источником пиридоксаль–5’–фосфата также служит пиридоксин (витамин В6). Назначение пиридоксина в дозе 120 мг/сут.
здоровым людям и больным сахарным диабетом с
дефицитом пиридоксаль–5’–фосфата способствует
снижению концентрации как общего холестерина, так и
ЛНП [104]. При сравнении влияния тиамина (20 мг/сут.)
и пиридоксина (50 мг/сут.) на состояние диабетиков с
ТОМ 17, № 9, 2009
полинейропатией выяснилось, что тиамин в 5 раз
эффективнее пиридоксина [105]. Согласно данным других исследований, пиридоксин малоэффективен при
диабетической нейропатии [106–108]. Нельзя исключать, что эффекты пиридоксамина при сахарном диабете носят множественный характер и приводят к снижению образования КПГ и повреждения митохондрий
[100], а также коррекции дислипидемии на фоне
расщепления карбонила и применения пиридоксаль–5’–фосфата [104].
Таким образом, предотвратить модификацию
структуры белков за счет образования остатков КПГ
можно путем контролирования уровня гликемии, а
потенциально – назначением бенфотиамина и других
пиридоксаминов (витаминов В1 и В6) и других веществ,
которые выступают в качестве элиминаторов реактивных промежуточных метаболитов гликирования и перекисного окисления липидов.
Перспективы
Гликирование – это основная причина спонтанного
повреждения белков. За последние годы были как подтверждены уже имеющиеся данные об этом процессе,
так и получены новые сведения (табл. 1). На фоне сахарного диабета гликирование идет более активно, а следовательно, может расцениваться как фактор, вызывающий хроническую патологию. В отличие от фруктозаминов, КПГ обладают характерными особенностями:
1) способствуют нарушению структуры остатков лизина
и аргинина (остатки аргинина чаще всего локализованы
Таблица 1. Традиционные представления
о гликировании белков при сахарном
диабете и новые данные
Традиционные представления
Реакция с образованием продуктов Амадори под влиянием
глюкозы
В физиологических условиях высшие конечные продукты гликирования (КПГ) образуются с замедленной скоростью после
формирования продуктов Амадори
Химически стабильные КПГ накапливаются на внеклеточных
белках
Химически стабильные КПГ на долгоживущих белках аккумулируются в течение всей жизни
КПГ – продукты на остатках лизин
Новые данные
КПГ образуются из α–оксоальдегидов, которые появляются
при распаде промежуточных метаболитов гликолиза, перекисного окисления липидов и фрагментации Шиффовых оснований
α–оксоальдегиды гликируют белки по остаткам аргинина; они
превращаются в гидроимидазолоны, которые составляют
большую часть фракции КПГ с относительно коротким периодом полураспада (12–60 дней)
При сахарном диабете КПГ трансформируют структуру белков
в значительной степени, особенно в клубочках почек, сетчатке
гдаза и периферических нервах
КПГ–модифицированные белки распадаются вследствие клеточного протеолиза с образованием свободных продуктов КПГ
и выводятся с мочой. При сахарном диабете и уремии отмечается их активное накопление
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
649
Э Н Д О К Р И Н ОЛ О Г И Я
в сайтах межбелковых взаимодействий и взаимодействий между белками и нуклеотидами, где трансформация структуры белков имеет функциональные последствия) [109]; 2) восстановление нормального строения
белков, нарушенное вследствие гликирования КПГ,
происходит замедленно. Задача будущих исследований
– идентифицировать белки и их сайты, чувствительные к
гликированию (арг–410 сывороточного альбумина человека [110] и сайты связывания с интегринами RGD и
GFOGER коллагена IV типа [111]), и разработать биоинформационные методологические подходы к прогнозированию сайтов, восприимчивых к гликированию. Также
необходимо сформулировать и стратегии профилактики гликирования. Наиболее перспективно в этом плане
создание ферментативных ингибиторов гликирования
[112] – индуцированной глиоксилазы–1 [113],
альдо–кето–редуктаз [114], фруктозамин–3–фосфокиназы [115,116] и других родственных ферментов. Эти
стратегии, призванные усовершенствовать подходы к
терапии сосудистых осложнений сахарного диабета,
уже активно разрабатываются.
Методики
Обзор был составлен с использованием базы данных ISI Web и анализа литературных данных о гликировании. Использовавшиеся поисковые слова: гликирование, диабет, осложнения диабета, названия всех гликирующих агентов и продуктов гликирования, приведенных в данной статье. Данные отбирались на основании
описанных технических методов, дизайна исследований и методов анализа.
