Рагулина Лариса Евгеньевна

на правах рукописи
УДК 577.322.4
РАГУЛИНА ЛАРИСА ЕВГЕНЬЕВНА
Процессы формирования β-структуры в фибриллярных и глобулярных белках
03.00.02. – биофизика
автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Москва 2007
Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН на
кафедре Молекулярной биофизики Факультета молекулярной и биологической физики
Московского физико-технического института (государственного университета)
Научные руководители:
доктор физико-математических наук, профессор
Владимир Гайевич Туманян
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор
Владимир Абрамович Намиот
доктор физико-математических наук
Нечипуренко Юрий Дмитриевич
Ведущая организация:
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино
Защита состоится 25 октября 2007 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета
К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл.,
г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.
Автореферат разослан «__» _______________ 2007 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат физико-математических наук
В.Е. Брагин
Общая характеристика работы
Введение. Актуальность проблемы.
В связи с акцентированием интересов в области молекулярной биофизики на
нанотехнологиях и наноматериалах важная роль отводится фибриллярным биополимерам
как носителям особых физических характеристик. Источником этих характеристик являются
физико-химические свойства макромолекул, которые определяются последовательностью их
химических единиц. В настоящее время в мире активно ведутся исследования свойств и
структур биополимеров, поскольку они являются основой новых уникальных материалов.
Знание структуры биополимера, понимание ее связи с последовательностью химических
символов и процессов фибриллогенеза позволит создавать искусственные волокна с
заданными свойствами.
Весьма перспективными биополимерами для получения новых материалов считаются
белки, образующие паутину. Паук выделяет до пяти типов нитей шелка для различных целей,
но особый интерес представляет основная нить паутины, поскольку именно она обладает
уникальными свойствами. Например, ее прочность более, чем в три раза превышает
прочность кевлара (синтетического волокна, соперничающего со сталью). Кроме того,
волокна паучьего шелка обладают высокой биосовместимостью с организмом человека, что
открывает большие возможности для использования их в медицине.
Получать нить паутины в промышленных масштабах подобно шелку шелкопряда
невозможно из-за биологических особенностей пауков, но такую возможность может
предоставить генная инженерия, хотя здесь тоже имеются свои трудности. Гены белков
паутины очень длинны, как и сами белки, а потому процесс их воспроизведения сложен и
дорог.
В связи с этим встает задача упрощения белковой цепи и конструирования
искусственного гена, а для этого необходимо знать характерные особенности таких цепей.
Фибрилла основной нити паука состоит из белков двух типов – спидроинов 1 и 2. Хотя
исследованию структуры и физико-химических свойств нитей паутины посвящено
достаточно много работ, а ее механические свойства изучены достаточно хорошо, к
настоящему
времени
известно
всего
несколько
полных
аминокислотных
последовательностей белков шелка пауков. Немногое известно и о структуре фибрилл,
образующих паутину. Это связано с тем, что экспериментальные методы исследования
структуры фибриллярных белков, такие как ЯМР, рентгенография и другие, не дают полного
представления об их атомном строении. На данный момент известно, что структуры
одиночных макромолекул фибриллярных белков, в том числе и спидроинов, изменяются в
3
процессе фибриллогенеза. Установлено, что на заключительной стадии формирования белки
основной
нити
паутины
содержат
β-структуру,
но
не
известно,
какие
части
последовательности их образуют; так же не известно строение тех частей белка, которые не
свернуты в β-структуру.
На сегодняшний день достаточно хорошо умеют предсказывать вторичную структуру
белков по их аминокислотной последовательности статистическими методами. Но нет
достаточно надежного метода расчета третичной структуры и, в частности, β-листов. В связи
с этим развитие подходов к расчету пространственной структуры белков, в том числе и
спидроинов, по их аминокислотным последовательностям является важной прикладной
задачей биоинформатики.
Цель и задачи исследования.
Главной
целью
проведённой
работы
было
установление
связей
между
последовательностью аминокислот в белках основной нити паутины – спидроинах первого и
второго типов - и особенностями формирования их пространственных структур. В задачи
работы входило:
•
анализ
локальных
и
нелокальных
особенностей
последовательности
аминокислот в белках основной нити паутины;
•
проведение Фурье-анализа последовательностей спидроина первого и второго
типов для поиска тех элементов аминокислотных последовательностей,
которые связаны с генезисом структур и возникновением необычных физикохимических свойств паутины;
•
предсказание вторичной структуры спидроинов 1 и 2 по их аминокислотной
последовательности;
•
разработка нового метода расчета антипараллельных β-структур в белках
различных типов по их аминокислотной последовательности и его применение
к белкам паутины;
•
экспериментальный анализ мономолекулярных растворов спидроинов и сухих
пленок методами ИК- и КД-спектроскопии.
4
Научная новизна.
Впервые
установлена
полная
картина
распределения
периодичностей
в
последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов, принадлежащих
паукам различных видов.
Впервые показано, что предсказываемые по последовательности аминокислот
вторичные структуры содержат очень мало участков β-структуры. В основном они
представляют собой сочетание α-спиралей и левых спиралей типа поли-l-пролин II.
