АКАДЕМИЯ НАУК УССР НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ ТРОЯН В. М. ГИДРАЗИД МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИНГИБИТОР ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И АЗОТИСТЫХ СОЕДИНЕНИЙ Автореферат диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор КАЛИНИН Ф. