На правах рукописи Абдулаева Сабина Олеговна

На правах рукописи
Абдулаева Сабина Олеговна
ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ И
ТОЛСТОЙ КИШКИ МЫШЕЙ BALB/C И C57BL/6 ПРИ
СТРЕССОРНОМ ХОЛОДОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2012
1
Работа выполнена на Биологическом факультете ФГБОУВПО «Московский
государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в ФГБУ «Научноисследовательский институт морфологии человека» РАМН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Макарова Ольга Васильевна
Официальные оппоненты:
Главный научный сотрудник лаборатории развития эндокринной системы
ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН
доктор медицинских наук, профессор
Яглов Валентин Васильевич
Ведущий научный сотрудник лаборатории структуры и функции митохондрий
НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
МГУ им. М.В. Ломоносова
доктор биологических наук
Плотников Егор Юрьевич
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов
Защита диссертации состоится «29» ноября 2012г. в 12.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии
человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы д.3
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии
человека» РАМН
Автореферат разослан «___» октября 2012 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук
Михайлова Лилия Петровна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В последние годы отмечается рост
заболеваемости
синдромом
раздраженной
кишки,
воспалительными
заболеваниями тонкой и толстой кишки, такими как болезнь Крона и
хронический неспецифический язвенный колит (Shi X.Z. et al., 2011; Shokrani
M. et al., 2012). Выраженность морфофункциональных изменений тонкой и
толстой кишки при стрессорных воздействиях и воспалительных заболеваниях
определяется состоянием эпителиальной выстилки, мукозальной иммунной
системы и составом просветной микрофлоры.
По данным литературы, в инициальных механизмах развития синдрома
раздраженной кишки и воспалительных заболеваний кишечника важную роль
играют стрессорные воздействия (Kim J.J. et al., 2012). Влияние
физиологического стресса на состояние нервной, эндокринной и иммунной
системы в литературе освещено достаточно широко (Захарова Л.А. и др., 2010;
Трунова Г.В. и др., 2011). Однако гистофизиологические изменения тонкой и
толстой кишки при стрессорных воздействиях недостаточно изучены.
Выраженность реакции организма на стрессорные воздействия зависит от
генотипа и влияния различных факторов внешней среды (Matrison J., 2010;
Gersemann M. et al., 2012). Для понимания генотипически обусловленных
внутривидовых
различий
адаптивных
и
дизадаптивных
реакций,
воспалительных процессов, развивающихся в тонкой и толстой кишке,
необходимо их изучение на линейных животных. Механизмы внутривидовой
устойчивости к стрессу и, в частности, к холодовому, изучаются на линейных
животных, и наибольшее число работ выполнено на мышах Balb/c и C57Bl/6, у
которых при стрессорных воздействиях развивается, соответственно,
толерантная или резистентная адаптивная реакция (Кондашевская М.В. и
соавт., 2004; Трунова Г.В. и др., 2011; Guo Y. et al., 2012; Weber E. et al., 2012).
Для изучения механизмов развития воспалительного процесса в толстой
кишке используется модель острого язвенного колита, разработанная Okayasy
et al. (1990). По данным экспериментальных исследований, выраженность
морфологических
проявлений
язвенного
колита,
индуцированного
декстрансульфатом натрия, зависит от генотипа: у мышей C57Bl/6 с
преобладанием Тх1 типа иммунного ответа его выраженность выше, чем у
мышей Balb/c с преобладанием Тх2 типа иммунного ответа (Melgar S. et al.,
2005; Nakanishi M. et al., 2007).
Следует отметить, что гистофизиологические изменения тонкой и
толстой кишки при стрессорных воздействиях и воспалительных процессах в
зависимости от преобладания клеточного или гуморального типа иммунного
ответа у человека недостаточно изучены, что диктует необходимость
проведения экспериментальных исследований на линейных животных.
Поэтому целью работы было изучение гистофизиологических изменений
слизистой оболочки тонкой и толстой кишки у мышей Balb/c и C57Bl/6 при
стрессорном холодовом воздействии.
3
Задачи исследования:
1. Провести сравнительное исследование гистофизиологических
особенностей тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры,
уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови самцов-мышей Balb/c
и C57Bl/6 в норме.
2. Изучить морфофункциональные изменения слизистой оболочки тонкой
и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня
кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови, а также цитокинового
профиля у мышей Balb/c и C57Bl/6 на 9-е и 21-е сутки ежедневного
однократного холодового воздействия.
3. Провести оценку морфофункциональных изменений слизистой
оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой
кишки, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови и
цитокинового профиля у мышей Balb/c и C57Bl/6 на 9-е и 21-е сутки
ежедневного двукратного холодового воздействия.
4. Провести сравнительную оценку изменений структурных компонентов
тонкой и толстой кишки, просветной микрофлоры, уровня кортикостерона и
эндотоксина в сыворотке крови и цитокинового профиля в разные сроки при
однократном и двукратном холодовом воздействии.
5. На модели острого язвенного колита, вызванного декстрансульфатом
натрия, изучить у мышей Balb/c и C57Bl/6 патоморфологические изменения
толстой кишки, оценить состояние ее просветной микрофлоры и цитокинового
профиля.
6. Оценить выраженность патоморфологических проявлений острого
язвенного колита, состава просветной микрофлоры толстой кишки и
цитокинового профиля у мышей Balb/c и C57Bl/6, которых подвергали
предварительному стрессорному холодовому воздействию.
Научная новизна. Впервые охарактеризованы гистофизиологические
различия тонкой и толстой кишки у мышей-самцов Balb/c и C57Bl/6. В
условиях физиологического функционирования, по сравнению с мышами
C57Bl/6, у мышей линии Balb/c в тощей и ободочной кишке более выражен
слизистый барьер. Мукозальная иммунная система у мышей Balb/c
характеризуется
высокими
показателями
числа
межэпителиальных
лимфоцитов, а у C57Bl/6 – числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной
пластинке слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В составе просветной
микрофлоры у мышей Balb/c выше уровень условно-патогенных энтерококков
E.fecium.
Курсовое ежедневное однократное и двукратное стрессорное холодовое
воздействие вызывает у мышей Balb/c и C57Bl/6 адаптивные
гистофизиологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки,
характеризующиеся снижением числа визуализируемых бокаловидных клеток и
клеток Панета. В подвздошной и ободочной кишке у мышей C57Bl/6
увеличивается число энтероэндокринных клеток. У мышей обеих линий
4
однонаправленно изменяется состояние мукозальной иммунной системы,
увеличивается показатель числа межэпителиальных лимфоцитов и лимфоцитов
в составе клеточных элементов собственной пластинки слизистой оболочки.
Однократное и двукратное курсовое холодовое воздействие у мышей
обеих линий оказывает положительный эффект на состав просветной
микрофлоры, увеличивая количество лактозоферментирующих E. coli и
лактобактерий.
Стрессорное холодовое воздействие оказывает протективный эффект при
индуцированном декстрансульфатом натрия остром язвенном колите у мышей
Balb/c и C57Bl/6, за счет противовоспалительного действия кортикостерона,
уровень которого в сыворотке крови повышается при холодовом воздействии.
Морфологические проявления острого язвенного колита при предварительном
курсовом ежедневном холодовом воздействиии менее выражены у мышей
обеих линий.
Практическая
значимость.
Данные
по
внутривидовым
морфофункциональным реакциям тонкой и толстой кишки на стрессорное
воздействие при преобладании Т-хелпер1 или Т-хелпер2 типа иммунного
ответа позволят разработать методологические подходы к выделению
индивидуальных критериев и групп риска развития дисбиотических состояний
и воспалительных заболеваний толстой кишки у человека.
