влияние альфа-2-макроглобулина на рост и развитие клеток

ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-2-МАКРОГЛОБУЛИНА НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КЛЕТОК
НЕЙРОБЛАСТОМЫ IN VITRO
Сандаков Д.Б., Сухан Т.О.
Белорусский государственный университет, биологический факультет, Минск, Беларусь;
Университет им. И.В.Гете, Институт медицинской вирусологии, Франкфурт-на-Майне,
Германия
Альфа-2-макроглобулин (аМГ) – позитивный острофазный белок плазмы крови человека,
который обладает несколькими формами активности, которые позволяют ему выполнять
функцию мультифункционального регулятора межклеточной коммуникации.
аМГ
обладает
способностью
ингибировать
активность
широкого
спектра
протеолитических ферментов, в том числе тех, которые участвуют в процессах ангиогенеза,
клеточной адгезии, синтеза, активации и деградации цитокинов и ростовых факторов [12].
аМГ
является
белком-переносчиком
для
интерлейкина-1
(ИЛ-1),
ИЛ-6,
ИЛ-8,
трансформирующего ростового фактора бета (TGFβ), фактора роста нервов бета (NGFβ),
тромбоцитарного ростового фактора (PDGF), фактор некроза опухолей альфа (TNFα),
фактора роста фибробластов (bFGF), интерферона гамма (IFNγ) [4].
Существует две основные формы аМГ – нативная и активированная. Активированный
аМГ связывается по меньшей мере с двумя типами рецепторов: (1) эндоцитозный рецептор
(аМГ-ЭР) (low-densit lipoprotein / α2-macroglobulin endocytic receptor), (2) сигнальный
рецептор (аМГ-СР) (α2-macroglobulin sygnalling receptor). Клетки, несущие эндоцитозный
рецептор, быстро поглощают активированный аМГ и его комплексы с цитокинами и
ростовыми факторами путем эндоцитоза [6, 11]. Присоединение аМГ к сигнальному
рецептору сопровождается активацией каскада митоген-активируемых протеинкиназ,
каскада, активируемого фосфоинозитол-3-киназой, изменением активности внутриклеточной
циклооксигеназы-2 и фосфолипазы А2 [7-10].
Ранее было показано, что многие линии нейрбластомы синтезируют и секретируют
значительные количества аМГ [1]. Установлена четкая корреляция между ростом опухоли и
локальной продукцией аМГ [3]. В ряде экспериментов показано влияние аМГ на
морфологические признаки клеток линии LAN5 [2].
Целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка гипотезы о том, что аМГ
оказывает влияние на рост и развитие клеток нейробластомы in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры. Эксперименты были выполнены in vitro на двух линиях
нейробластом человека UKF-NB-3 и HS-H5-HY. Культивирование данных клеток
проводилось
при 37°С и 5 % СО2 в среде IMDM с добавлением 10 % FCS, 60 мМ
бикарбоната, 2 мМ глютамина, 100 МЕ /мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина
Определение пролиферативной активности клеток. Способность к пролиферации
клеток
нейробластомы
определяли
с
помощью
3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-
дифенилтетразолиумбромид (MTT)-теста. Клетки в течение 3 суток инкубировали в 96луночном планшете с исследуемыми белками (нативный аМГ, активрованный аМГ или
бычий сывороточный альбумин (БСА)) в концентрации 125, 250 или 500 нМ. Затем 4 часа
клетки инкубировали при 5% СО2 и 37°С с MTT-реагентом (0,2 мг/мл). Перевод
образовавшихся гранул формазана в раствор осуществляли с помощью SDS-реагента (20%
раствор, рН 4,7) в течение ночи. Оптическую плотность раствора измеряли при помощи
планшеточного сканера при 550 нм.
Иммуноцитохимическое окрашивание. Клетки фиксировали в течение 15 минут при 20˚С в смеси ацетона и метанола (2:3), затем промывали в моющем буфере и инкубировали с
блокирующим раствором (37˚С, 45 мин.). Добавляли мышиные моноклональные антитела к
аМГ-ЭР (BioMac), инкубировали 1 час при 37˚С, промывали моющим буфером и добавляли
антивидовые антитела, меченные биотином (37˚С, 1 час). Затем добавляли коньюгат
стрептовидина с пероксидазой, инкубировали 30 минут при 37˚С; промывали моющим
буфером и добавляли 30 % перекись водорода, инкубировали 15 минут при 37˚С и
наблюдали окраску под микроскопом.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Общая клеточная РНК была выделена с
использованием TRIzol в соответствие с инструкцией производителя (Gibco-BRL Life
Technologies, Gaithersburg, MD). РНК переводили в ДНК с помощью реакции обратной
транскрипции при 37° С в течение 10 мин, используя обратную транскриптазу MuLV.