Экспериментальное исследование водных растворов спидроина 1 и его генно-инженерных
аналогов подтвердило результаты проведенного предсказания. Оно позволило также сделать
вывод, что на последнем этапе фибриллогенеза в спидроинах происходит переход: левая
спираль типа поли-l-пролин II – β-структура.
Выделены
последовательности
аминокислот,
отражающие
основные
черты
периодичностей спидроинов 1 и 2. Соответствующие формулы:
•
(F)n – для спидроина 1;
•
ABA CA [D B CD A A][ D BCD E E ] DDB – для спидроина 2.
Показано, что в спидроинах первого и второго типов наблюдаются одинаковые
периоды – это 2 и 14. Такие периоды характерны для
распределения аминокислот на
участках β-структуры. По-видимому именно аминокислоты, образующие эту периодичность,
ответственны за образование β-слоев в паутине.
Периодичности распределения аминокислот, определяющие этапы формирования
индивидуальных пространственных структур белков-спидроинов, различны и не свойственны
таковым для β-структур. Это и определяет существование
квазиглобулярных этапов в
фибриллогенезе паутины.
Построена модель процессинга белков паутины на разных этапах ее формирования.
Практическое значение работы.
Полученные в результате исследований аминокислотных последовательностей
структурные формулы спидроинов 1 и 2, лежат в основе отбора последовательностей для
синтеза спидроино-подобных белков с заданными свойствами генно-инженерными методами.
Это позволит получать искусственные волокна шелка паука в количестве, необходимом для
получения новых материалов с уникальными свойствами. Использовать такой материал
можно будет в различных сферах деятельности человека, в том числе и в области медицины.
5
Разработанный метод расчета антипараллельной β-структуры может быть применен
для определения пространственной структуры белков, топологию которых сложно или
невозможно установить с помощью известных экспериментальных методов.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертации были представлены на XLV научной конференции
МФТИ (2002 г.), на Международной конференции по биоинформатике регуляции и
структуры генома (BGRS’02, Новосибирск), на Международной московской конференции по
вычислительной молекулярной биологии (MCCMB’03), на международной конференции
BGRS (Новосибирск , 2004 г.), на XLIV научной конференции МФТИ (2006 г.).
По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе две
статьи в реферируемых журналах.
Объём и структура диссертации.
Диссертация изложена на ... страницах, иллюстрирована ... рисунками и содержит ...
таблиц, список литературы включает ... ссылку. Диссертация состоит из введения, шести
глав, включая обзор литературы, выводов, списка цитированной литературы и приложения.
Краткое содержание работы.
Введение
Введение содержит обоснование актуальности темы диссертации, ее научной новизны
и практической значимости, приведены положения, выносимые на защиту.
Первая глава. Обзор литературы.
В обзоре литературы рассматриваются:
-
физико-химические свойства основной нити паутины;
-
структуры волокон шелка паука и составляющих их белков;
-
методы предсказания β-структуры в белках .
Различные типы паутины обладают необычайными свойствами. Например, основная
нить паутины имеет прочность, превышающую прочность стали, и способность сильно
сжиматься при большой влажности, а липкая нить обладает высокой растяжимостью,
превосходящей растяжимость резины.
Понимание строения шелка пауков приведет к
созданию новых искусственных материалов с заданными свойствами.
6
Работы по исследованию пространственной структуры белков шелка пауков в
основном относятся к белкам, образующим основную нить паутины, обладающей высокой
прочностью. К сожалению, экспериментальные методы исследования структуры белков
такие,
как
ЯМР,
рентгенография
и
другие,
не
дают
значительных
результатов.
Предполагается, что в белках, находящихся в фибриллах, присутствует β-структура,
образованная аланиновыми блоками, остальная структура неизвестна. Тем не менее, хотя
короткие участки структур спидроинов первого и второго типов, встроенные в простые
полимеры, а так же структуры образованных из них фибрилл и пленок исследуются весьма
интенсивно, до сих пор представления о пространственной структуре белков основной нити
паутины достаточно туманны. Процесс фибриллогенеза паутины очень сложен, а структуры
входящих в нее белков претерпевают сильные изменения с момента их выделения в
прядильную железу до момента выхода готового волокна.
В обзоре литературы подробно анализируются также работы, связанные с
предсказанием
структур,
типа
β-лист.
Такая
структура
стабилизируется
дальними
взаимодействиями, а точность их предсказания невелика – примерно 30 % верных
предсказаний.
Делается вывод о необходимости развития новых подходов к расчету и анализу βструктур в фибриллярных и глобулярных белках.
Вторая глава. Материалы и методы.
Эта глава содержит описание методов анализа аминокислотных последовательностей
спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов и их вторичных структур.
Также приводится описание инструментов, использованных для разработки метода расчета
антипараллельной β-структуры в белках по их аминокислотной последовательности.
Выборка белков и методы ее анализа.
Создана выборка аминокислотных последовательностей спидроинов первого
и
второго типов из пауков различных видов из базы данных NCBI и обоснован способ их
выравнивания.
Подробно описан метод поиска периодических закономерностей в распределении
аминокислот полипептидной цепи
SymFour, разработанный В.Ю. Макеевым и В.Г.
Туманяном. Метод позволяет легко интерпретировать результаты, дает возможность выбора
различных численных представлений в любых символьных последовательностях и
7
возможность поиска в коротких последовательностях периодичностей, повторяющихся на
длине последовательности небольшое число раз.
Для более полного понимания картины распределения периодов по длине
последовательностей была разработана и применена методика Фурье-сканирования с
использованием инструмента SymFour. Результаты методики позволяют достаточно точно
определять большие периоды и характер их распределения по полипептидной цепи.
Программы
для
предсказания
вторичной
структуры
белков
по
их
аминокислотной последовательности.
Здесь достаточно подробно описан статистический метод предсказания вторичной
структуры белка по его аминокислотной последовательности OLIGON. Этот инструмент
разработан в нашей лаборатории Власовым П.К. В этой главе также перечислены другие
методы, применявшиеся для предсказания вторичной структуры спидроинов первого
и
второго типов из пауков различных видов по их аминокислотным последовательностям.
Выбор инструментов для разработки нового метода расчета антипараллельной βструктуры в белках.
Обоснован выбор поля, метода учета воды и стартовых структур. Это важно при
построении
и
оптимизации
по
энергии
антипараллельной
β-структуры
в
белках.
Моделирование проведено в среде TINKER 4.2.
Выбор поля и метода учета воды существенен для молекулярного моделирования, так
как от параметров поля и водного континуума сильно зависит энергия взаимодействия
атомов главной цепи. Проведена серия экспериментов по молекулярному моделированию
нескольких небольших белков с известной структурой с целью выявления оптимальных
параметров среды. Выбрано приближение для корректных расчетов как α-спирали так и
антипараллельной β-структуры: поле OPLS-UA и неявный метод учета воды STILL. В этом
приближении
удалось
построить
модель
для
небольшого
белка,
для
которого
среднеквадратичное отклонение полученных координат атомов основной цепи от координат
атомов, установленных экспериментально, составило всего 1,26 Å.
Для молекулярного моделирования выбор начального приближения координат атомов
основной цепи так же важен, как и выбор параметров среды. В качестве модели
антипараллельной β-структуры мы использовали антипараллельный β-лист, состоящий из
трех тяжей, конформационные углы φ, ψ и ω которого рассчитали с помощью метода
молекулярного моделирования. Использованная нами конструкция позволяет сильнее
стабилизировать
центральный
тяж
и,
таким
образом,
точнее
находить
участки
8
антипараллельной β-структуры в белках, чем при использовании в качестве начального
приближения модели β-шпильки. При формировании начального приближения конформации
атомов основной цепи была применена предоставленная Филатовым И.В. редуцированная
библиотека конформаций боковых радикалов.
Третья глава. Анализ аминокислотной последовательности спидроинов первого
и второго типов пауков различных видов.
Представленные в этой Главе результаты относятся к изучению регулярных структур,
образуемых в белковых цепях различными наборами аминокислотных остатков.
Выравнивание аминокислотных последовательностей спидроинов. Сходства и
различия.
С помощью анализа аминокислотных последовательностей из различных белковспидроинов первого и второго типов удалось выявить ряд особенностей, характерных как для
каждого из типов в отдельности, так и общих для обоих типов.
Основная часть полипептидной цепи любого из белков - спидроинов имеет большую
длину (более 3000 аминокислотных остатков). Она расположена между небольшими
(примерно по 60 аминокислотных остатков) нерегулярными N- и C-концевыми участками.
Выравнивание этих частей позволило выявить наличие характерных сочетаний аминокислот,
которые повторяются большое число раз (Рис. 1).
AAAAAA GPG GY GPG QQ GPG GPG AAAAAAA
AAAAAAAA GPG QQ GPG GY GPG QQ GPG GY GPG QQ GPS GPG SAAAAAAA
Рис. 1 Пример участков последовательности спидроина 1-го типа.
Характерной чертой последовательностей аминокислот основных частей спидроинов
обоих типов является сочетание полиаланиновых блоков с участками, богатыми глицинами
(Рис. 1). Аминокислотный состав спидроинов практически одинаков, за исключением
отсутствия пролина в спидроинах первого типа, а также лейцина в спидроинах второго типа
(таблица 1).
9
Таблица 1а. Аминокислотный состав спидроинов первого типа из пауков различных видов.
Вид
Nephila madagascariensis
Nephila clavipes
Nephila_senegalensis
Argiope aurantia
Argiope trifasciata
Latrodectus geometricus
Latrodectus hesperus
Tetragnata_kaurensis
Araneus uemora
Аминокислотный состав, %
A
29
29
32
30
29
33
34
30
28
G
46
47
46
46
45
46
46
43
43
V
1
1
2
0
0
0
0
0
2
L
3
5
4
4
3
0
0
5
3
I
0
0
1
0
0
0
0
0
0
N
0
0
0
0
0
0
0
0
0
D
0
0
0
0
0
0
0
0
0
E
0
0
0
1
1
0
0
0
0
Q
10
10
8
10
11
12
12
14
9
K
0
0
0
0
0
0
0
0
0
R
1
2
2
2
1
2
2
0
1
S
4
3
2
3
5
2
0
5
6
T
1
0
0
0
0
0
0
0
0
C
0
0
0
0
0
0
0
0
0
M
0
0
0
0
0
0
0
0
0
F
0
0
0
1
0
0
0
0
1
Y
5
3
4
4
4
5
5
2
4
W
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
H
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 1б. Аминокислотный состав спидроинов второго типа из пауков различных видов.
Вид
Nephila madagascariensis
Nephila clavipes
Nephila_senegalensis
Argiope aurantia
Argiope trifasciata
Latrodectus geometricus
Latrodectus hesperus
Araneus bicentenarius
Gasteracantha mammosa
Аминокислотный состав, %
A
23
22
29
23
20
29
32
23
20
G
35
35
26
31
38
35
36
35
38
V
0
0
2
1
0
0
1
1
1
L
0
0
2
1
0
0
0
0
0
I
0
0
0
0
0
0
0
0
0
N
0
0
1
0
0
1
0
0
0
D
0
0
1
0
0
0
0
0
0
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Q
13
13
6
19
15
5
7
17
14
K
0
0
0
0
0
0
0
0
0
R
0
0
2
1
1
1
2
0
2
S
7
8
13
6
7
11
6
4
6
T
0
0
1
0
0
0
1
0
0
C
0
0
0
0
0
0
0
0
0
M
0
0
0
0
0
0
0
0
0
F
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Y
5
5
4
4
4
5
5
6
5
W
0
0
0
0
0
0
0
0
0
P
17
15
14
14
15
10
9
14
14
Анализ аминокислотных последовательностей спидроинов показал наличие в них больших
периодов. Для более подробного их изучения и установления полноты картины
периодичностей был использован Фурье-анализ.
Фурье-анализ аминокислотных последовательностей спидроинов.
Был выполнен Фурье-анализ всех отобранных последовательностей спидроинов
первого и второго типов (длиной более 200 аминокислотных остатков) из пауков различных
видов. Поскольку длины некоторых из этих аминокислотных последовательностей не
превышают 300, то мы рассматривали периоды от 2 до 100.
Фурье-анализ последовательностей был выполнен как для всех аминокислот,
входящих в последовательность, так и отдельно для каждой. Результаты занесены в таблицы
и отражены на графиках, приведенных в третьей главе диссертации.
Сравнение Фурье-спектров аминокислотных последовательностей спидроинов типа 1
из пауков различных видов показало, что большинство из них имеют спектральные
10
H
0
0
0
0
0
0
0
0
0
максимумы на периодах 2, 7, 11, 14, 39-40. Периоды, имеющие максимальную спектральную
мощность, лежат в интервале 18 – 40 (Рис. 2). Эти периоды соответствуют средней длине
последовательности между соседними полиаланиновыми блоками.
80
Спектральная мощность
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
120
Периоды
Рис.2 Усредненный Фурье-спектр всех обработанных аминокислотных
последовательностей спидроинов 1 из пауков различных видов.
Анализируя Фурье-спектры последовательностей спидроинов 1 из пауков различных
видов, рассчитанные для отдельных аминокислот, можно сделать выводы о том, какие
периоды характерны для той или иной аминокислоты.
Сравнение Фурье-спектров аминокислотных последовательностей спидроинов 2 из
пауков различных видов показало, что большинство из них имеет спектральные максимумы
на периодах 2, 10, 14, 21, 27. Периоды, имеющие максимальную спектральную мощность,
лежат в интервале 22 – 46 (Рис.3). Эти периоды, как и для спидроина 1, связаны со средним
расстоянием
между
соседними
полиаланиновыми
блоками
вдоль
аминокислотной
последовательности. Средняя длина участка аминокислотной последовательности между
полиаланиновыми блоками в спироине 2 больше, чем в спидроине 1.
11
300
Спектральная мощность
250
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100
120
Периоды
Рис.3 Усредненный Фурье-спектр всех обработанных аминокислотных
последовательностей спидроинов 2 из пауков различных видов.
Общими же для большинства аминокислотных последовательностей спидроинов
первого и второго типа пауков различных видов являются периоды два и четырнадцать.
Теоретическое конструирование рекомбинантных аналогов спидроинов.
Возможности современной генной инженерии позволяют получать протяженные
последовательности рекомбинантных белков исключительно за счет полимеризации более
коротких олигопептидов, которые в дальнейшем мы будем называть «мономерами».
Существуют технологические ограничения как на длину каждого мономера, так и на
количество различных типов мономеров. В нашем случае решено было использовать не более
четырех типов мономеров, причем длина мономера каждого из типов не должна превышать
169 аминокислот. Нашей целью являлось создание модельной последовательности (из
мономеров, удовлетворяющих вышеуказанным требованиям), сохраняющей возможно более
близкую к природной последовательности периодическую структуру.