Внедрение в практику. Материалы диссертационного исследования
используются в лекционном курсе на кафедре гистологии, цитологии и
клеточной
биологии
Биологического
факультета
Московского
государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы
Результаты исследования и основные положения работы доложены и
обсуждены на IV Архангельской международной медицинской научной
конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011); XIV
Всероссийском форуме «Дни иммунологии» (Санкт-Петербург, 2011); IV
Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в
медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва,
2011); XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых
ученых «Ломоносов» (Москва, 2011); научной конференции «Актуальные
вопросы морфогенеза в норме и при патологии» (Москва, 2012); IV ежегодном
всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012);
совместном заседании кафедры клеточной биологии и гистологии
Биологического факультета Московского государственного университета им.
М.В. Ломоносова и научных лабораторий ФГБУ «НИИ морфологии человека»
РАМН (сентябрь, 2012)
Публикации материалов исследования
По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3
статьи представлены в изданиях, включенных в «Перечень периодических
изданий», рекомендованных ВАК РФ.
5
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзора литературы,
материалов и методов исследования, результатов собственных исследований,
обсуждения полученных результатов и практических рекомендаций; выводов и
списка литературы. Работа изложена на 182 страницах машинописного текста и
проиллюстрирована 29 рисунками и 28 таблицами. Библиографический
указатель включает 186 источников (27 отечественных и 159 иностранных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В работе использовали половозрелых самцов мышей Balb/c (n=70) и
C57Bl/6 (n=70), полученных из питомника «Столбовая». Возраст мышей
составил 9-10 нед, масса тела 23-25г. При работе с экспериментальными
животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от
12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической
комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол №7 от
20.12.2009 г.).
Для
изучения
влияния
физиологического
стресса
на
морфофункциональное состояние тонкой и толстой кишки моделировали
однократное (первая группа) и двукратное (вторая группа) холодовое
воздействие. Животных первой группы (n=32) ежедневно в утренние часы (8.00
– 10.00) подвергали холодовому воздействию – плаванию в воде со льдом (t°
+4°C) в течение 2-х минут однократно, второй группы (n=32) – двукратно.
Степень охлаждения, согласно классификации Т.В. Козыревой (2002), была
глубокой, так как ректальная температура снижалась в среднем на 2°С у
мышей Balb/c и 2,5°С – у C57Bl/6. После холодового воздействия у мышей
обеих линий в течение 10-15 мин отмечался мышечный тремор и пилоэрекция.
Исследование проводили на 9-е и 21-е сут холодового воздействия. Мышей
опытных и контрольных групп (n=16) выводили из эксперимента
передозировкой диэтилового эфира через 1,5 часа после последнего сеанса
холодового воздействия.
Для решения вопроса о протективном или дизадаптивном характере
реакций, вызываемых холодовым воздействием, у мышей Balb/c и C57Bl/6
после 9-ти сут однократного холодового воздействия воспроизводили по
Okayasu et al. (1990) модель колита, индуцированного декстрансульфатом
натрия. Исследование проводили на трех группах мышей обеих линий: с
острым язвенным колитом (n=20); с острым язвенным колитом на фоне
предварительного холодового воздействия (n=20); контрольная группа (n=20).
Мыши первой группы с питьевой водой получали декстрансульфат натрия
(молекулярная масса 100000; Fluka): 5% раствор в течение 4-х сут и 7%
раствор в течение последующих 3-х сут. Вторая группа мышей получала
раствор декстрансульфата натрия в указанных концентрациях и режиме после
9-ти сут ежедневного однократного холодового воздействия.
6
Методы исследования
Гистологические. Проводили забор фрагментов тощей, подвздошной и
среднего отдела ободочной кишки у животных опытных и контрольных групп.
Фрагменты органов фиксировали в растворе Буэна и жидкости Копш-Рего с
целью лучшей визуализации клеток Панета. Фрагменты органов заливали в
парафин и окрашивали гематоксилином и эозином.
Гистохимические. Для выявления в составе секрета бокаловидных клеток
тонкой и толстой кишки кислых гликопротеинов использовали окраску
альциановым синим, нейтральных гликопротеинов – PAS-реакцию. С целью
выявления гранул декстрансульфата фрагменты подвздошной кишки,
брыжеечных лимфатических узлов и печени фиксировали в жидкости Карнуа и
гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (рН 2,0).
Иммуногистохимические. Для выявление энтероэндокринных клеток
использовали антитела к хромогранину А (Rabbit polyclonal to Chromogranin A,
Abcam), в рекомендованном производителем титре 1:100, при инкубации 18 ч в
холодильнике (12ºС). Вторые антитела (HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Invitrogen)
использовали в титре 1:100, срезы инкубировали 18 ч (12ºС). Для визуализации
реакции применяли набор Dako EnVision-HRP (DAB).
Морфометрические. При морфометрическом исследовании, с помощью
сетки Г.Г. Автандилова (1973), определяли соотношение объемной доли
энтероцитов и бокаловидных клеток, объемной доли стромы и клеточных
элементов в собственной пластинке слизистой оболочки (СПСО) ободочной
кишки. Проводили дифференцированный подсчет клеточных элементов (на
1000 клеток) в СПСО тощей, подвздошной и ободочной кишки, с определением
относительного количества нейтрофилов и лимфоцитов; подсчет числа
межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) на 1000 эпителиоцитов в СПСО тощей
и подвздошной кишки. Определяли количество митозов (на 1000 клеток крипт)
в тощей, подвздошной и ободочной кишке. Подсчитывали число
визуализируемых бокаловидных клеток на ворсинку в тощей и подвздошной
кишке и на крипту в ободочной кишке; визуализируемых клеток Панета на
крипту тощей и подвздошной кишки; энтероэндокринных клеток на ворсинку и
крипту тощей и подвздошной кишки, на крипту ободочной кишки.
В гистологических срезах ободочной кишки животных с острым
язвенным
колитом,
индуцированным
декстрансульфатом
натрия,
полуколичественно (в баллах) оценивали выраженность патоморфологических
изменений с помощью модифицированной нами шкалы S. Kitajima (2000) по
ряду критериев. Распространенность язв: 0 – отсутствует; 1 – площадь язв
занимает 10-20%; 2 – 21-50%; 3 - 51-80% поля зрения; 4 - площадь язвы
занимает все поле зрения. Глубина некроза: 0 – отсутствует; 1 – некроз 1/3; 2 –
2/3 высоты крипт; 3 – тотальный некроз слизистой оболочки. Выраженность
отека подслизистого слоя: 0 – отсутствует; 1 – подслизистый слой, шириной не
более, чем в два раза больше; 2 –шириной не более, чем в три раза больше; 3 –
шириной более, чем в три раза больше, по сравнению с нормой, и наличие в
7
нем воспалительной инфильтрации нейтрофилами; 4 – сочетание указанных
выше изменений с резко выраженным отеком, выраженной диффузной и
очаговой инфильтрацией нейтрофилами.
Морфометрическую оценку площади кровоизлияний и язв в
макропрепаратах продольно рассеченной ободочной кишки у мышей с
язвенным колитом проводили на фотографиях с помощью морфометрической
программы Image-Pro.
Культуральные. С целью изучения цитокинового профиля из селезенки
мышей контрольных и опытных групп выделяли клетки с помощью
стеклянного гомогенизатора Поттера. Для индукции продукции цитокинов
суспензию клеток селезенки культивировали 24 часа в 1мл полной ростовой
среды с добавлением конканавалина А (5 мкг/мл) в 24-х луночных
культуральных панелях при 37°С в атмосфере 5% СО2. По окончании
инкубации отбирали надосадки, которые хранили при -20°С не более трех
месяцев. Среда для культивирования состояла из RPMI 1640 с добавлением 5%
фетальной сыворотки и антибиотиков.
Иммуноферментный. Для определения уровня кортикостерона
использовали набор Corticosterone ELISA IBL International GMBH. Определение
уровня эндотоксина в сыворотке крови проводили с использованием набора
Hycult Biotech LAL.
