1.2.1. Практические достижения проточной
advertisement
1.2.1. Практические достижения проточной цитометрии в диагностике гемобластозов. Очевидно, диагностики что лейкозов для и проведения лимфом иммунофенотипической необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов центрифугирования [56] только использование создавало градиентного возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки [58], то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов [13]. Однако, сама идея выделения определенной популяции клеток для последующего, более прицельного, анализа была реализована в селективном гейтировании, т.е. логическом выделении (ограничении) популяции по ее способности экспрессировать какой-то определенный маркер. Проблема в том, что надо выбрать маркер. С теоретической точки зрения все ясно: маркер должен присутствовать на клетках патологической популяции. Поэтому, по аналогии с лимфоцитами, был предложен панлейкоцитарный маркер CD45, и оценены возможности его использования для селективного гейтирования трансформированных клеток. Однако, при диагностике лейкозов и лимфом в некоторых случаях результаты гейтирования по CD45 могут быть некорректны в связи с тем, что ядросодержащие эритроидные клетки костного мозга (нормобласты), равно как и некоторые лейкозные клетки, негативны по этому антигену. Распространение принципа селективного гейтирования на маркеры CD19 и CD7 при диагностике лимфобластных лейкозов пока не получило должного распространения, хотя и позволяет оценивать иммунофенотипической профиль бластов, вне зависимости от наличия других клеток в образце. Выбор того или иного варианта гейтирования возможен только при наличии предварительной информации о линейной принадлежности патологических клеток. С практической точки зрения это означает, что сначала необходимо определить, какой маркер может быть использован для селективного гейтирования. В таком случае пробоподготовка становится неоправданно растянутой во времени. Следовательно, не разработан способ гейтирования, подходящий для выявления всех видов трансформированных клеток гематогенного происхождения. Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно [196]. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях [203]. В доступной нам литературе нет информации о возможности замены данных миелограммы результатами ПЦ при определении относительного содержания бластов в образце. В любом случае основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных [193]. На практике это снова возвращает нас к моменту получения биологического материала у первичного больного. Согласно рекомендуемым протоколам пробоподготовки, анализ данных ИФТ проводится тогда, когда технически невозможно получение дополнительной информации, т.е. в большинстве случаев в условиях cito! Существует точка зрения, согласно которой для определения линейной принадлежности лейкозных бластов достаточна оценка экспрессии маркеров скриннинговой панели [166, 45, 196]. Большинство авторов включают в нее миелоидные маркеры (МПО, CD13, CD33), лимфоидные маркеры Т- (CD2, CD7, cyCD3 и sCD3) и В-направления дифференцировки (CD10, CD19, cyCD22 и sCD22), дополняя ее антигенами, экспрессия которых характеризует незрелость клетки (TdT, CD34, HLA-DR). Даже при беглом взгляде на этот перечень, очевидно, что его использование не позволяет диагностировать такие редкие формы как эритромиелоз и мегакарибластный лейкоз, установить точный уровень дифференцировки клеток. С точки зрения авторов это оправдано последующим применением второй панели антител, состав которой определяется по результатам первого шага ИФТ. Таким образом, создается почва для субъективного выбора диагностических антител и возможности некорректной интерпретации их экспрессии. На самом деле, определение линейной коммитированности опухолевых клеток гематогенного происхождения тем проще, чем выше их уровень дифференцировки и тем труднее, чем ниже уровень морфологической дифференцировки. Сложность определения линейной принадлежности бластов может быть обусловлена отсутствием экспрессии линейных маркеров, с антигенов. существованием При перекрестной отсутствии экспрессии экспрессии линейных линейных маркеров на поверхностной мембране необходимо проводить их выявление внутри клеток. Трудно поверить, но еще в 1997 году выявление цитоплазматических маркеров было необязательно при диагностике ОЛ [58]. Вероятно, дополнительных возможность чтобы избежать окрашиваний, подтверждать необходимости логичнее с самого линейную проведения начала иметь принадлежность трансформированных клеток экспрессией не только поверхностных, но и внутриклеточных антигенов. Это требует минимального увеличения времени пробоподготовки за счет фиксации и пермеабилизации, но компенсируется получением достоверной информации о линейной принадлежности бластов.