На сегодняшний день известны только две полные последовательности аминокислот
спидроина 1 и спидроина 2 из паука Latrodectus hesperus. Еще известна примерно половина
аминокислотной последовательности спидроина 2 из паука Nephila madagascariensis. Именно
12
эти последовательности мы использовали для создания последовательности искусственного
белка.
Основываясь на данных, полученных в предыдущих разделах, из полипептидных
цепей спидроинов были выделены большие участки последовательности, которые
повторяются на всей длине цепи. Эти участки и стали искомыми мономерами. Они были
выстроены
таким
последовательность.
образом,
Из
чтобы
сравнения
как
можно
ближе
Фурье-спектров
воспроизвести
искусственной
и
исходную
природной
последовательностей следует высокое сходство их основных черт (Рис. 4).
1,80E+03
Спектральная мощность
1,60E+03
1,40E+03
1,20E+03
1,00E+03
8,00E+02
6,00E+02
4,00E+02
2,00E+02
0,00E+00
0
50
100
150
200
250
Периоды
Рис. 4 Фурье-спектры аминокислотных последовательностей искусственного и
натурального спидроинов 2.
С учетом периодичностей разных частей макромолекул и консервативности
последовательностей N- и
C-концевых участков спидроинов мы получили оптимальные
формулы для рекомбинантных белков основной нити паутины. Например, формула аналога
спидроина 2 N.madagascariensis выглядит следующим образом: ABA CA [D B CD A A][ D
BCD E E ] DDB.
13
Четвёртая глава. Предсказание вторичных структур.
Предсказание вторичной структуры было проведено тремя независимыми способами:
І, с использованием программы NNPREDICT (www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.htm), ІІ,
с помощью сервера JPRED (www.compbio.dundee.ac.uk/~www-jpred/), ІІІ, с использованием
программы OLIGON.
Предсказание вторичной структуры спидроинов.
С помощью программы
NNPREDICT (www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.htm)
получены следующие результаты:
•
В последовательностях аминокислот QGYG, AGRGGLGA, RGEL спидроинов 1
остатки L, E, Q и Y находятся в форме β-структуры, а все аланины в полиаланиновых
блоках – в α-спиральной конформации.
•
В регулярной части белков из группы спидроинов 2 не встретилось аминокислот,
находящихся в β-структурной форме, предсказывается только α-спираль для
полиаланиновых блоков.
•
В С-концевых участках спидроинов обоих типов предсказываются участки α-спирали
и левой спирали типа поли-l-пролин II, есть даже довольно длинные участки с
предсказанной структурой.
Применение
программы
OLIGON,
разработанной
в
нашей
лаборатории,
к
аминокислотным последовательностям спидроинов дает следующие результаты:
•
Все аланины в последовательностях спидроинов 1, кроме одного последнего, в
полиаланиновых блоках находятся в α-спиральной конформации, а все пролины - в
форме левой спирали типа поли-l-пролин ІІ.
•
В последовательностях спидроина II встречаются такие сочетания аминокислот:
QGPS, GYGP, PGQQ – где S, P, Y и Q находятся в конформации левой спирали типа
поли-l-пролин ІІ; GYGQ, где Y имеет β-структурную конформацию, и PRQQ, где P и
Q находятся в конформации левой спирали типа поли-l-пролин ІІ, а
R имеет α-
спиральную конформацию.
•
В С-концевых участках спидроинов есть довольно длинные (18 аминокислотных
остатков) фрагменты с α-спиралями и левыми спиралями типа поли-l-пролин II.
Предсказание вторичной структуры по последовательности аминокислот для белков
спидроин 1 и спидроин 2 из пауков разных видов, сделанное с помощью сервера JPRED
14
( www.compbio.dundee.ac.uk/~www-jpred/ ) дает сведения о регулярных вторичных структурах
для концевых частей последовательностей.
Все методы предсказания вторичной структуры белков по аминокислотной
последовательности показывают, что полиаланиновые блоки должны были бы находиться в
α-спиральной конформации, если бы белок был мономолекулярным. В концевых частях
последовательностей
есть
похожие
друг
на
друга
участки,
структура
которых
предсказывается всеми тремя методами как одинаковая.
Экспериментальные исследования.
Теоретический анализ последовательностей белков паутины показал, что βструктурная конформация не характерна для последовательностей тех аминокислот, которые
свойственны одиночным полипептидным цепям спидроинов двух рассмотренных типов.
Нашей задачей было понять, являются ли реальными и образуются ли хотя бы на какомнибудь из этапов формирования паутины те вторичные структуры, которые предсказаны для
последовательностей аминокислот рекомбинантных белков, аналогичных спидроинам двух
разных типов.
Мы провели анализ конформационного состояния двух рекомбинантных белкованалогов спидроинов 1 и 2 методом кругового дихроизма (КД), с использованием
кинетических и термодинамических подходов.