Реакцию останавливали нагреванием при 95° С в течение 5 мин. После охлаждения на льду
проводили 40 циклов ПЦР в амплификаторе (Perkin-Elmer Thermo-cycler), используя
специфические
праймеры,
(смысловой:
5´-AAATGCGATGGAGACCACGACTGC-3´,
антисмысловой:
5´-ATCGAACATGTTGCAGCGCAGGGA-3´)
с
помощью
TaqДНК-
полимеразы (Roche) в фирменном буфере, соблюдая следующие условия: денатурация при
95° С 30 сек, отжиг праймеров при 67° С 30 сек, элонгация при 72° С 30 сек. В качестве
контроля параллельно проводили ПЦР с использованием праймера к глицерол-3-фосфат
дегидрогеназе (GAPDH). Визуализацию продуктов реакции осуществляли после разделения
методом
горизонтального
электрофореза
в
1.8
%
агарозном
геле,
содержащем
этидиумбромид, под ультрафиолетовым светом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДАНИЕ
Опыты показали, что БСА и нативный аМГ в концентрации 125 – 500 нМ не оказывают
существенного влияния на пролиферативную активность нейробластом UKF-NB-3 и SН-SY5Y. Культивирование клеток в течение 24 часов в присутствии активированного аМГ
сопровождалось
дозо-зависимым
снижением
пролиферативной
активности.
Так,
в
присутствии 500 нМ активированного аМГ пролиферативная активность клеток UKF-NB-3 и
SН-SY-5Y составила 81,9±2,1 и 72,9±2,8 % по отношению к контролю, соответственно.
Б
120
120
110
110
Пролиферативная
активность (%)
пролиферативная
активность (%)
А
100
90
80
70
*
*
60
100
90
80
*
70
60
*
50
50
500
250
500
125
250
125
Концентрация белка (нМ)
Концентрация белка (нМ)
Рис. 1. Влияние нативного и активированного аМГ на пролиферативную
активность
клеток
линий
UKF-NB-3
(А)
и
SH-SY-5Y
(Б).
Клетки
культивировались в течение 72 часов в присутствии различных концентрация
БСА (--|--), нативного аМГ (--„--) или активированного аМГ (--È--). * изменения статистически достоверны (Р<0,05, t-тест Стъюдента) по отношению к
контролю (культивация клеток без добавления белков).
Аналогичные результаты были ранее получены Fabrizi et al., 1999 [2]: было
установлено, что только активированный, но не нативный аМГ обладает цитотоксичексим
действием по отношении к клеткам нейробластомы линии LAN-5.
Из литературных данных известно, что только активированный аМГ может связываться
со специфическими клеточными рецепторами, в то время как способностью ингибировать
активность протеиназ и способностью образовывать комплексы с цитокинами и ростовыми
факторами обладают обе формы аМГ. Следовательно, можно предположить, что снижение
пролиферативной активности объясняется действием аМГ на специфические клеточные
рецепторы.
Многие линии опухолевых клеток несут на мембране рецепторы к аМГ [5], однако в
литературе отсутствуют данные об экспрессии этих рецепторов на клетках UKF-NB-3 и SHSY-5Y.
Опыты показали, что обе исследуемые клеточные линии экспрессируют существенные
количества аМГ-ЭР на уровне иРНК, причем в линии SН-SY-5Y уровень экспрессии в 3-4
раза выше, чем в линии UKF-NB-3 (рис. 2А). Иммунохимическое окрашивание клеток
подтвердило наличие аМГ-ЭР на клеточной мембране (рис. 2Б).
А
Б
GAPDH аМГ-ЭР
SH-SY-5Y
UKF-NB-3
UKF-NB-3
SH-SY-5Y
Рис. 2. Определение экспрессии аМГ-ЭР в клетках линии SH-SY-5Y и UKF-NB-3
методом полимеразной цепной реакции (A) и иммунохимического окрашивания (Б).