Проточная цитофлюориметрия. В культуральной жидкости спленоцитов,
активированных конканавалином А, определяли уровень цитокинов - ИЛ-1,
ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-17, ИФН-γ, ФНО-α, ГМ-КСФ методом
проточной цитофлюориметрии с использованием набора mouse Th1/Th2 10plex
BMS820FF BenderMedSystems на приборе CytomicsFC500 «BeckmanCoulter»
Бактериологические. Оценку состояния микрофлоры толстой кишки
проводили путем высева на соответствующие питательные среды (HiMedia,
Индия) десятичных разведений гомогената фекалий, взятых из прямой кишки.
Определяли уровень лактозоположительных и лактозоотрицательных
энтеробактерий, энтерококков (E. faecalis et fecium), лактобактерий. Результаты
посевов представляли в виде количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на
1 грамм фекалий.
Статистические. Статистическую обработку показателей проводили с
учетом характера распределения параметрическими (t-критерий Стьюдента) и
непараметрическими (U-критерий Манн-Уитни) методами. Различия считали
достоверными при p≤0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительная гистофизиологическая характеристика слизистой
оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры
толстой кишки и уровня кортикостерона у мышей Balb/c и C57Bl/6
В условиях физиологического функционирования, у мышей-самцов
Balb/c, в отличие от мышей C57Bl/6, более высокий уровень кортикостерона
8
(соответственно, 95,8 и 20,0 nmol/L; p≤0,05). Повышенное содержание
кортикостерона в сыворотке крови мышей Balb/c, по сравнению с мышами
других линий, и, в том числе C57Bl/6, также выявлено V. Brinks et al. (2009) и
M.L. Palumbo et al. (2010). По нашим данным, высокий уровень кортикостерона
в сыворотке крови мышей Balb/c сочетался с низким показателем митотической
активности эпителия тонкой кишки, а у мышей C57Bl/6 низкий уровень
кортикостерона – с высокой митотической активностью. Полученные
результаты соответствуют данным литературы об обратной корреляционной
связи между уровнем кортикостерона и митотической активностью эпителия
(Алов И.А., 1964; Alahmed S. et al., 2008). В подвздошной кишке у мышей
C57Bl/6, по сравнению с Balb/c, выявлена большая численность популяции
секретирующих дефенсины клеток Панета (рис.1), что в сочетании с высокой
митотической активностью эпителия и локализацией клеток Панета в дне крипт
предопределяет эффективную защиту стволовых и малодифференцированных
эпителиальных клеток от повреждающего воздействия (Roth S. et al., 2012). По
сравнению с C57Bl/6 в тощей кишке у мышей Balb/c было большее количество
МЭЛ (рис.1), являющихся частью эфферентного звена иммунной системы
слизистых оболочек (Cheroutre H. et al., 2011).
В ободочной кишке у мышей Balb/c увеличена объемная доля
бокаловидных клеток, что отражает повышение накопления гликопротеинов,
которые формируют на поверхности слизистой оболочки покровный вязкоэластический слой слизи (рис.1). Слизистый барьер препятствует повреждению
эпителия и является основой биопленки для пристеночной микрофлоры
(Prakash S. et al., 2011). По-видимому, даже в физиологических условиях, у
мышей с Tx1-типом иммунного ответа (C57Bl/6) взаимодействие паттернраспознающих рецепторов энтероцитов и иммуноцитов с пептидогликанами
микроорганизмов вызывает более выраженные иммунологические реакции и
темпы обновления эпителия. Увеличение числа клеточных элементов в
собственной пластинке слизистой оболочки у мышей-самцов C57Bl/6
сочеталось с повышением содержания нейтрофилов и лимфоцитов. Повышение
содержания нейтрофилов может быть обусловлено особенностями
функционального состояния системы перекисное окисление липидов –
антиоксидантная защита. В норме у мышей C57BL/6, по сравнению с Balb/c,
более низкая активность антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы и
каталазы (Трунова Г.В., 2004).
В отличие от мышей C57Bl/6, у мышей Balb/c в толстой кишке выявлено
более высокое количество E. fаecium (соответственно, 1350 и 6900 КОЕ/г;
р≤0,05), что сочетается с увеличением численности популяции бокаловидных
клеток и, соответственно, с формированием более выраженного слоя слизи,
препятствующего взаимодействию микрофлоры и эпителия толстой кишки
(Sansonetti P.J. et al., 2011). Показатели уровня эндотоксина в сыворотке крови у
мышей сравниваемых линий были низкими и достоверно не различались, что
соответствует литературным данным и отражает отсутствие нарушения
9
слизистого барьера и проницаемости эпителиального слоя толстой кишки
(Рябиченко Е.В. и др., 2007).
Бокаловидные клетки
(тощая кишка)
Межэпителиальные лимфоциты
(тощая кишка)
200
3
*
150
2
*
1
‰
число на ворсинку
4
100
50
0
Balb/c
C57Bl/6
0
Balb/c
Нейтрофилы в собственной пластинке
слизистой оболочки (тощая кишка)
Median
25%-75%
Лимфоциты в собственной пластинке
слизистой оболочки (тощая кишка)
Non-Outlier Range
4,5
C57Bl/6
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
4,5
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
2,5
3,0
2,0
2,5
1,5
2,0
*
1,0
0,5
*
1,5
1,0
0,0
-0,5
0,5
Balb/c
C57Bl/6
Balb/c
Бокаловидные клетки
(ободочная кишка)
6
70
5
60
4
*
50
3
%
число на крипту
Клетки Панета
(подвздошная кишка)
C57Bl/6
40
Balb/c
C57Bl/6
*
*
30
2
20
1
10
0
Balb/c
C57Bl/6
0
Объемная доля
Число
Рис.1. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тонкой и толстой
кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 в физиологических условиях, M±SE
Сравнительная гистофизиологическая характеристика слизистой
оболочки тонкой и толстой кишки и состава просветной микрофлоры
мышей Balb/c и C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом
воздействии
С целью моделирования стресс-реакций мышей Balb/c и C57Bl/6
подвергали курсовому ежедневному однократному холодовому воздействию.
10
Холодовое воздействие вызывало у мышей Balb/c и C57Bl/6 повышение в
сыворотке крови уровня кортикостерона, что отражает стрессорный характер
воздействия (рис.2).
Balb/c
Median
25%-75%
C57Bl/6
Non-Outlier Range
400
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
240
350
*
300
*
*
220
200
180
160
250
140
120
200
100
80
150
*
60
100
40
20
50
0
0
-20
контроль
9-е сут
21-е сут
контроль
9-е сут
21-е сут
Рис.2. Изменение содержания кортикостерона (nmol/L) в сыворотке крови
мышей Balb/c и C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии
При качественном морфологическом исследовании в тонкой и толстой
кишке у мышей Balb/c и C57Bl/6, подвергавшихся курсовому однократному
холодовому воздействию в течение 9 и 21 сут, альтеративных изменений не
было выявлено.
В ответ на курсовое ежедневное однократное холодовое воздействие в
слизистой оболочке тощей и подвздошной кишки у мышей Balb/c и C57Bl/6
снижалось число клеток Панета, кроме того, у мышей C57Bl/6 увеличивалось
число энтероэндокринных клеток; в тощей кишке у мышей обеих линий
снижалось число бокаловидных клеток; в подвздошной кишке у мышей Balb/c
уменьшалось число бокаловидных клеток (рис.3,4).
В ободочной кишке мышей Balb/c и C57Bl/6 динамика изменений числа
энтероэндокринных клеток была разнонаправленной: у мышей Balb/c их число
снижалось, а у мышей C57Bl/6 увеличивалось. В ободочной кишке мышей
Balb/c также снижалось число бокаловидных клеток, но увеличивалась их
объемная доля (рис.5).
