АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕИНУРИИ

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕИНУРИИ
ТРЕБОВАНИЯ К ТОЧНОСТИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО
АНАЛИЗА СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ
Смещение В < + 20%;
Аналитическая вариация CV < 25%
Приказ МЗ РФ №45 от 07.02.2000 г.
Приказ МЗ РФ №220 от 26 мая 2003 г.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕИНУРИИ
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ
МЕТОД
Метод Брандберга-Робертса-Стольникова (азотная
кислота), полуколичественный
Метод сульфосалициловой кислоты, количественный
(1827г., Брайт; 1912г., Кобер; 1926г., Кингсбери;
1973г., Катсенельсон)
Метод трихлоруксусной кислоты, количественный
(1827г., Брайт; 1918г., Гринвальд; 1943г., Бекман)
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Белки в глобулярной
форме имеют малые
размеры и не рассеивают
свет
Денатурация
белков в
кислой среде
В результате реакции
преципитации
образуются крупные
белковые частицы,
хорошо рассеивающие
свет
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
ОСНОВНЫЕ НЕДОСТАТКИ МЕТОДА
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ЗАВИСИТ ОТ рН СРЕДЫ И СОЛЕВОГО
СОСТАВА
РАЗМЕРЫ ПРЕЦИПИТАТОВ ЗАВИСЯТ ОТ ХАРАКТЕРА ПЕРЕМЕШИВАНИЯ
ПРОБЫ
ПРИ БОЛЬШИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ БЕЛКА ВОЗМОЖНО ВЫПАДЕНИЕ
ПРЕЦИПИТАТОВ В ОСАДОК
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ХАРАКТЕРИЗУЮТСЯ БОЛЬШИМИ
ПОГРЕШНОСТЯМИ, КОТОРЫЕ ЗАВИСЯТ ОТ СОСТАВА МОЧИ И
ТЕХНОЛОГИИ ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА
МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ
Светодиоды
Фотоприемник
Реакционная зона на белок с
бромфеноловым синим
Тестовые зоны с
комплексом реактивов
Пластиковая полоска
Измеряется коэффициент светорассеяния на разных длинах волн
МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ
АНАЛИЗАТОР МОЧИ НА ПОЛОСКАХ
«УРИСКАН»
МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ
100,00
Коэффициент отражения, %
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
0г/л
0,05г/л
0,1г/л
0,3г/л
1,0г/л
3г/л
10г/л
30,00
20,00
10,00
0,00
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
Длина волны, нм
Коэффициент отражения света реакционной зоной зависит от
концентрации белка в моче и от длины волны света
Анализатор мочи UriСкан-strip
Отражательный фотометр с
оптимальной схемой измерения
КАЛИБРОВКА ЗОНЫ «БЕЛОК»
К(С)измер.
1
0,9
С аттест.,
г/л
К(С)инт.
0,8
Ст. откл.
CV
0,7
0,013
0,051
0,011
22%
0,120
0,026
22%
0,3
0,360
0,061
17%
0,2
1,199
0,310
26%
3,596
1,108
31%
Коэф.Отр.
0,000
0,6
0,5
0,4
0,1
0
0
2
4
6
8
С(измер.), г/л
10
12
14
МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ
Альбумин 100%
Калибровочные зависимости для белковой зоны с А и Г рН=5
80
Глобулин 100%
Коэффициент отражения, %
70
60
50
40
30
20
10
0
0,01
0,1
1
Концентрация белка, г/л
Коэффициент отражения света реакционной зоной для
разных концентраций альбумина и глобулина.
Тест-полоски чувствительны к альбумину.
10
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Фотометрическое
измерение продукта
реакции
λ=600 нм
Моча
Раствор красителя
пирогаллоловый
красный в буфере
Специфическая реакция с
образованием комплекса молекул
красителя с белком
ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ
ИЗМЕРЕНИЕ
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ
РЕАКЦИЯ
Молекулы белка в моче
Молекулы белка, помеченные
молекулами красителя
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
0,6
Спектр реагента
Спектр пробы с
концентрацией белка 0,6 г/л
Оптическая плотность, Б
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Длина волны , нм
Зависимость оптической плотности реакции (600 нм) от
концентрации альбумина (проба мочи – 20 мкл, реагент - 1 мл).
В присутствии белка возрастает оптическая плотность в
области 600 нм.
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
1,0
0,9
Оптическая плотность, Б
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Установленная концентрация альбумина, г/л
Зависимость оптической плотности реакции (600 нм) от
концентрации альбумина (проба мочи – 20 мкл, реагент 1 мл)
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
АНАЛИЗАТОР БЕЛКА В МОЧЕ «МИКРОЛАБ 600»
АНАЛИТИЧЕСКАЯ
СИСТЕМА
1.
Анализатор белка и креатинина «URiСКАН- БК»
(опытный образец), производства ООО «Эйлитон»
2.
Фотометрические пробирки 13х75 мм из боросиликатного стекла
(Corning Inc., США).