Полученные нами данные об ингибирующем действии аМГ на рост и развитие двух
клеточных линий нейробластомы подтверждают гипотезу о том, что аМГ является
универсальным регулятором межклеточной коммуникации. Отсутствие цитотоксической
активности у нативного аМГ и высокий уровень экспрессии аМГ-ЭР в исследуемых клетках
позволяют предположить, что этот эффект объясняется действием аМГ на специфические
клеточные рецепторы.
Работа выполнена при финансовой поддержке DAAD и фонда «Hilfe für Kinder aus
Tschernobyl».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Businaro R., Fabrizi C., Fumagalli L., Lauro G.M. Synthesis and secretion of alpha 2macroglobulin by human glioma established cell lines. Exp Brain Res. 1992; 88(1): 213-8.
2. Fabrizi C., Businaro R., Lauro G.M., Starace G., Fumagalli L. Activated alpha2macroglobulin
increases beta-amyloid (25-35)-induced toxicity in LAN5 human neuroblastoma cells. Exp
Neurol. 1999; 155(2): 252-9.
3. Isaac L., Florido M.P., Fecchio D., Singer L.M. Murine alpha-2-macroglobulin increase during
inflammatory responses and tumor growth. Inflamm Res. 1999 Aug; 48(8): 446-52.
4. LaMarre J., Wollenberg G.K., Gonias S.L., Hayes M.A. Cytokine binding and clearance
properties of proteinase-activated alpha 2-macroglobulins. Lab Invest. 1991 Jul; 65(1): 3-14.
5. Li Y., Wood N., Parsons P.G., Yellowlees D., Donnelly P.K. Expression of alpha2macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein on surfaces of tumour
cells: a study using flow cytometry. Cancer Lett. 1997 Jan 1; 111(1-2): 199-205
6. May P., Herz J. LDL receptor-related proteins in neurodevelopment. Traffic 2003; 4: 291-301.
7. Misra UK, Pizzo SV. Binding of receptor-recognized forms of alpha2-macroglobulin to the
alpha2-macroglobulin signaling receptor activates phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem.
1998 May 29; 273(22): 13399-402.
8. Misra U.K., Pizzo S.V. Induction of cyclooxygenase-2 synthesis by ligation of the macrophage
alpha(2)-macroglobulin signalling receptor. Cell Signal. 2001 Nov; 13(11): 801-8.
9. Misra U.K., Pizzo S.V. Ligation of the alpha2M signalling receptor elevates the levels of
p21Ras-GTP in macrophages. Cell Signal. 1998 Jun; 10(6): 441-5.
10. Misra U.K., Pizzo S.V. Ligation of the alpha2M signaling receptor regulates synthesis of
cytosolic phospholipase A2. Arch Biochem Biophys. 2001 Feb 15; 386(2): 227-32.
11. Stockinger W., Hengstschlager-Ottnad E., Novak S., Matus A., Huttinger M., Bauer J.,
Lassmann H., Schneider W.J., Nimpf J. The low density lipoprotein receptor gene family.
Differential expression of two alpha2-macroglobulin receptors in the brain. J Biol Chem. 1998
Nov 27; 273(48): 32213-21.
12. Travis J., Salveson G.S. Humal plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. 1983; 52:
655-709.
РЕЗЮМЕ
ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-2-МАКРОГЛОБУЛИНА НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КЛЕТОК
НЕЙРОБЛАСТОМЫ IN VITRO
Сандаков Д.Б., Сухан Т.О.
Белорусский государственный университет, биологический факультет, Минск, Беларусь;
Университет им. И.В.Гете, Институт медицинской вирусологии, Франкфурт-на-Майне,
Германия
Целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка гипотезы о том, что альфа-2макроглобулин (аМГ) оказывает влияние на рост и развитие клеток нейробластомы in vitro.
Опыты показали, что нативный аМГ (125 – 500 нМ) не оказывают существенного влияния на
пролиферативную
активность
нейробластом
линий
UKF-NB-3
и
SН-SY-5Y.
Культивирование клеток в течение 24 часов в присутствии активированного аМГ
сопровождалось дозозависимым снижением пролиферативной активности. Обе исследуемые
клеточные линии экспрессируют иРНК эндоцитозного рецептора аМГ , причем в линии SНSY-5Y уровень экспрессии в 3-4 раза выше, чем в линии UKF-NB-3. Иммунохимическое
окрашивание клеток подтвердило наличие рецептора аМГ на клеточной мембране.