ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИЙ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ ДВУМЯ СПОСОБАМИ Звягинцева А.М., Лагунова Н.Л.

ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИХ
БАКТЕРИЙ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ ДВУМЯ СПОСОБАМИ
Звягинцева А.М., Лагунова Н.Л.
Тульский государственный университет
Тула, Россия
ASSESSMENT OF OXIDATIVE ACTIVITY OF OIL-DEGRADING MICROORGANISMS
USING TWO METHODS
Zvyagintseva A.M., Lagunova N.L.
Tula State University
Tula, Russia
С появлением высокоиндустриального общества большую опасность представляет
собой загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Перспективным
способом очистки нефтезагрязненных территорий является биоремедиация, осуществляемая
внесением бактерий-нефтедеструкторов.
Наибольшую угрозу для жизнедеятельности биоты представляют полиароматические
углеводороды, являющиеся канцерогенами и способными вызывать мутационные изменения.
Бактерии рода Pseudomonas способны к деградации различных полиароматических
соединений, но биоокисление некоторых субстратов идёт эффективно только за счёт
ферментов,
кодируемых
катаболическими
плазмидами,
в
том
числе
плазмидами
биодеградации нафталина.
В работе использовали бактериальный штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393,
модифицированный плазмидами биодеградации нафталина pBS216 и pOV17. P. aureofaciens
BS1393 относится к группе бактерий, стимулирующих рост растений, плазмиды pBS216 и
pOV17 обеспечивают окисление не только нафталина, продуктов его окислительного
превращения, но и ряда производных за счет широкой субстратной специфичности
кодируемых плазмидами оксигеназ. Совмещение в нефтедеструкторах биодеградативных и
фитостимулирующих функций является актуальным направлением. Для успешного
использования
плазмидосодержащих
микроорганизмов
необходимо
изучение
их
катаболических путей и закономерностей функционирования ферментов биодеградации, в
том числе оксигеназ.
Целью работы явилась оценка активностей ферментных систем окисления
ароматических соединений нефтедеструкторов P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P.
aureofaciens BS1393(pOV17) двумя способами: спектрофотометрическим и с помощью
микробного биосенсора на основе кислородного электрода.
Плазмиды биодеградации pBS216 и pOV17 являются структурно аналогичными, но,
перенесенные в бактериальный штамм P. aureofaciens BS1393, приводят к появлению
отличающихся культуральных характеристик у трансконьюгантов при росте в парах
нафталина на твердой агаризованной среде Эванса. Так, P. aureofaciens 1393(pBS216)
вызывает более интенсивную пигментацию культуральной среды вследствие накопления
промежуточных продуктов окисления нафталина, что может быть связано с разной
активностью ферментных систем трансконьюгантов.
Активности ферментов биодеградации нафталина (нафталин-1,2-диоксигеназы и
салицилатгидроксилазы) определяли спектрофотометрически по уменьшению экстинкции
НАДН в бесклеточных бактериальных экстрактах. Активности нафталин-1,2-диоксигеназы и
салицилатгидроксилазы оказались выше у P. aureofaciens 1393(pBS216) (на 27% и 22%
соответственно), что косвенно подтверждается более высокой пигментацией культуральной
среды у данного штамма.
Необходимо
отметить,
спектрофотометрическое
что
получение
определение
активностей
бесклеточных
ферментов
экстрактов
представляет
и
собой
длительный эксперимент, требует дорогостоящих реактивов, бактериальные лизаты быстро
теряют активность. Так, активность салицилатгидроксилазы на второй день (хранение при
-4ºС) уменьшается в 2 раза. Микробное окисление ароматических нефтекомпонентов
непосредственно связано с потреблением кислорода, что дает возможность использовать
биосенсоры амперометрического типа на основе кислородного электрода для оценки
окислительной активности. Биосенсорный анализ отличается экспрессностью измерений и
пробоподготовки: единичное измерение занимает 15мин, подготовка биорецепторного
элемента - 15-50мин (в зависимости от способа иммобилизации бактерий).
Биосенсорная
оценка
микробной
окислительной
активности
в
отношении
ароматических соединений показала, что профили субстратной специфичности штаммов
сходны, но у штамма с плазмидой pBS216 более высокая скорость и объем потребления
кислорода. Так, скорость окисления салицилата у штаммов с разными плазмидами
отличается в 2 раза, нафталина – в 3,3 раза. Величины активностей нафталин-1,2диоксигеназы и салицилатгидроксилазы, полученные спектрофотометрическим методом,
хорошо согласуются с биосенсорными данными. Коэффициент корреляции величин,
полученных двумя способами, равен 0,97.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП "Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России" (2009-2013г.), госконтракты №02.740.11.0296 и № П976.