Спектры КД снимали в зависимости от концентрации белков, чтобы найти условия
анализа внутримолекулярных локальных конформационных состояний. С помощью метода
кругового дихроизма (КД) были исследованы растворы рекомбинантных белков 1F9 и 2E12 в
низких концентрациях и подвергнутых различным физическим воздействиям.
Раствор белка в концентрации 1 мг/мл
разбавляли до различных концентраций,
спектры КД снимали на приборе Jasco J718 (Рис. 5 и Рис. 6 ). Из анализа полученных
спектров следует, что набор конформаций в макромолекулах меняется в зависимости от
концентрации: при концентрациях 0,1 мг/мл и 1 мг/мл наблюдается спектр, характерный для
молекул со следующей вторичной структурой: α-спираль (~15%), левая спираль типа поли-lпролин II (в дальнейшем РРII) (~20%) и β-структура (~10%); при концентрации 0,5 мг/мл
макромолекулы приобретают в основном β-структурную конформацию с примесью левой
спирали типа РРII и α-спирали. Таким образом, по крайней мере в нескольких средах, мы
сумели показать, что состояние вторичных структур анализируемых рекомбинантных белков
в растворе соответствует тому, что предсказано по последовательности. Изменение
15
содержания вторичных структур при изменениях концентрации подтверждает представление
о белках паутины в растворе как о нативно-развернутых.
С целью моделирования процессов, приводящих к фибриллообразованию из молекул
белка, находящихся в растворенном состоянии, мы провели изучение влияния механического
встряхивания и обработки ультразвуком на конформационное состояние макромолекул.
Встряхивание
раствора
белка
на
вортексе
является
аналогом
деформаций
гидродинамического сдвига, происходящих в прядильной железе паука в процессе
формирования нити. Для этого снимали спектры КД растворов рекомбинантных спидроинов
c концентрациями 0,1; 0,5 и 1,0 мг/мл до и после встряхивания на вортексе в течение 10
минут (Рис. 6) или обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10 минут.
После встряхивания КД-спектр раствора рекомбинантного белка существенно изменяется.
Появление спектрального минимума на длине волны
1000
Mol. Ellip.
0
-1000
-2000
-3000
185
200
220
240
250
Wavelength, [nm]
Линии: cплошная - 0.1 мг/мл; прерывистая - 0.5 мг/мл; пунктир - 1 мг/мл
Рис. 5 Спектры кругового дихроизма рекомбинантного белка 1F9 в различных
концентрациях
190 нм и максимума - на 220 нм свидетельствуют о том, что значительная часть молекулы
рекомбинантного белка в растворе с концентрацией 0,1 мг/мл принимает вторичную
структуру типа РР II; в растворе с концентрацией 0,5 мг/мл – смесь β-структуры и РРII; при
16
концентрации 1 мг/мл наблюдается переход большей части молекул в β-структурную
конформацию. При этом сохраняются изобестическая точка и ее положение. Такое поведение
кривых характерно для систем, в которых все переходы происходят между двумя
состояниями. В данном случае промежуточным состоянием является левая спираль типа РРII.
Таким образом, можно говорить о переходе из левой спирали типа РРII в β-структуру
2000
Mol. Ellip.
0
-2000
-4000
-5000
185
200
220
Wavelength[nm]
240
250
Линии: cплошная - 0.1 мг/мл; прерывистая - 0.5 мг/мл; пунктир - 1 мг/мл
Рис. 6 Спектры кругового дихроизма раствора белка 1F9 в различных концентрациях
после встряхивания
Известно, что топология карт Рамачандрана с нанесенными на них областями αспирали, β-структуры и структуры типа поли-l-пролин II такова, что для перехода из αспирали в левую спираль типа РРII достаточно изменения только одного угла ψ.
Аналогично переходы между РРII и β-структурой сводятся к изменению единственного
угла φ. Таким образом, и по этой причине естественно предположить, что вторичная
структура промежуточного состояния – это левая спираль типа РРII.
Похожая картина, с различиями, определяемыми особенностями последовательности
аминокислот, наблюдалась и для второго из изученных рекомбинантных белков – белка
2Е12, исследования которого подробно описаны в данной главе диссертации.
Хорошо известно, что конформация типа РРII стабилизируется взаимодействиями с
водой. А это означает, что именно дегидратация остова полипептидной цепи коррелирует с
17
процессом перехода из конформации типа PP II в конформацию β-структур. Наши
эксперименты показывают, что процессы формирования нативно-подобной структуры белков
паутины
как
при
внутримолекулярных
процессах,
так
и
при
межмолекулярных
взаимодействиях, требуют дегидратации остова полипептидной цепи.
Сам переход инициируется следующими обстоятельствами: изменением концентрации
белка, изменением гидродинамических условий системы, в которой происходит процесс
формообразования, и изменением физико-химических условий среды. Этим он похож на те
конформационные изменения, которые имеют место при образовании фиброина шелка
Bombix mori, амилоида или структур, возникающих после конформационного перехода
нормального приона PrPc в патогенный PrPse и дальнейшей организации нерастворимых
фибрилл.