Число визуализируемых бокаловидных клеток у мышей Balb/c в тонкой и
толстой кишке уменьшалось, но в сочетании с выраженным окрашиванием их
цитоплазмы альциановым синим и при проведении PAS-реакции, что отражает
присутствие в секрете и кислых, и нейтральных гликопротеинов. Важная роль
слизи в функционировании кишечного барьера убедительно показана в ряде
работ, в которых у мышей, нокаутных по гену MUC2, слой слизи,
покрывающий эпителий, был тонким и бактерии контактировали с
эпителиальными клетками, что приводило к развитию воспалительного
процесса (Van der Sluis M. et al., 2006; Johansson M. E. et al., 2008; Salim S. Y. et
al., 2011).
11
Бокаловидные клетки
Клетки Панета
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
*
Balb/c
*
0
1
C57Bl/6
*
*
Balb/c
*
2
3
4
контроль
9 сут
21 сут
*
0.0
0.5
число на ворсинку
1.0
1.5
2.0
*
2.5
3.0
3.5
число на крипту
Энтероэндокринные клетки
Энтероэндокринные клетки
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
Balb/c
C57Bl/6
*
контроль
9 сут
21 сут
Balb/c
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
число на крипту
число на ворсинку
Рис.3. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тощей кишки мышей
Balb/c и C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии
Клетки Панета
Бокаловидные клетки
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
Balb/c
1
*
*
Balb/c
*
0
C57Bl/6
контроль
9 сут
21 сут
*
2
3
4
5
0
6
Энтероэндокринные клетки
C57Bl/6
1
2
3
4
5
6
число на крипту
число на ворсинку
Энтероэндокринные клетки
*
Balb/c
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
*
контроль
9 сут
21 сут
Balb/c
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
число на крипту
число на ворсинку
Рис.4. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки подвздошной кишки
мышей Balb/c и C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии
12
Бокаловидные клетки
Бокаловидные клетки
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
Balb/c
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
Balb/c
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
число на крипту
объемная доля
Энтероэндокринные клетки
контроль
9 сут
21 сут
C57Bl/6
*
Balb/c
*
0.0
0.1
*
0.2
0.3
Рис.5. Морфометрическая
характеристика слизистой оболочки
ободочной кишки мышей Balb/c и
C57Bl/6 при курсовом ежедневном
однократном холодовом воздействии
0.4
число на крипту
Муцин, продуцируемый бокаловидными клетками, играет роль не только
механического барьера, но и способен адгезировать бактерии. Возможность
связывания бактерий со специфическим эпитопом муцина облегчает
колонизацию комменсальной флоры. Поэтому муцины во-многом определяют
состав пристеночной микрофлоры (Young C. et al., 2009). Буферный слой слизи
можно условно разделить на две фракции. Во внешнем слое защитной слизи
находится большинство микроорганизмов. Внутренний слой остается
относительно стерильным, чему способствует высокая концентрация
антимикробных белков, продуцируемых клетками Панета. В кишечнике
млекопитающих клетки Панета секретируют эндогенный лизоцим, секреторные
иммуноглобулины, кислую фосфатазу, дегидрогеназу, фосфолипазу А2 и
дефенсины (Vaishnava S. et al., 2008; Nieuwenhuis E. E. et al., 2009). В клетках
Панета выявляются IgА, IgG и IgE, и они характеризуются высокой
экспрессией CD95, «домена смерти» необходимого для трансдукции
цитотоксического сигнала. Все это указывает на участие клеток Панета в
поддержании нормальной структуры и барьерной функции слизистой оболочки
кишки (Shi J. et al., 2007), регулировании роста бактериальной флоры тонкой
кишки (Brugman S. et al., 2010), модулировании цитокинового ответа
моноцитов и лимфоцитов, выработке аттрактантов для иммунокомпетентных
клеток при инфекционном воспалении (Grigat J., 2007). В то же время,
дефенсины являются мощными активаторами врожденного иммунитета. В
13
очаге воспаления они индуцируют хемотаксис наивных Т-лимфоцитов,
моноцитов и незрелых дендритных клеток, усиливают синтез цитокинов и
хемокинов (Yang D. et al., 2009). Выявленное нами при холодовом воздействии
снижение числа визуализируемых клеток Панета (рис.3,4), может быть
обусловлено опустошением их цитоплазмы в результате повышенной секреции
гранул, либо снижением экспрессии генов Wnt-сигнального пути, который
определяет дифференцировку стволовых клеток в секреторные (Medema J.P. et
al., 2011).
Динамика изменения популяции энтероэндокринных клеток (рис.5),
выявленных с помощью антитела к хромогранину А, при холодовом
воздействии у мышей сравниваемых линий отличается. По данным W.I.Khan
(2010) хромогранин может осуществлять одновременно провоспалительную и
противовоспалительную функции, а также регулировать проницаемость
эндотелия
при
воспалительном
процессе,
предотвращая
ФНО-α
индуцированный отек. В то же время, концентрация хромогранина прямо
коррелирует с уровнем маркеров воспаления, такими как прокальцитонин и Среактивный белок (Zhang D. et al., 2009; Khan W. I. et al., 2010). Принимая во
внимание, что патогенетические механизмы синдрома раздраженной кишки
связаны с увеличением количества и функциональной активности общей
популяции энтероэндокринных клеток (Spiller R. et al., 2008; Sidhu R. et al.,
2010), увеличение количества последних в слизистой оболочке тонкой и
толстой кишки мышей C57Bl/6 может косвенно указывать на изменение
моторики, процессов секреции и всасывания.
Эпителиальная выстилка кишечника – это зона взаимодействия между
иммунной системой слизистых оболочек и бактериями пристеночной и
просветной микрофлоры (Wang F. et al., 2011). По результатам нашего
исследования, реакция мукозальной иммунной системы тонкой и толстой
кишки мышей сравниваемых линий при курсовом ежедневном однократном
холодовом воздействии, характеризовалась увеличением числа МЭЛ и
лимфоцитов в составе клеточных элементов СПСО тощей и подвздошной
кишки (рис.6).
Повышение числа МЭЛ и лимфоцитов в СПСО соотносится с
литературными данными об уменьшении количества лимфоцитов,
циркулирующих в крови, при увеличении концентрации кортикостерона в
ответ на стрессорное воздействие, что носит адаптивный характер и отражает
перераспределение клеток, в первую очередь, в барьерные в органы и ткани
(Stefanski V. et al., 2003).
Большинство лимфоцитов в СПСО – это B-клетки (15-40%), Т-клетки (4090%) и небольшое количество естественных киллеров (Тертычный А. С. и др.,
2011). В-клетки дифференцируются в плазмоциты, которые секретируют IgA,
IgM, IgG в пропорции 90:6:4. Большинство Т-клеток в СПСО имеют фенотип
хелперов (CD3+, CD4+). Синтезируемый лимфоцитами СПСО IgA, отличается
от IgA, циркулирующего в сыворотке крови тем, что не активирует комплемент
14
и не влияет на продукцию провоспалительных цитокинов, что обеспечивает
идеальную защиту поверхности слизистой оболочки (Trushina E. N. et al., 2004).
Лимфоциты в СПСО
тощей кишки
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
16
14
12
*
*
10
8
6
4
2
0
C57Bl/6
Balb/c
контроль
Лимфоциты в СПСО
подвздошной кишки
Median
25%-75%
9сут
21сут
контроль
9сут
21сут
Лимфоциты в СПСО
ободочной кишки
Non-Outlier Range
Median
8
25%-75%
Non-Outlier Range
7
7
6
*
*
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
-1
Balb/c
C57Bl/6
контроль
9сут
21сут
контроль
9сут
21сут
C57Bl/6
Balb/c
-1
контроль
9сут
21сут
контроль
9сут
21сут
Рис.6. Характеристика мукозальной иммунной системы слизистой оболочки тонкой и
толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном
холодовом воздействии
МЭЛ – это Т-лимфоциты, локализованные в эпителиальной выстилке
слизистой оболочки. Большинство МЭЛ представлено CD8+лимфоцитами,
осуществляющими «киллинг» инфицированных эпителиальных клеток.