Благодарность
Мы благодарим Wellcome Trust (UK), British Heart Foundation, Juvenile Diabetes Research Foundation International (USA), Diabetes UK (UK), Australian NHMRC (via
Professor George Jerums and colleagues, University of
Melbourne) and European Union 6th Framework Programme за поддержку исследований в сфере диабета.
Литература
1. Thornalley PJ. Clinical significance of glycation. Clin Lab 1999; 45: 263–273.
2. Thornalley PJ, Battah S, Ahmed N et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts
in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochem J 2003; 375: 581–592.
3. Ahmed N, Thornalley PJ, Dawczynski J et al. Methylglyoxal–derived hydroimidazolone advanced
glycation endproducts of human lens proteins. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: 5287–5292.
4. McLellan AC, Thornalley PJ, Benn J, Sonksen PH. The glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and correlation with diabetic complications. Clin Sci (Lond) 1994; 87: 21–29.
5. Ahmed N, Babaei–Jadidi R, Howell SK, Beisswenger PJ, Thornalley PJ. Degradation products of
proteins damaged by glycation, oxidation and nitration in clinical type 1 diabetes. Diabetologia 2005;
48: 1590–1603.
6. Babaei–Jadidi R, Karachalias N, Ahmed N, Battah S, Thornalley PJ. Prevention of incipient diabetic nephropathy by high dose thiamine and benfotiamine. Diabetes 2003; 52: 2110–2120.
7. Ahmed N, Mirshekar–Syahkal B,Kennish L, KarachaliasN, Babaei–Jadidi R, Thornalley PJ. Assay
of advanced glycation endproducts in selected beverages and food by liquid chromatography with
tandem mass spectrometric detection. Mol Nutr Food Res 2005; 49: 691–699.
8. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001; 414:
813–820.
9. Ahmed N, Argirov OK, Minhas HS, Cordeiro CA, Thornalley PJ. Assay of advanced glycation
endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatisation by aminoquinolyl–Nhydroxysuccimidyl–carbamate and application to Ne–carboxymethyl–lysine– and Ne–(1–carboxyethyl) lysine–modified albumin. Biochem J 2002; 364: 1–14.
650
10. Thorpe SR, Baynes JW. CML: a brief history. Maillard Reaction in Food Chemistry and Medical
Science. Update for Postgenomic Era 2002; 1245: 91–99.
11. Sell DR, Monnier VM. Structure elucidation of a senescence crosslink from human extracellular
matrix. Implication of pentoses in the aging process. J Biol Chem 1989; 264: 21597–21602.
12. Biemel KM, Friedl DA, Lederer MO. Identification and quantification of major Maillard cross–links
in human serum albumin and lens protein – Evidence for glucosepane as the dominant compound.
J Biol Chem 2002; 277: 24907–24915.
13. Goldberg AL. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature
2003; 426: 895–899.
14. Portero–Otin M, Pamplona R, Ruiz M, Cabiscol E, Prat J, Bellmunt MJ. Diabetes induces an
impairment in the proteolytic activity against oxidized proteins and a heterogeneous effect in nonenzymatic protein modifications in the cytosol of rat liver and kidney. Diabetes 1999; 48: 2215–2220.
15. Verzijl N, DeGroot J, Thorpe SR et al. Effect of collagen turnover on the accumulation of advanced glycation endproducts. J Biol Chem 2000; 275: 39027–39031.
16. LieuwAF, vanHinsberghVWM,Teerlink T et al. Increased levels of Ne–(carboxymethyl) lysine and
Ne–(carboxyethyl) lysine in type 1 diabetic patients with impaired renal function: correlation with
markers of endothelial dysfunction. Nephrol Dial Transplant 2004; 19: 631–636.
17. Kilhovd BK, Giardino I, Torjesen PA et al. Increased serum levels of the specific AGE–compound methylglyoxal–derived hydroimidazolone in patients with type 2 diabetes. Metabolism 2003; 52: 163–167.
18. Sugimoto K, Nishizawa Y, Horiuchi S, Yagihashi S. Localization in human diabetic peripheral
nerve of Necarboxymethyllysine–protein adducts, an advanced glycation endproduct. Diabetologia
2001; 40: 1380–1387.
19. Makita Z, Vlassara H, Cerami A, Bucala R. Immunochemical detection of advanced glycosylation
end products in vivo. J Biol Chem 1992; 267: 5133–5138.