Таким образом, спидроины могут быть отнесены к так называемым нативноразвернутым белкам, т.е. к таким белкам, которые в нативном состоянии не обладают
уникальной глобулярной структурой, но приобретают ее при различных межмолекулярных
взаимодействиях. Многочисленные экспериментальные данные показывают, что βструктуры образуются в конце процессинга в железе паутины.
Глава пятая. Предсказание антипараллельной β – структуры в белках по их
аминокислотной последовательности.
В этой главе изложен метод расчета антипараллельной β-структуры в белках по их
аминокислотным последовательностям. Метод основан на предположении, что фрагмент
полипептидной цепи принимает ту конформацию, в которой имеет минимальную энергию.
Последовательность действий, определяемая методом, такова:
1. В качестве начального приближения строится модель β-листа из трех
полиаланиновых цепей с глицинами на поворотах (Рис. 7а).
2. В среднюю цепь β-листа последовательно включаются тетрапептиды из
полипептидной цепи аминокислот анализируемого белка (Рис. 7б и 7в).
3. Минимизируется энергия β-листа, при использовании в качестве начального
приближения координат атомов полиаланиновых участков главной цепи и
конформации боковых радикалов из редуцированной библиотеки конформеров.
4. Вычисляется энергия α-спирали для последовательности вытянутого β-листа.
5. Энергия β-листа сравнивается с таковой для последовательности β-листа,
вытянутой в α-спираль.
18
Рис. 7а Модель β-листа из трех тяжей.
Рис. 7в Модель β-листа, где
последовательность среднего тяжа заменена
на один из тетрапептидов (PYGP).
2
4 ……..
PYGPGASALVQALLEVVS
1 3
……
Рис. 7б Цепь анализируемого белка, из которой последовательно выбираются
тетрапептиды.
Описанной
процедуре
подвергают
все
последовательные
тетрапептиды
полипептидной цепи белка.
Участки
последовательности,
которые
склонны
к
образованию
β-структуры,
определяются после нормировки энергии антипараллельной β-структуры на энергию αспирали. Проводится проверка качества предсказания мест расположения участков βструктуры в белке. Процент верно рассчитанных участков оказался достаточно высоким
(таблица 2).
Следующий этап расчетов проделывается для того, чтобы находить дальние контакты
между β-структурными участками полипептидной цепи. Необходимо установить пептидные
группы
тех
взаимодействующих
аминокислотных
остатков,
которые
формируют
антипараллельную β-структуру. Для достижения этого мы модифицируем модель из Рис. 7а:
в центральную и третью нить последовательно помещаются тетрапептиды из реальной
полипептидной цепи белка. Таким образом, модель предполагает движение окном в четыре
19
название
длина,
белка
а.о.
Q2
Q3
1edm B
38 0,9
0,77
1fre
38 0,8
0,47
1tpn
49 0,71
0,73
1vie
59 0,58
0,72
1apq
52
1.00 0,7
1cro
66 0,5
0,51
1ctf
68 0,83
0,6
1erg
69 0,4
0,58
1pdg A
86 0,6
0,6
1pft
49 0,92
0,57
1tgx A
59 0,63
0,52
1wap A
67 0,56
0,72
1wkt
87 0,76
0,68
2ayh
214 0,5
0,57
2nbt A
59 0,57
0,54
2xbd
86 0,7
0,66
betanova
19 0,66
0,65
Таблица 2. Процент верно предсказанных β-структурных участков в различных белках.
аминокислоты вдоль всей цепи и минимизацию энергии получаемой трехнитевой структуры.
Реально для уменьшения времени расчетов достаточно испытывать только те тетрапептиды,
которые на первом этапе анализа предсказаны как β-структурные. Оказалось, что при такой
стратегии время расчетов меньше на порядок при небольшой потере точности.
Проведение описанных процедур дает возможность (после соответствующих
минимизации и нормировки на α-спираль) понять, какие участки цепи анализируемого белка
взаимодействуют друг с другом.
Для проверки метода была взята выборка белков из работы, авторы которой
предсказывали антипараллельную и параллельную β-структуры одним из статистических
методов. Сравнение процента корректно рассчитанных участков нашим методом и
статистическим, свидетельствует в пользу нашего метода – в среднем: 31,3 % из
статистического метода против 45,5% по методу молекулярного моделирования.
Глава шестая. Обсуждение результатов.
Проведенный анализ распределения аминокислот в последовательностях спидроинов
позволил выявить черты сходства и отличия между спидроинами первого и второго типов из
пауков различных видов. Интересно, что между спидроинами разных типов из пауков одного
вида наблюдается больше сходства, чем между спидроинами одного типа из пауков разных
20
видов. Это совершенно не характерно для большинства глобулярных белков. Выявление
характерных аминокислотных мотивов и особенностей распределения аминокислот по
последовательности – это необходимые шаги, ведущие к пониманию пространственной
структуры белков паутины, а значит и к получению их искусственных аналогов.