Автоматический пипеточный дозатор, объем дозирования 100 мкл,
производства BIOHIT, Финляндия; дата поверки – 10.04.2012
Автоматический пипеточный дозатор, объем дозирования 1,0 мл,
производства BIOHIT, Финляндия; дата поверки – 10.04.2012
Набор реагентов для определения белка в моче и спинномозговой
жидкости "ЮНИ-ТЕСТ-БМ" .( ТУ 9398-001-59879815-2009),
производства ООО "ЭЙЛИТОН", г. Москва;
Набор реагентов для определения креатинина «Креатинин-UTS»
производства ООО "ЭЙЛИТОН", г. Москва.
3.
4.
5.
6.
Liquichek
КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ
БЕЛОК
0,224
г/л
БЕЛОК г/л
Ст.
откл.
СV
25.06.2012
0,236
0,0157
6,7%
26.06.2012
0,233
0,0095
4,1%
27.06.2012
0,226
0,0132
5,8%
28.06.2012
0,237
0,0252
10,6%
29.06.2012
0,230
0,0073
3,2%
02.07.2012
0,224
0,0111
5,0%
Белок
0,250
0,200
0,150
С , г /л
Дата
Среднее
(20)
1,2%
03.07.2012
0,223
0,0091
4,1%
04.07.2012
0,235
0,0218
9,3%
05.07.2012
0,229
0,0129
5,6%
0,050
06.07.2012
0,227
0,0128
5,7%
0,000
30.07.2012
0,227
0,0109
4,8%
31.07.2012
0,230
0,0066
2,9%
01.08.2012
0,226
0,0084
3,7%
02.08.2012
0,225
0,0061
2,7%
03.08.2012
0,225
0,0051
2,3%
Среднее
0,227
1,2%
Ст. откл.
0,002024
CV
0,89%
0,100
0
2
4
6
8
10
Номер аналитической серии
12
14
16
Liquichek
КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ
БЕЛОК
0,647 г/л
КРЕАТИНИН
Дата
Среднее
(20)
Ст.
откл.
СV
25.06.2012
0,686
0,0351
5,1%
26.06.2012
0,695
0,0413
5,9%
27.06.2012
0,678
0,0216
3,2%
28.06.2012
0,675
0,0273
4,0%
29.06.2012
0,673
0,0168
2,5%
02.07.2012
0,666
0,0355
5,3%
03.07.2012
0,675
0,0178
2,6%
04.07.2012
0,678
0,0185
2,7%
05.07.2012
0,667
0,0305
4,6%
0,200
06.07.2012
0,672
0,0201
3,0%
0,000
30.07.2012
0,671
0,0199
3,0%
31.07.2012
0,669
0,0246
3,7%
01.08.2012
0,656
0,0261
4,0%
02.08.2012
0,666
0,0248
3,7%
03.08.2012
0,652
0,0186
2,9%
Среднее
0,663
2,5%
Ст. откл.
0,008366
CV
1,26%
Креатинин
0,800
С , г /л
0,600
0,400
0
2
4
6
8
10
Номер аналитической серии
12
14
16
Liquichek
КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ
БЕЛОК / КРЕАТИНИН
0,346
БЕЛОК/КРЕАТИНИН
Ст.
откл.
СV
25.06.2012
0,345
0,0322
9,3%
26.06.2012
0,336
0,0219
6,5%
27.06.2012
0,333
0,0207
6,2%
28.06.2012
0,351
0,0383
10,9%
29.06.2012
0,342
0,0158
4,6%
02.07.2012
0,337
0,0274
8,1%
03.07.2012
0,331
0,0144
4,3%
04.07.2012
0,347
0,0334
9,6%
05.07.2012
0,344
0,0233
6,8%
06.07.2012
0,337
0,0218
6,5%
30.07.2012
0,338
0,0156
4,6%
31.07.2012
0,344
0,0166
4,8%
01.08.2012
0,345
0,0186
5,4%
02.08.2012
0,338
0,0133
3,9%
03.08.2012
0,345
0,0136
3,9%
Среднее
0,342
-1,1%
Ст. откл.
0,004
CV
1,11%
Белок / Креатинин
0,4000
0,3000
R , г /г
Дата
Среднее
(20)
0,2000
0,1000
0,0000
0
2
4
6
8
10
Номер аналитической серии
12
14
16
ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ВАРИАЦИИ
Date
Protein g/l
Creatinine
g/l
Protein /
Creati
nine
12.09.2012
0,123
1,926
0,065
13.09.2012
0,013
0,298
0,045
14.09.2012
0,148
1,513
0,098
17.09.2012
0,090
1,195
0,076
18.09.2012
0,079
1,791
0,044
19.09.2012
0,166
1,927
0,086
20.09.2012
0,083
1,195
0,069
y = 9,3835x + 0,4656
2,500
R2 = 0,6748
Креа тинин, г/л
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
0,000
0,050
0,100
Белок, г/л
0,150
0,200
Сравнение результатов определения
концентрации белка в моче двумя методами.
сульфосалициловый метод, г/л
0,25
0,2
0,15
R2 = 0,1721
0,1
0,05
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
пирогаллоловый метод, г/л
Разброс точек обусловлен большими погрешностями метода
сульфосалициловой кислоты.
0,8