20. Reddy S, Bichler J, Wells–Knecht KJ, Thorpe SR, Baynes JW. Ne–(Carboxymethyl)lysine is a
dominant advanced glycation end product (AGE) antigen in tissue proteins. Biochemistry 1995; 34:
10872–10878.
21. Koito W, Araki T, Horiuchi S, Nagai R. Conventional antibody against Ne–(carboxymethyl) lysine
(CML) shows cross–reaction to Ne–(carboxyethyl) lysine (CEL): Immunochemical quantification of
CML with a specific antibody. J Biochem (Tokyo) 2004; 136: 831–837.
22. Drusch S, Faist V, Erbersdobler H. Determination of Necarboxymethyllysine in milk products by
a modified reversed–phase HPLC method. Food Chem 1999; 65: 547–553.
23. Thornalley PJ, ArgirovaM, Ahmed N, Mann VM, Argirov OK, Dawnay A. Mass spectrometric monitoring of albumin in uraemia. Kidney Int 2000; 58: 2228–2234.
24. Ahmed N, Thornalley PJ, Luthen R et al. Processing of protein glycation, oxidation and nitrosation adducts in the liver and the effect of cirrhosis. JHepatol 2004; 41: 913–919.
25. Agalou S, Ahmed N, Babaei–Jadidi R, Dawnay A, Thornalley PJ. Profound mishandling of protein glycation degradation products in uremia and dialysis. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 1471–1485.
26. Makita Z, Radoff S, Rayfield EJ et al. Reactive glycosylation endproducts in diabetic uraemia and
treatment of renal failure. Lancet 1994; 343: 1519–1522.
27. Hayashi CM, Nagai R, Miyazaki K et al. Conversion of Amadori products of the Maillard reaction
to N–epsilon–(carboxymethyl) lysine by short–term heating: Possible detection of artifacts by
immunohistochemistry. Lab Invest 2002; 82: 795–807.
28. Smith PR, Thornalley PJ. Influence of pH and phosphate ions on the kinetics of enolisation and
degradation of fructosamines. Studies with the model Fructosamine, Ne–1–deoxy–D–yl–hippuryl–lysine. Biochem Int 1992; 28: 429–439.
29. Sebekova K, Podracka L, Blazicek P, Syrova D, Heidland A, Schinzel R. Plasma levels of advanced glycation end products in children with renal disease. Pediatr Nephrol 2001; 16: 1105–1112.
30. Wrobel K, Wrobel K, Garay–SevillaM, Nava LE,Malacara JM. Novel analytical approach to monitoring advanced glycosylation end products in human serumwith on–line spectrophotometric and
spectrofluorometric detection in a flow system. Clin Chem 1997; 43: 1563–1569.
31. Thomas MC, Tsalamandris C, MacIsaac R et al. Lowmolecularweight AGEs are associated with
GFR and anemia in patients with type 2 diabetes. Kidney Int 2004; 66: 1167–1172.
32. Buxton T, Guilbault GG Fluorometric analysis for N0–formylkynurenine in plasma and urine. Clin
Chem 1974; 20: 765–768.
33. Odetti P, Fogarty J, Sell DR, Monnier VM. Chromatographic quantitation of plasma and erythrocyte pentosidine in diabetic and uremic subjects. Diabetes 1992; 41: 153–159.
34. Wilker SC, Chellan P, Arnold BM, Nagaraj RH. Chromatographic quantification of argpyrimidine,
a methylglyoxal–derived product in tissue proteins. Anal Biochem 2001; 290: 353–358.
35. Sugiyama S, Miyata T, Ueda Y et al. Plasma levels of pentosidine in diabetic patients: an advanced glycation end product. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 1681–1688.
36. Degenhardt TP, Thorpe SR, Baynes JW. Chemical modification of proteins by methylglyoxal. Cell
Mol Biol 1998; 44: 1139–1145.
37. Requena JR, Baynes JW., Sima AAF ed. Chronic Complications in Diabetes: Animal Models and
Chronic Complications. Studies in animal models on the role of glycation and advanced glycation
endproducts (AGEs) in the pathogenesis of diabetic complications: pitfalls and limitations.
Amsterdam: Harwood Academic Publishers 2000: 43–70.
38. Westwood ME, Thornalley PJ. Molecular characteristics of methylglyoxal–modified bovine and
human serum albumins. Comparison with glucose–derived advanced glycation endproduct–modified serum albumins. J Protien Chem 1995; 14: 359–372.
Полный список литературы Вы можете найти на сайте
http://www.rmj.ru
РУССКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
ТОМ 17, № 9, 2009