В
нашей
аминокислотных
работе
мотивов
наиболее
по
полную
картину
распределения
спидроинов
последовательностям
дал
характерных
метод
Фурье-
сканирования. Примененная методика позволила выделить как большие, так и малые
периоды и их распределение по длине полипептидной цепи. Эти исследования позволили
создать искусственные аналоги спидроинов первого и второго типов из разных пауков.
Анализируя результаты проведенного предсказания вторичной структуры спидроинов
первого
и
второго
типов
из
пауков
различных
видов
по
их
аминокислотной
последовательности, пришлось заключить, что в одиночной полипептидной цепи белков
паутины
должны
возникать
α-спирали
и
левые
спирали
типа
поли-l-пролин
II.
Экспериментальные исследования вторичных структур спидроинов 1 и 2 показали
правильность проведенного теоретического анализа и подтвердили правильность вывода о
нативно-развернутом состоянии одиночных молекул спидроинов обоих типов. Это позволило
объяснить последовательность конформационных изменений при генезисе паутины на основе
механизма
межмолекулярных
взаимодействий
между
нативно-развернутыми
в
мономолекулярном состоянии макромолекулами.
Приведем несколько показательных экспериментальных фактов. Проведенные нами
исследования структуры молекул спидроина 1 и его генно-инженерного аналога в растворе,
показывают наличие α-спиралей и левых спиралей типа поли-l-пролин II. Образование βструктуры происходило после встряхивании раствора. Таким образом, по крайней времени
одна из стадий
термодинамически
процесса фибриллогенеза молекул паутины состоит в организации
устойчивой
квазиглобулярной
формы
одиночных
макромолекул
спидроинов. На этой стадии структура молекулы содержит α-спирали и левые спирали типа
поли-l-пролин II. В фибриллярной стадии происходит образование β-структуры. Эти данные
согласуются и с процессом прядения паутины.
Разработанный нами новый метод предсказания антипараллельной β-структуры в
белках по их аминокислотным последовательностям основан не на статистическом анализе, а
на применении физических принципов формирования пространственных структур белков.
Точность метода превышает точность описанного в литературе метода, и дает надежду на ее
дальнейшее повышение.
21
Выводы
1. Показаны принципиальные черты сходства и отличия в распределении аминокислот в
последовательностях спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.
2. Впервые установлена картина распределения периодичностей в последовательностях
аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.
3. На
основании
проведенных
исследований
распределения
периодичностей
в
последовательностях аминокислот и их характерных особенностей построены
искусственные аналоги спидроинов 1 и 2.
4. Проведенные оценки вероятностей распределения вторичных структур вдоль
полипептидных цепей спидроинов первого и второго типов свидетельствует о
значительном содержании α-спирали и левой спирали типа поли-l-пролин II. Это
соответствует квази-глобулярному состоянию макромолекулы с малым процентом
содержания β-структуры.
5. Проведены экспериментальные исследования спидроина 1 и его генно-инженерного
аналога. Установлено, что в растворе существует термодинамически устойчивая
форма, вторичная структура которой соответствует предсказанной.
6. Доказано, что процедура образования пространственной структуры основной нити
паутины включает несколько этапов, в ходе которой реализуются по крайней мере две
термодинамически устойчивые формы.
7. Разработан метод расчета антипараллельной β–структуры в белках. Показано, что его
точность превышает точность известных методов расчета аналогичных структур.
22
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Рагулина Л.Е., Макеев В.Ю., Есипова Н.Г., Туманян В.Г., Никитин А.М.,
Богуш В.Г., Дебабов В.Г. Исследование периодичностей в последовательностях
аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.
Биофизика, 2004, т. 49, с. 1053-1060.
2. Рагулина Л.Е., Макеев В.Ю., Есипова Н.Г., Туманян В.Г., Власов П.К., Богуш В.Г.,
Дебабов В.Г. Анализ вторичных структур спидроинов первого и второго типов из
пауков, принадлежащих различным видам. Биофизика, 2004, т. 49, с. 1147-1149.
3. Рагулина Л.Е., Макеев В.Ю., Туманян В.Г., Есипова Н.Г., Богуш В.Г. Анализ
периодических закономерностей в первичных структурах спидроинов и построение
модельной последовательности рекомбинантного белка. XLV научная конференция
МФТИ, 2002, с. 73.
4. Ragulina L.E., Makeev V.Ju., Esipova N.G., Tumanian V.G., Bogush V.G., Sidoruk
K.S., Debabov V.G. Spider silk fibrous protein β-structure and largeperiodical patterns.
BGRS Новосибирск, 2002, v 3, pp. 128-130.
5. Ragulina L.E., Makeev V.Ju., Esipova N.G., Tumanian V.G., Bogush V.G., Sidoruk
K.S., Debabov V.G. Intermolecular large-scale segmental duplications in the sequence
of spider-web protein. Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2003,
с. 196-197.
6. Ragulina L.E., Makeev V.Ju., Esipova N.G., Tumanian V.G., Vlasov P.K., Bogush V.G.,
Debabov V.G. Periodikal patterns in sequences of SPIDROINS I and II and secondary
structure prediction, BGRS Новосибирск 2004, , v. 1, pp. 343-346.
23