«Высокопроизводительная система для поиска новых
advertisement
«Высокопроизводительная система для поиска новых антибактериальных препаратов» Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова» Остерман Илья Андреевич кандидат химических наук, научный сотрудник В последние годы во всем мире регистрируется значительный рост устойчивости возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций к антимикробным препаратам. Антимикробная резистентность является естественным биологическим ответом на частое, повсеместное использование лекарственных средств, которое способствует отбору, выживанию и размножению устойчивых штаммов микроорганизмов. В связи с этим поиск новых препаратов является одной из главных задач молекулярной биотехнологии. Большинство работ, посвященных поиску новых антибиотиков, основываются на высокопроизводительном поиске ингибиторов клеточного роста. Однако, этот подход не дает никакой информации о механизме действия антибиотика, что совершенно необходимо для его рационального улучшения и в перспективе создания лекарства. Одновременные скрининг и определение механизма действия значительно ускоряет и делает более информативным процесс первичного скрининга. Нами была разработана уникальная репортерная система, которая позволяет одновременно с классическим тестом на эффективность ингибирования роста определять механизм действия антибиотика. Репортерная система основана на двух флуоресцентных белках, экспрессия одного увеличивается в присутствии веществ, вызывающих повреждение ДНК, экспрессия другого увеличивается в случае ингибирования работы рибосомы. С помощью созданной системы скрининга было протестировано более тысячи культуральных сред актиномицет, и несколько новых ингибиторов бактериальной трансляции было найдено. Использование разработанного метода поиска антибиотиков, замедляющих трансляцию, позволило установить, что амикумацин А ингибирует синтез белка (рис.1 и 2). Были получены данные рентгеноструктурного анализа для комплекса рибосомаамикумацин А, при этом точность разрешения рибосомы в этом комплекса 2 на момент публикации была самая лучшая в мире (2.4 ангестрема), точное место связывание этого антибиотика – E-сайт рибосомы, а молекулярнобиологические эксперименты показали, что амикумацин А ингибитор транслокации. В настоящий момент ведется оптимизация его структуры для использования данного антибиотика в медицинских целях. Рис 1. Хроматографическое разделение культуральной жидкости образца 4080 с последующим анализом полученных фракций при помощи репортерной системы. Рисунок 2. А. Структура амикумацина А и Б. Б. Ингибирование in vitro трансляции амикумацином А и Б. В рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы» при реализации проекта «Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов» были проанализированы десять тысяч потенциальных антибиотиков, определен механизм действия и отобраны активные соединения, которые могут быть использованы при разработке отечественных лекарственных препаратов. Разработанные лекарства позволят заместить имеющиеся иностранные лекарства и сделать Россию производителем уникальных, новых антибиотиков. Уникальная репортерная система, созданная Остерманом И.А., значительно снизила себестоимость процесса поиска новых антибиотиков и определения, что в свою очередь снизит стоимость производства новых антибактериальных препаратов. 3 Адекватность работы репортера подтверждена при помощи набора известных антибиотиков (рис. 3). Рис 3. Разработанная система позволяет получать наглядные результаты, иллюстрирующие механизм и эффективность действия антибиотика. ингибирования, тем Чем больше более зона эффективный антибиотик. Появление зеленого сигнала на границе зоны ингибироания, указывает на индукцию sulA репортера, т.е. антибиотик приводит к повреждению ДНК. Появление красного сигнала, указывает на индукцию TrpLA2 репортера, т.е. антибиотик ингибирует синтез белка. Созданный подход позволяет анализировать до шести сотен соединений на одной чашке Петри и до нескольких тысяч соединений в день, примеры получаемых результатов приведены на рисунке 4. Данная система не имеет аналогов в мире, несмотря на всеобщий интерес к поиску новый антибиотиков, но одновременное определение эффективности и механизма в таком высокопроизводительном формате доступна сейчас только нам. Рис 4. Пример антибиотиков, скрининга приведены новый четыре чашки Петри, на каждую нанесено в автоматическом режиме 576 образцов, зона ингибирования вокруг точки нанесения указывает на подавление роста, появление зеленого или красного свечения на границе зоны позволяет определить механизм действия. В ходе скрининга проанализировано 10 были тысяч образцов и обнаружены новые вещества, обладающие антибактериальной 4 активностью, для которых ранее ни механизм, ни вообще факт подавления бактериального роста показан ранее не был. Дальнейшая работа позволит на их основе создать уникальные отечественные антибактериальные препараты. Несколько примеров новых антибиотиков, для которых впервые показана антибактериальная активность и сразу определен механизм действия. Эти вещества подавляет рост клеток за счет ингибирования синтеза белка, данных об антибактериальной активности ранее получено не было. Для всех перечисленных соединений был подтвержден механизм действия при помощи ингибирования трансляции in vitro, а также оценена минимальная ингибирующая концентрация. Приведены только самые интересные примеры, всего же отобрано для дальнейшего исследования несколько десятков новых антибиотиков. На данный момент ведется анализ 100 тысяч соединений с целью обнаружения новый антибиотиков. Разработанный метод также может быть использован при направленном поиске противораковых препаратов, действующих по заданному механизму. 5