Меньшая часть популяции МЭЛ – CD4+CD8+лимфоциты, которые способны
подавлять Тх1-опосредованное воспаление в стенке кишечника ИЛ10зависимым путем (Atarashi K. et al., 2011). МЭЛ находятся в постоянном
контакте с антигенами просвета кишечника и являются первой структурой
иммунной системы, которая взаимодействует с антигенами (Cheroutre H. et al.,
2011). МЭЛ секретируют ряд хемокинов, что ограничивает возможность
бактериальной транслокации через слизистые оболочки (Ismail A. S. et al.,
2009). Наряду с этим, МЭЛ обеспечивают восстановление эпителия после
повреждения, что связано с их способностью регулировать продукцию KGF
(keratinocyte growth factor - фактор роста кератиноцитов) и стимулировать
пролиферацию прогениторных клеток в кишечных криптах (Ismail A. S. et al.,
2009).
15
Сравнительная гистофизиологическая характеристика слизистой
оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при курсовом
ежедневном двукратном холодовом воздействии
Применение курсового ежедневного двукратного холодового воздействия
у мышей Balb/c и C57Bl/6 не привело к развитию дизадаптивных,
альтеративных и воспалительных реакций в слизистой оболочке тощей,
подвздошной и ободочной кишки. Реакция тонкой и толстой кишки, как при
однократном, так и при двукратном ежедневном холодовом воздействии, была
однонаправленной и сходной по характеру вызванных изменений. По
морфологическим данным, выраженность и направленность структурных
изменений тонкой и толстой кишки при использовании сравниваемых режимов
холодового воздействия у мышей Balb/c и C57Bl/6 не отличались. Однако, по
сравнению с однократным, при двукратном холодовом воздействии активация
мукозальной иммунной системы была более выражена: в тонкой кишке
содержание лимфоцитов в СПСО было более, чем в 2, а в толстой – более, чем
в 5 раз больше у мышей обеих линий.
Изменения состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня
эндотоксина и цитокинового профиля у мышей Balb/c и C57Bl/6 при
курсовом ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии
По результатам микробиологического исследования, при ежедневном
однократном и двукратном холодовом воздействии у мышей Balb/c и C57Bl/6
количественный состав микрофлоры толстой кишки изменялся: увеличивалось
количество лактозопозитивных, лактозонегативных энтеробактерий и
лактобактерий (табл.1). Кроме того, нами было выявленно повышение уровня
условнопатогенных энтерококков E. faecalis и
E. fecium, которое при
увеличении сроков холодового воздействия сменялось нормализацией их
количества (табл.1). Увеличение количества лактозоферментирующих E. coli и
лактобактерий свидетельствует о положительном влиянии использованного
режима холодового воздействия на микробиоту кишечника. Так как, по данным
литературы, лактобактерии, как представители сахаролитической микрофлоры,
помимо молочной кислоты способны продуцировать целый ряд
низкомолекулярных
метаболитов,
обладающих
выраженным
бактериостатическим эффектом: органические кислоты, перекись водорода,
диацетил, реутерин и т.д. Помимо этого, низкомолекулярные метаболиты,
блокируя рецепторы эпителиоцитов, препятствуют адгезии патогенной
микрофлоры к эпителию и обладают способностью индуцировать хемотаксис
бактерий (Stoianova L. G. et al., 2012).
По нашим данным, при однократном холодовом воздействии у мышей
Balb/c повышается продукция клетками селезенки уровня ФНОα и ГМ-КСФ, а у
мышей C57Bl/6 – уровня ИФНγ (рис.7). Различия в изменении продукции и
секреции цитокинов при холодовом воздействии, по-видимому, связаны с тем,
что у мышей Balb/c и C57Bl/6 исходно разный тип иммунологической
16
реактивности: преобладание гуморального типа иммунных реакций у мышей
Balb/c и клеточного – у мышей C57Bl/6 (Palumbo M. L. et al., 2010). В
литературе показано, что повышение продукции цитокинов, таких как ФНО-α и
ИФН-γ, может быть обусловлено разнообразными факторами (Palumbo M. L. et
al., 2010), в том числе, эндотоксином. В частности, в нашем исследовании,
повышение продукции и секреции цитокинов сопряжено с увеличением уровня
эндотоксина в сыворотке крови, также наблюдаемым нами при однократном
холодовом воздействии у мышей C57Bl/6 (табл.1). Так, уровень эндотоксина в
сыворотке крови у мышей C57Bl/6 повышался на 9-е сут и снижался
относительно контроля на 21-е сут исследования, а у мышей Balb/c достоверно
не изменялся. По данным B. Spellberg et al. (2000), увеличение содержания
кортикостерона в сыворотке крови при стрессорных воздействиях приводит к
увеличению проницаемости кишечного эпителия, в том числе для эндотоксина.
Это согласуется с нашими данными, по которым повышение уровня
эндотоксина коррелирует с максимальным уровнем кортикостерона, также
наблюдаемым на 9-е сут однократного холодового воздействия у мышей
C57Bl/6 (уровень этого гормона более, чем в 7 раз превысил контрольные
значения).
При двукратном холодовом воздействии уровень цитокинов, с
увеличением сроков эксперимента, прогрессирующе снижался (рис.7), что
также отмечалось в ряде исследований, посвященных изучению изменений
цитокинового профиля при физиологическом стрессе (Cohen S. et al., 2012; Karp
C. L. et al., 2012). Иммуносупрессия, развивающаяся при острых стрессорных
воздействиях, является одним из механизмов адаптационного процесса,
ограничивающего негативное влияние стрессорных агентов на иммунную
систему (Scott C. L. et al., 2011). В тоже время, длительное снижение
иммунологических функций может приводить к формированию вторичного
иммунодефицита и на его фоне – развитию воспалительных заболеваний (Shah
N. et al., 2012).
Снижение уровня продукции цитокинов, очевидно, также связано с
противовоспалительным эффектом повышенного уровня кортикостерона
(рис.2), так как, по данным литературы, известно прямое ингибирующее
действие глюкокортикоидов на синтез цитокинов (Bauer M. E. et al., 2001). Под
влиянием холодового воздействия наблюдаемое нами повышение уровня
кортикостерона у мышей обеих линий, очевидно, блокирует активацию NF-kB,
что в свою очередь ингибирует гены воспалительного и иммуного ответа и
приводит к снижению уровня иммунорегуляторных Тх1 (ИФН-γ, ИЛ-2), Tх2
(ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6), Tх3 (ИЛ-17) и провоспалительных (ФНОα)
цитокинов. Помимо этого, глюкокортикоиды ингибируют экспрессию молекул
адгезии и рецепторов к цитокинам на поверхности иммунокомпетентных и
других клеток, что приводит к снижению чувствительности к цитокинам (Bauer
M. E. et al., 2001).
17
18
5
0 (0;0)
E.faecalis
2
1
0 (0;0)
4500
(1700;14500)
0 (0;0)
6900
(5025;7500)
E.faecalis
E.fecium
Эндотоксин
0,01
(0,00;5,13)
0,01
(0,01;0,12)
4500
(2000;7000)
1000
(160;2500)
0 (0;0)
41 (5;300)
80 (10;150)
21-е сут ХВ
3
0,00
(0,00;0,01)
80 (67;350)
1700
(1100;2000)
0 (0;0)
75 (25;950)
1 (1;100)
3
21-е сут ХВ
56,0 (27,0;59,0)
55,5 (4,1;336) 400 (200;4250)
80 (17;177,5)
5,4 (1,1;14,5)
Lac-
2 (1; 9)
3,5 (1;40)
Lac+/E.coli
Лактобактерии (*105)
Энтерококки (*105)
Энтеробактерии
(*105)
9-е сут ХВ
контроль
Двукратное холодовое
воздействие
Balb/c
0,01
(0,00;5,13)
Эндотоксин
1050
(210;3500)
150
(73,3;700)
0,24
(0,04;5,20)
0 (0;100)
505 (0;2400)
100 (90;690)
Balb/c
9-е сут ХВ
2
55,5 (4,1;336)
6900
(5025;7500)
5,4 (1,1;14,5)
Lac-
E.fecium
3,5 (1;40)
Lac+/E.coli
контроль
1
Лактобактерии (*105)
Энтерококки (*10 )
Энтеробактерии
(*105)
Однократное холодовое
воздействие
0,04
(0,02;0,06)
96 (1;1260)
1350
(715;1850)
0 (0;0)
2,5 (1,1;8,2)
2,2 (0;9,1)
4
контроль
0,04
(0,02;0,06)
96 (1;1260)
1350
(715;1850)
0 (0;0)
2,5 (1,1;8,2)
2,2 (0;9,1)
контроль
4
0 (0; 0)
3900
(2300;9400)
0,3 (0,3;0,5)
6
21-е сут ХВ
0,0 (0,0;0,02)
172 (35;1000)
1200
(700;2850)
0 (0;0)
20 (5;13000)
18 (1,3;90)
21-е сут ХВ
6
6650
1200
(1650;29000)
(1100;1200)
1450
150 (20;325)
(500;8600)
0,58
0,05 (0,00;0,11)
(0,06;1,05)
0 (0; 0)
49 (25;100)
73 (16;130)
5
9-е сут ХВ
С57Bl/6
500
(500;1500)
1000
(370;4300)
550
(363;4800)
0,24
(0,07;0,40)
96 (0,1;160)
200
(48,5;465)
С57Bl/6
9-е сут ХВ
5
p1-3=0,04
p4-6=0,21
p1-3=0,03
p4-6=0,02
p1-3=1,00
p4-6=1,00
p1-3=0,14
p4-6=0,83
p1-3=0,01
p4-6=0,58
p1-3=1,00
p4-6=0,04
р1-2=0,58
p4-5=0,00
р1-2=0,01
p4-5=0,01
р1-2=1,00
p4-5=1,00
р1-2=0,83
p4-5=0,02
р1-2=0,02
p4-5=0,03
р1-2=0,65
p4-5=0,13
р1-3=1,00
p4-6=0,21
р1-3=0,04
p4-6=0,00
р1-3=1,00
p4-6=1,00
р1-3=0,01
p4-6=0,63
р1-3=0,39
p4-6=0,91
р1-3=0,30
p4-6=0,66
Порог доверительной
вероятности
p1-2=0,00
p4-5=0,00
p1-2=0,12
p4-5=0,26
p1-2=0,11
p4-5=0,00
p1-2=0,01
p4-5=0,64
p1-2=0,18
p4-5=0,04
p1-2=0,82
p4-5=0,03
Порог доверительной
вероятности
Изменения просветной микрофлоры (КОЕ/г) толстой кишки и уровня эндотоксина (EU/ml) при курсовом
ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии, Me (25L;75U)
Показатели уровня эндотоксина в сыворотке крови мышей исследуемых
линий при двукратном холодовом воздействии варьировали, но статистически
значимо не изменялись (табл.1).
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
Balb/c
500
1/9 сут
1/21 сут
2/9 сут
2/21 сут
*
**
ИЛ-2
1/9 сут
1/21 сут
2/9 сут
2/21 сут
250
*
ИЛ-5
**
ИЛ-6
**
*
0
ИЛ-4
ИФН- 
-250
С57Bl/6
ИЛ-5
-50
7000
1/9 сут
1/21 сут
2/9 сут
2/21 сут
6000
ФНО-
*
ГМ-КСФ
*
1/9 сут
1/21 сут
2/9 сут
2/21 сут
5000
4000
%
*
0
*
C57Bl/6
50
%
*
%
%
Balb/c
3000
2000
ИФН-
1000
0
-100
1/9 сут 1/21 сут 2/9 сут 2/21 сут
-1000
*
1/9 сут 1/21 сут 2/9 сут 2/21 сут
Рис.7. Изменение уровня продукции цитокинов клетками селезенки мышей Balb/c и
C57Bl/6 при курсовом ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии.
Данные представлены в процентах по отношению к контрольной группе, которая
приравнена нулю.
1/9 – 9-е сут однократного ХВ
2/9 – 9-е сут двукратного ХВ
1/21 – 21-е сут однократного ХВ
2/21 – 21-е сут двукратного ХВ
Таким образом, выявленные при курсовом однократном и двукратном
холодовом воздействии, гистофизиологические изменения тонкой и толстой
кишки свидетельствуют о широком функциональном резерве по отношению
неблагоприятным факторам внешней среды, вследствие чего дизадаптивные
реакции не развиваются. Однако, в связи с отсутствием четких критериев
перехода адаптивных изменений в дизадаптивные, вопрос о положительном
или отрицательном влиянии холодового воздействия на гистофизиологическое
состояние тонкой и толстой кишки мышей сравниваемых линий остается
открытым.
Поэтому для решения вопроса о протекторном или дизадаптивном
эффекте холодового воздействия у мышей Balb/c и C57Bl/6 моделировали
острый язвенный колит на фоне холодового воздействия.
19
Сравнительная характеристика морфологических проявлений
экспериментального острого язвенного колита у мышей Balb/c и C57Bl/6
В работе использовали разработанную Okayasu et al. (1990) модель
острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия.
На 3-и и 5-ые сут у мышей Balb/c и C57Bl/6, получавших вместо питьевой
воды раствор декстрансульфата натрия, был жидкий стул 4-5 типа по
Бристольской классификации. В кашицеобразном кале темно-коричневого
цвета выявлялась примесь крови. При вскрытии брюшной полости толстая
кишка была с участками сужения и расширения, нечетко очерченными зонами
темно-красного цвета.
С целью выявления путей распространения и оценки механизмов
действия декстрансульфата, проводили исследование тонкой кишки,
мезентериальных лимфатических узлов и печени. При гистологическом
исследовании микропрепаратов, окрашенных толуидиновым синим, в просвете
тонкой кишки, строме ее ворсинок, в звездчатых макрофагах печени (клетках
Купфера), лимфатических сосудах, краевых, промежуточных и мозговых
синусах лимфатических узлов выявлялись метахроматически окрашенные
массы и гранулы декстрана.
При макроскопическом исследовании ободочной кишки у всех 10-ти
мышей Balb/c с острым язвенным колитом выявлены мелкие эрозии и очаги
гиперемии. На поверхности слизистой оболочки ободочной кишки у 9-ти из
10-ти мышей C57Bl/6 определялись обширные очаги гиперемии и язвы со
сгустками крови. У 6-ти из 10-ти мышей C57Bl/6 практически вся внутренняя
поверхность ободочной кишки была изъязвлена и дно язв было заполнено
сгустками крови.
При количественной оценке макроскопических изменений в слизистой
оболочке ободочной кишки у мышей сравниваемых линий оказалось, что
процесс более выражен у мышей C57Bl/6 (рис.8, табл.2). Показатель
относительной
площади
макроскопически
визуализируемых
патоморфологических изменений у мышей Balb/c составлял 0,087 мм2
(р=0,001), а у C57Bl/6 – 0,218 мм2 (р=0,03).
При микроскопическом исследовании, в слизистой оболочке ободочной
кишки у мышей обеих линий наблюдали изменения различной тяжести:
очаговые некрозы и эрозии слизистой оболочки, дистрофические и
десквамативные изменения колоноцитов, а в участках с сохраненной слизистой
оболочкой – увеличение размеров бокаловидных клеток и количества слизи на
ее поверхности. В подслизистом слое выявлено расширение просвета
лимфатических сосудов, отек и различной степени выраженности диффузная
воспалительная инфильтрация лимфоцитами, гистиоцитами и нейтрофилами.
