1.2. Проточная цитометрия как метод
advertisement
1.2. Проточная цитометрия как метод иммунофенотипической диагностики. Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки [222]. Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов. В арсенал лабораторной службы вошли методы определения параметров клеточного цикла, активности ферментов, митохондриального фагоцитарной потенциала, активности и концентрации другие. ПЦ ионов позволяет кальция, практически одновременно получать данные о самых разных характеристиках клетки и клеточных популяций [114], хотя для получения параметров светорассеяния никакой предварительной окраски флюоресцентными антителами не требуется [36]. Теоретические возможности ПЦ на сегодняшний день поддержаны многопрофильным программным обеспечением проточных цитометров и диапазон ее применения может быть ограничен только фантазией исследователя [63], а в диагностической службе – аналитическими потребностями клиники. В связи с прогрессивно нарастающим объемом информации по ПЦ, вылившимся в 11122 ссылки в период с 1980 по 1990 годы, 37568 ссылок в следующее десятилетие и 17723 ссылки за первые три года 21 первого века, нами не был предпринят исчерпывающий анализ научной медицинской литературы в этой области. Развитие технологий в области мультипараметрического анализа [228], гейтирования по CD45 [215], автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры [205] достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение. Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга. Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах [119, 116]. Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: это периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость. Получение их требует инвазивных вмешательств и травматично для пациента, а качество образцов часто страдает из-за сгустков, некроза, гемолиза, недостаточного объема и низкой клеточности [214]. Следовательно, возникает необходимость в определении условий приема в лабораторию такого рода материалов, упрощения и унификации протоколов пробоподготовки с тем, чтобы получить информацию от каждого такого образца. Особенно актуален вопрос клеточной сохранности для образцов костного мозга, доставляемого из географически удаленных мест, поэтому некоторые авторы рекомендуют исключать мертвые клетки в реальном времени анализа каждого образца [202]. Наиболее адаптированы для диагностической ПЦ протоколы включения витальных красителей, регистрация сигнала которых не препятствует оценке антигенов клеточной мембраны, например, 7-аминоактиномицин D (7-ААD) [244]. Тем не менее, использование 7-ААD для выявления живых клеток с целью последующего анализа их фенотипического профиля, трудно назвать общепринятым. Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинически понятного результата – иммунофенотипического диагноза. Однако, на практике оказывается далеко не все так просто. Уже при клиническом обследовании больного с подозрением на злокачественное гематологическое заболевание возникает три вопроса: 1) необходимо ли ИФТ; 2) каким методом должно быть проведено исследование; 3) как сформулировать иммунофенотипический диагноз и каков его вклад в формулировку окончательного клинического диагноза, определяющего стратегию ведения больного. Возникает проблема медицинской интерпретации данных [58]. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных: • необработанные данные интенсивности флюоресценций в формате, определяемым программным обеспечением прибора; • относительное содержание (%) различных клеточных популяций по оценке врача, проводящего анализ биологического материала; • информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, CD34+ при исследованиях в области гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)) [80]. Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных [45]. Отсутствие алгоритма анализа данных онкогематологических пациентов может приводить к неадекватной оценке фенотипического профиля клеточных популяций образца. Существенное улучшение результатов лечения острых лейкозов (ОЛ) в последние десятилетия связано с внедрением новых протоколов и методов лечения, включая такие высокотехнологичные, как трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. Их разработка, апробация и возможности клинического применения в определенной мере связаны с увеличением аналитических возможностей клинической иммунологии. Трудности диагностики острых лейкозов связаны с отсутствием патогномоничной клинической картины и различием критериев, применяемых для оценки гематологических нарушений. Патогенез заболевания предполагает исследование костного мозга как основного биологического материала при диагностике ОЛ [230], а первым шагом диагностики является выявление клеточного субстрата заболевания и определение содержания бластов относительно других ядросодержащих клеток [252]. Даже до превращения моноклональных антител в доступное средство диагностики было очевидно, что лейкозные бласты и клетки лимфом, несмотря на морфологическое сходство, могут принадлежать к разным клеточным линиям и различным уровням дифференцировки [113, 235, 196]. Тщательный анализ морфологических и цитохимических особенностей бластов привел к появлению ФАБклассификации [51], разделившей острые лейкозы на лимфобластные и нелимфобластные (миелобластные). И до сих пор цитохимический анализ, при котором с помощью специфических реакций выявляют субстраты, специфичные принадлежности [10] для сохраняет клеток различной определенную линейной диагностическую ценность. Отсутствие унифицированных реагентов и стандартных протоколов для реализации цитохимических исследований, субъективность оценки получаемых данных привели к тому, что каждую гематологическую клинику обслуживал один высокопрофессиональный специалист по цитохимии, результаты интерпретации данных которого не подвергались сомнению. Тем не менее, цитохимическая характеристика бластов долгое время была единственным лабораторным критерием дифференциальной диагностики острых лимфобластных и нелимфобластных лейкозов, а выявление миелопероксидазы (МПО) и сейчас относится к высокоинформативным признакам диагностики лейкозов миелоидного происхождения [226]. Ограничения цитохимического метода накладывают свой отпечаток на это положение: при низкой концентрации фермента в клетке и/или невысоком уровне