Diagnosis of Neonatal Sepsis by Broad-Range 16S Real-Time Polymerase Chain Reaction

ФГБУ «НЦАГиП имени академика
В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития
Diagnosis of Neonatal Sepsis by
Broad-Range 16S Real-Time Polymerase
Chain Reaction
Диагностика неонатального сепсиса с
использованием
широкого спектра 16S ПЦР в реальном времени.
Andreas Ohlin, Anders Bäckman, Uwe Ewald, Jens Schollin, Maria
Björkqvist
Отделение реанимации и интенсивной терапии
новорожденных
Руководитель отделения: Ионов О.В.
Докладчик: Терлякова О.Ю.
Актуальность
Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций
как в их предупреждении, так и в патогенетически
оправданном и своевременном лечении зависит от
использования эффективных диагностических и
лечебных технологий.
Принимая во внимание скорость развития инфекционного
процесса у новорожденного, можно понять, насколько
значимо использование в неонатальной клинике методов
экспресс-диагностики.
Актуальность

В то же время существующие методы не всегда бывают
достаточно чувствительными для выявления патогенных
микроорганизмов. В большей степени это относится к
бактериальным патогенам, для обнаружения которых попрежнему в основном используют традиционные
микробиологические методы, имеющие неприемлемо
низкий уровень чувствительности, требующие большого
количества времени и усилий.
 Только в 8 из 100 микробиологических исследованиях
крови выявляются положительные результаты (Ben Stenson, 2012,
Неонатальная конференция. Майами).
 Включение надежных дополнительных и быстрых методов
анализа, при помощи которых можно было бы обнаружить
бактерии непосредственно в образцах крови (без их
посева) будет способствовать своевременной диагностике
и адекватной терапии у новорожденных
Цель исследования
Разработать и оценить эффективность нового метода
ПЦР в реальном времени для обнаружения
бактериальной ДНК в образцах крови, взятых у
новорожденных детей с подозрением на течение
неонатального сепсиса.
Критерии включения
 В проспективное многоцентровое
исследование были включены пациенты двух
университетских больниц Швеции,
наблюдавшиеся в отделение интенсивной терапии
с октября 2007 года по ноябрь 2009 года.
 В исследование были включены дети в возрасте
менее 3-месяцев жизни с подозрением на течение
неонатального сепсиса
Материалы и методы
 При подозрении на развитие неонатального
сепсиса у новорожденных проводилось
одновременное исследование образцов крови
микробиологическим методом и методом ПЦР
 объем крови для ПЦР составил 0.5-1,0 мл
Трактовка полученных результатов
микробиологического исследования образцов крови
 Сепсис – наличие одного положительного посева крови, одного
клинического
признака
сепсиса
(апноэ,
брадикардия,
нестабильность температуры, увеличение потребности в
дополнительном кислороде, появление серого колорита кожных
покровов, толерантность к усвоению энтерального питания),
потребность в проведении антибактериальной терапии более 7
суток и повышение С-реактивного белка (СРБ) ≥10 мг / л.
 Микробная контаминация – наличие положительного посева
крови, но отсутствие критериев сепсиса (клинических,
лабораторных).
 Предполагаемый сепсис - отрицательные посевы крови, наличие,
по крайней мере, одного клинического признака сепсиса,
проведение антибактериальной терапии более 7 дней, повышение
CРБ ≥ 10 мг / л.
 Отсутствие сепсиса - отрицательные посевы крови, отсутствие
критериев сепсиса (клинических, лабораторных).
Методы исследования:
Метод ПЦР в реальном времени был разработан для
LightCycler (LC) 2,0 (Рош Диагностика GmbH,
Мангейм, Германия).
 Метод ПЦР с амплификацией гена бактериальной 16S
рРНК;
 Обнаружение бактерий в крови новорожденных
проводили путем амплификации
высококонсервативной последовательности (размер –
380 пар оснований гена 16S рРНК) рРНК бактерий.
 ДНК была выделена из проб
цельной крови без ее инкубации в питательной среде.
Материалы:
В исследование были включены 368 образцов крови, взятых у
317 младенцев
Характеристика группы:
n
%
 Гестационный возраст 22–28 недель
114
36
 Гестационный возраст 29–36 недель
69
22
 Гестационный возраст 37–42 недели
133
42
 Гестационный возраст неизвестен
1
0.3
 Пол (мужской)
207
65
 Пол (женский)
110
35
 Госпиталь № 1
202
64
 Госпиталь № 2
115
36
 Роды через естественные родовые пути
47
149
 Кесарево сечение
146
46
 Способ родоразрешения неизвестен
22
7
Результаты:
Результаты микробиологического исследования
крови
Посев крови был положительным у 56 из 368 образцов
Результаты:
Сравнение результатов посева крови и ПЦР
Посев крови
положит.
отрицат.
Всего
ПЦР
 Положительный
44
31
75
 Отрицательный
12
281
293
 Всего
56
312
368
Чувствительность 79%, специфичность 90%,
положительная прогностическая ценность 59%
и отрицательная прогностическая ценность
96%.
Результаты
Исследование 7 образцов крови, имеющих отрицательные
данные культурального метода и положительные данные
ПЦР у детей с подозрением или течением бактериального
сепсиса.
Результаты
Клинические данные и результаты. Положительные
микробиологические посевы крови, при
отрицательных результатам ПЦР (п=12)
Выводы:
 Новый метод ПЦР в реальном времени обладает высокой
чувствительностью и специфичностью, что позволяет
выявлять ДНК микроорганизмов в цельной крови у
новорожденных детей с течением или подозрением на
течение неонатального сепсиса.
 Кроме того, данный метод позволяет выявить
микроорганизмы в культуре крови при отрицательных
микробиологических исследованиях у детей с течением
сепсиса даже после начала антибактериальной терапии.
 Применяемый метод не требует предварительной
инкубации крови в питательной среде, что позволяет менее
чем за 4-6 ч обеспечить врача наличием важной информации
о возбудителе.
Спасибо за внимание!