Мевалонатный путь синтеза изопреноидов реализуется в

Аннотация
докторской диссертации Войновой Наталии Евгеньевны
в связи с утвеждением темы диссертации
«Структурно-функциональные особенности мевалонаткиназы и
мевалонатдифосфатдекарбоксилазы – представителей GHMP семейства белков»
Мевалонатный путь синтеза изопреноидов реализуется в цитоплазме животных и
растительных организмов, а также у ряда Г+ кокков, давая начало более 30000
биомолекул, большинство из которых являются жизненно необходимыми, выполняя
разнообразные важнейшие клеточные функции.
Мевалонаткиназа (МК) и мевалонатдифосфатдекарбоксилаза (МДД) катализируют две
ключевые АТФ-зависимые реакции мевалонатного пути и по структурному подобию
относятся к семейству GHMP киназ с характерной структурой АТФ-связывающих
мотивов. Несмотря на значительные успехи в установлении трехмерной структуры МК и
МДД и картировании ряда важных аминокисотных остатков, молекулярные основы
особенностей МК (чувствительность к ингибированию продуктами метаболического
пути) и МДД (АТФ-зависимое декарбоксилирование субстрата, происходящее в этой
лиазной реакции) до сих пор не установлены.
В данной работе проводилось сравнительное структурно-функциональное исследование
рекомбинантных МК человека, крысы и St. aureus (выделена и охарактеризована впервые)
для выявления молекулярных основ различной чувствительности этих ферментов к
ингибированию конечным продуктом метаболического пути – фарнезилпирофосфатом.
Компьютерный анализ имеющихся ранее и вновь полученных трехмерных структур МК
при их кристаллизации в виде апо МК и в комплексе МК-АТФ позволил выбрать
аминокислотные остатки, предположительно ответственные за такие различия. Сайтспецифический мутагенез этих остатков с последующим кинетическим анализом
мутантных и диких форм фермента позволил проверить и подтвердить эти
предположения. Выявленные кардинальные различия в геометрии центра связывания
фарнезилпирофосфата у
МК бактерий и животных служат предпосылкой для
конструирования специфичеких ингибиторов для МКназ патогенных бактерий.
Произведено конструирование рекомбинантной плазмиды на основе вектора рЕТ-23d со
встроенной кДНК МДД человека и впервые получена очищенная рекомбинантная МДД,
экспрессированная в клетках Е соli. С использованием компьютерных программ
произведена локализация молекулы АТФ в имеющейся структуре МДД дрожжей и анализ
аминокислотных остатков, способных участвовать в связывании и декарбоксилировании
мевалонатдирофосфата. Сайт-специфический мутагенез и кинетический анализ
мутантных форм фермента подтвердил участие остатка аргинина и аспарагина в этих
процессах.
В работе использовались разнообразные современные методы: конструирование
рекомбинантных плазмид, сайт-специфический мутагенез с использованием ПЦР в
присутствии мутагенных праймеров, хроматографическая очистка белков, кристаллизация
белков, кинетический анализ, молекулярное моделирование трехмерных структур
ферментов и др. Произведено картирование аминокислотных остатков МК и МДД,
отвечающих за такие специфические свойства этих ферментов, как ингибирование
конечным продуктом для МК и реакции декарбоксилирования для МДД.