бластоза чувствительность метода может оказаться недостаточной и привести к ложно отрицательным низкодифференцированных (ОМЛ). Для результатам случаев верификации острых бластов при диагностике миелоидных лимфоидного лейкозов происхождения применение критериев ФАБ-классификации на сегодняшний день признано нецелесообразным [116]. Исторически острый лейкоз рассматривался как блок дифференцировки клетки на определенной стадии ее развития, поэтому и варианты лейкозов получали свое название соответственно той стадии дифференцировки, антигены которой выявлялись на бластах в первую очередь. Даже учебники по иммунологической диагностике гемобластозов строились по тому же принципу [2]. Дифференцировочный статус гемобластозов (по господствовавшей в 70-80-е годы ХХ века концепции онкогенеза) определялся как «замороженная» стадия онтогенеза. Предполагалось, что при опухолевой трансформации [1, 45] клетки гемопоэтической системы сохраняют антигенный статус нормальных клеток, остановленных в определенный миг своего развития. Предполагалось, что такая «остановившаяся» клетка и дает начало клону лейкозных бластов. Таким образом, целый класс новообразований оказывался не подчиняющимся правилу классической онкологии, согласно которому характерным признаком злокачественности является нарушение гистотипа с более или менее выраженной утратой тканевой специфичности. Поэтому с исторической точки зрения вполне понятна сохраняющаяся традиция оценки каждого маркера как отдельного самостоятельного признака при постановке диагноза [43]. В настоящее время степень сохранности дифференцировочного статуса при гемобластозах расценивается как свидетельство существования различных форм взаимодействия трансформации и дифференцировки. Сохранение лейкозными бластами некоторых характерных черт фенотипического профиля клетки-предшественницы связано с тем, что опухолевая трансформация гемопоэтических клеток включает (запускает) механизмы нормальной дифференцировки и использует их. Механизмы нормальной дифференцировки участвуют как в самом процессе трансформации в виде ошибок физиологических рекомбинаций, так и в поддержании опухолевого клона за счет активации протоонкогена, блокировки созревания и т.д. [227]. Тесное взаимодействие трансформации и дифференцировки создает возможность «дифференцировочной» терапии онкогематологических заболеваний с помощью моноклональных гуманизированных антител, цитокинов, интерферонов, трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и других подходов [220]. В соответствии с этим, современная иммунодиагностика гемобластозов сопоставлении должна быть морфофункциональных основана на характеристик нетрансформированных гемопоэтических клеток гемопоэза и лейкозных бластов [82], т.е. на сопоставлении экспрессии не отдельных маркеров, а суммарного фенотипического профиля. Очевидность этого положения не упрощает его реализацию. нетрансформированной Фенотипический гемопоэтической профиль клетки нормальной отражает уровень созревания, способность и потребность воспринимать внешние сигналы, выполнять ту или иную функцию. В каждый момент времени созревающие клетки находятся на разных стадиях дифференцировочного процесса, но даже в костном мозге, одной из наиболее интенсивно пролиферирующих тканей, относительное содержание собственно бластов не превышает 5%, а основную клеточную массу составляют зрелые клеточные формы. Поэтому достаточно трудно получить информацию о фенотипическом профиле нормальных клеток, созревающих в физиологических условиях организма. В последние годы получено подтверждение, что нормальный процесс дифференцировки клеток в костном мозге [149] и/или тимусе [180] происходит с определенной, достаточно постоянной скоростью, определяемой потребностью организма в кроветворных и иммунокомпетентных клетках. По миелоидных мере клеток функционального происходит созревания перестройка лимфоидных генов, и кодирующих специфические рецепторы клеток, а значит, происходит изменение набора рецепторов для различных факторов роста, дифференцировки и межклеточного взаимодействия [30] мембранных и цитоплазматических антигенов и устанавливается линейная принадлежность, степень (не) зрелости и функциональное состояние клетки. Для практических, в том числе диагностических дискретными стадиями целей, процесс дифференцировки гемопоэза клеток, представлен фенотипический профиль и названия которых и легли в свое время в основу иммунологических классификаций ОЛ. Несмотря на накопление информации о том, что экспрессия антигенов лейкозными бластами часто аберрантна, не соответствует последовательности появления в норме, основные диагностические классификации сохранили свою значимость и на сегодняшний день [44]. С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии подарило возможность получать моноклональные антитела (почти) любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование [95]. Необходимость взаимопонимания и согласованности действий привели к тому, что практически одновременно в разных частях земного шара было разработано несколько международных регламентирующих документов [58, 177, 196], согласно которым ИФТ к настоящему времени превратилось в общепринятый способ диагностики ОЛ и лимфопролиферативных заболеваний, а предпочтительным методом его реализации является проточная цитометрия. Интересной особенностью этих публикаций была декларация использования многоцветного окрашивания с одной стороны и описание иммунофенотипа нормальных созревающих клеток по одному антигену, с другой стороны. Причины такого расхождения понятны. Прогресс технологий и доступность реагентов предоставили возможность мультипараметрической оценки популяций, а иммуногематологические классификации, разработанные в годы преобладания иммуноцито (гисто) химических методов соответствовали программной химиотерапии. Из-за несоответствия методических возможностей и диагностических критериев не была стандартизована оценка данных ПЦ, их медицинская интерпретация. Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок, для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика [123, 72]. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ [143, 146]. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб [148, 112] и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания (251, 134, 164). К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.