По данным полуколичественной оценки с помощью модифицированной
нами шкалы S. Kitajima (2000), выраженность некротических, экссудативных и
воспалительных изменений, тяжесть процесса и его распространенность были
выше у мышей C57Bl/6 (табл.2).
20
Таким образом, по данным морфологического исследования у мышей
C57Bl/6, с преобладанием Тх1 типа иммунного ответа, по сравнению с мышами
Balb/c с преобладанием Тх2 типа, патоморфологические проявления острого
язвенного колита более выражены.
Механизмы развития декстран-индуцированного колита по данным L.A.
Dieleman et al. (1994) связаны с реакциями врожденного иммунитета, так как в
развитии воспаления при его воздействии, очевидно, ключевую роль играет
повреждение эпителия и активация макрофагов, которые фагоцитируют
частицы декстрансульфата. По сравнению с мышами Balb/c, большая
выраженность морфологических проявлений колита у мышей C57Bl/6
генотипически обусловлена преобладанием Тх1 типа иммунного ответа. Наши
данные о большей выраженности воспалительных изменений в толстой кишке у
мышей C57Bl/6, по сравнению с Balb/c, согласуются с литературными (Melgar
S. et al., 2005).
В нашем исследовании, в контрольной группе у мышей Balb/c, по
сравнению с C57Bl/6, было выявлено достоверно более высокое содержание
кортикостерона, который блокирует активацию транскрипционного фактора
NF-kB и, тем самым, ингибирует гены воспалительного и иммуного ответа.
Кроме того, нами показано, что у мышей Balb/c в толстой кишке более выражен
слизистый барьер, который оказывает протективный эффект, препятствуя
цитотоксическому действию декстрансульфата, вызывающего повреждение
эпителия (Bauer M.E. et al., 2001).
Сравнительная характеристика морфологические проявлений
экспериментального острого язвенного колита на фоне предварительного
курсового холодового воздействия у мышей Balb/c и C57Bl/6
При моделировании острого язвенного колита на 9-ые сут после
ежедневного однократного холодового воздействия, патологический процесс у
мышей Balb/c и C57Bl/6 был менее выраженным. Показатели относительной
площади макроскопических изменений в ободочной кишке при остром
язвенном колите на фоне предварительного холодового воздействия были
статистически значимо ниже, по сравнению с группой мышей, не
подвергавшихся холодовому воздействию (табл.2). Относительная площадь
очагов гиперемии и эрозий у мышей C57Bl/6 с колитом после холодового
воздействия была в 7,7, а у мышей Balb/c – в 3,2 раза ниже, чем у мышей с
колитом (рис.8). При сравнении показателей выраженности воспалительного
процесса при остром язвенном колите на фоне холодового воздействия у
мышей линий Balb/c и C57Bl/6 не было выявлено статистически значимых
различий по распространенности язв и глубине некрозов (рис.8). В связи с этим
можно утверждать, что предшествовавшее развитию колита холодовое
воздействие нивелировало различия в реакции слизистой оболочки мышей
сравниваемых линий и оказало протективный эффект.
21
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
0,35
*
*
ХВ+K Balb/c
К C57Bl/6
ХВ+К C57Bl/6
0,30
0,25
0,20
0,15
*
0,10
0,05
0,00
-0,05
К Balb/c
Рис.8. Относительная площадь (на 1мм2) макроскопически визуализируемых
изменений слизистой оболочки ободочной кишки у мышей Balb/c и C57Bl/6 при остром
язвенном колите без и после предварительного холодового воздействия.
Условные обозначения: К – язвенный колит; ХВ – холодовое воздействие
При полуколичественной оценке выраженности морфологических
изменений в ободочной кишке, по сравнению с группой животных без
холодового воздействия, у мышей Balb/c, при остром язвенном колите с
предварительным холодовым воздействием, не выявлено статистически
значимых различий по распространенности язв и глубине некрозов, но
выраженность отека подслизистого слоя была статистически значимо выше
(табл.2). По сравнению с мышами с острым язвенным колитом, в слизистой
оболочке мышей C57Bl/6 с колитом, моделированным после предварительного
холодового воздействия, были статистически значимо ниже показатели
распространенности язв, глубины некрозов и отека подслизистого слоя.
При сравнении показателей выраженности воспалительного процесса при
остром язвенном колите после предварительного холодового воздействия у
мышей линий Balb/c и C57Bl/6 не было выявлено статистически значимых
различий по распространенности язв, глубине некрозов. Показатель
выраженности отека подслизистого слоя был достоверно выше в ободочной
кишке у мышей C57Bl/6 (табл.2).
22
Таблица 2
Полуколичественная оценка выраженности морфологических проявлений
острого язвенного колита без и с предварительным холодовым
воздействием у мышей Balb/c и C57Bl/6, M±SE
Показатели микроскопической полуколичественной
Относительная
оценки изменений (баллы)
площадь
макроскопически
Отек и
визуализируемых Распространенность
Глубина
инфильтрация
изменений
язв
некрозов
подслизистого
(на 1мм2)
слоя
Группа наблюдений,
линии мышей
Колит
ХВ+колит
Balb/c
1
0,087±0,01
0,8±0,1
1,1±0,1
1,6±0,1
C57Bl/6
2
0,218±0,03
1,8±0,2
1,8±0,1
3,5±0,1
Balb/c
3
0,027±0,01
0,5±0,1
0,8±0,1
2,4±0,1
C57Bl/6
4
0,028±0,00
p1-2=0,00
p3-4=0,09
p1-3=0,02
p2-4=0,00
0,6±0,1
p1-2=0,00
p3-4=0,53
p1-3=0,29
p2-4=0,00
0,9±0,1
p1-2=0,00
p3-4=0,10
p1-3=0,06
p2-4=0,00
3,0±0,1
p1-2=0,00
p3-4=0,00
p1-3=0,00
p2-4=0,00
Порог доверительной
вероятности
Изменения состава просветной микрофлоры толстой кишки и
цитокинового профиля у мышей Balb/c и C57Bl/6 при остром язвенном
колите и колите после предварительного холодового воздействия
По результатам микробиологического исследования, количественные
показатели просветной микрофлоры у мышей обеих линий при остром
язвенном колите снижались, за исключением потенциально патогенного
E. fecium, уровень которого повышался у мышей C57Bl/6. Показатели
количественного состава микрофлоры в группе с острым язвенным колитом
после предварительного холодового воздействия у мышей обеих линий были
выше, чем в группе мышей с острым язвенным колитом без предварительного
холодового воздействия, но не достигали контрольных значений.
В цитокиновом профиле у мышей Balb/c с острым язвенным колитом
наблюдалось снижение уровня продукции и секреции клетками селезенки
ИФН-γ и ИЛ-4, а у мышей C57Bl/6 статистически значимых изменений уровня
цитокинов не наблюдалось. При остром язвенном колите на фоне холодового
воздействия, по сравнению с колитом без предварительного холодового
воздействия, у мышей Balb/c не выявлено изменений в уровне продукции
цитокинов клетками селезенки, а у C57Bl/6 был достоверно ниже уровень ИЛ-2
и ИФН-γ.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что
холодовое воздействие повышает функциональный резерв толстой кишки,
снижает чувствительность к бактериальному антигенному воздействию,
уменьшает выраженность воспалительного процесса.
23
Меньшая выраженность морфологических проявлений декстрансульфатиндуцированного колита после предварительного холодового воздействия
может быть обусловлена повышением при холодовом воздействии уровня
кортикостерона в сыворотке крови у мышей обеих линий. Кортикостерон, как
уже рассматривалось выше, оказывает иммуносупрессорное действие,
подавляет продукцию и секрецию провоспалительных цитокинов и ингибирует
экспрессию молекул адгезии и рецепторов к цитокинам (Bauer M. E. et al.,
2001). На местном уровне протективный эффект холодового воздействия
обусловлен гистофизиологическими адаптивными изменениями слизистой
оболочки кишечника, характеризующимися повышением количества МЭЛ и
лимфоцитов в составе клеточных элементов СПСО у мышей обеих линий.
Активация мукозальной иммунной системы, с одной стороны, обеспечивает
восстановление эпителиальной выстилки после повреждения, а с другой
стороны, снижает выраженность ответа на бактериальные антигены.
ВЫВОДЫ
1. В норме у мышей-самцов линии Balb/c и C57Bl/6 выявлены
внутривидовые гистофизиологические различия слизистой оболочки тонкой и
толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей и ободочной кишки у мышей
Balb\c выше число бокаловидных клеток, а в подвздошной – меньше клеток
Панета. Мукозальная иммунная система у мышей Balb\c характеризуется более
высокими показателями числа межэпителиальных лимфоцитов, а у C57Bl/6 –
числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой
оболочки.
Уровень кортикостерона в сыворотке крови у мышей Balb/c в 4,8 раза
выше, чем у C57Bl/6, что соотносится с более низкими показателями числа
митозов в криптах тощей кишки у мышей Balb/c.
В составе просветной микрофлоры толстой кишки у мышей Balb/c, по
сравнению с C57Bl/6, содержится большее число энтерококков E. fecium.
2. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое
воздействие является для мышей Balb/c и C57Bl/6 стрессорным и
сопровождается повышением содержания кортикостерона и изменением
баланса уровня цитокинов.
3. Курсовое ежедневное однократное холодовое воздействие вызывает у
мышей Balb/c и C57Bl/6 адаптивные гистофизиологические изменения
слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей
кишки у мышей Balb/c и C57Bl/6 снижается число бокаловидных клеток и
клеток Панета, а у мышей C57Bl/6 в подвздошной и ободочной кишке
увеличивается число энтероэндокринных клеток. Изменения мукозальной
иммунной системы у мышей обеих линий характеризуются увеличением числа
межэпителиальных лимфоцитов и содержания лимфоцитов в собственной
пластинке слизистой оболочки.
24
4. Курсовое ежедневное двукратное холодовое воздействие по
выраженности и направленности структурных изменений эпителиальной
выстилки тонкой и толстой кишки не отличается от однократного и не
вызывает развития дизадаптивных, альтеративных и воспалительных
изменений. Степень активации мукозальной иммунной системы при
двукратном холодовом воздействии более выражена, по сравнению с
однократным. Содержание лимфоцитов в собственной пластинке слизистой
оболочки тонкой кишки возрастает более чем в два, а толстой кишки – более
чем в пять раз у мышей обеих линий.
5. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое
воздействие у мышей Balb/c и C57Bl/6 оказывает положительный эффект на
состав микрофлоры толстой кишки, увеличивая количество энтеробактерий и
лактобактерий.
6. По сравнению с мышами Balb/c, у мышей C57Bl/6 морфологические
проявления острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом
натрия, более выражены. При остром язвенном колите количественные
показатели просветной микрофлоры у мышей обеих линий снижаются. Уровень
продукции и секреции цитокинов у мышей C57Bl/6 не изменяется, а у мышей
Balb/c снижается уровень ИФН-γ и ИЛ-4.
7. При остром язвенном колите после предварительного холодового
воздействия по сравнению с колитом без холодового воздействия, в ободочной
кишке у мышей Balb/c и C57Bl/6 снижается выраженность эрозивно-язвенного
и воспалительного процесса; повышаются показатели количественного состава
микрофлоры. У мышей Balb/c цитокиновый профиль не изменяется, а у мышей
C57Bl/6 снижается уровень продукции ИЛ-2 и ИФН-γ.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
Статьи, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК РФ:
1.Абдулаева С.О. Морфологическая характеристика слизистой оболочки
толстой кишки и микробиоты у мышей Balb\c при адаптации к холодовому
воздействию // Морфологические Ведомости. – 2011. – №2 - с. 9-13.
2.Трунова Г.В., Макарова О.В., Диатроптов М.Е., Богданова И.М.,
Михайлова Л.П., Абдулаева С.О. Морфофункциональная характеристика
иммунной системы мышей линии Balb/c и C57Bl/6 // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – №1 - с. 112-115.
3.Абдулаева С.О., Хомякова Т.И., Макарова О.В. Гистофизиология
тонкой и толстой кишки и уровень стероидных гормонов у мышей-самцов
Balb/c и C57Bl/6 // Морфологические ведомости. – 2012. – №1- с.6-11.
Материалы докладов на конференциях:
4.Абдулаева С.О. Характеристика морфологических изменений
слизистой оболочки толстой кишки и микробиома мышей Balb/c при
25
холодовом воздействии // Бюллетень Северного государственного
медицинского университета. – 2011. – №1, вып. XXVI. - с. 190–191.
5.Абдулаева С.О. Морфологические изменения слизистой оболочки
толстой кишки и микробиоценоза мышей Balb/c при холодовой нагрузке //
Материалы конференции «Ломоносов». – М., 2011. - С. 278.
6.Абдулаева С.О. Морфологические изменения слизистой оболочки
толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при холодовом воздействии //
Материалы конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии:
фундаментальные и прикладные аспекты». – М., 2011. - с. 2–4.
7.Абдулаева С.О., Хомякова Т.И. Морфофункциональная характеристика
толстой кишки и изменение микробиома у мышей Balb/c при холодовом
стрессе // Материалы конференции «Актуальные проблемы спортивной
морфологии и клинической анатомии». – М., 2010. - с. 36–38.
8.Абдулаева С.О., Краснова В.В., Трунова Г.В., Макарова О.В.
Межлинейные различия реакции иммунной системы мышей Balb/c и C57Bl/6
при холодовом воздействии // Морфология. – 2010. – №4, т. 137. - С. 12.
9.Абдулаева С.О., Макарова О.В., Добрынина М.Т., Хомякова Т.И.
Структурные изменения толстой кишки и уровень продукции цитокинов при
холодовом воздействии у мышей Balb/c // Медицинская иммунология. – 2011. –
№4–5, т. 13. - с. 303–304.
10.Макарова О.В., Хомякова Т.И., Абдулаева С.О., Данилевская М.М.,
Магомедова А.Д., Хомякова Ю.Н. Эффект холодового воздействия на
состояние микробиома мышей Balb/c и C57Bl/6 в модели острого
экспериментального колита // Материалы IV ежегодного всероссийского
конгресса по инфекционным болезням. – М., 2012. - С. 233.
11.Хомякова Т.И., Абдулаева С.О., Магомедова А.Д., Чертович Н.Ф.,
Хомякова Ю.Н., Макарова О.В. Изменение некоторых параметров микрофлоры
мышей C57Bl/6 при развитии острого и хронического экспериментального
колита // Материалы IV ежегодного всероссийского конгресса по
инфекционным болезням. – М., 2012. - с. 412-413.
12.Абдулаева С.О., Макарова О.В., Хомякова Т.И., Мхитаров В.А.,
Кирюхин
С.О.,
Добрынина
М.Т.
Сравнительное
исследование
морфологических, иммунологических и микробиологических проявлений
экспериментального острого язвенного колита у мышей Balb/c и C57Bl/6 //
Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. – М., 2012. - с 3-6.
13. Абдулаева С.О., Кирюхин С.О., Белоусова Т.А., Хомякова Т.И.,
Черников В.П., Макарова О.В. Морфологическая характеристика острого
язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, у мышей Balb/c
// Клиническая и экспериментальная морфология. – 2012. - №3 - с. 40-51.
Соискатель
С.О. Абдулаева
26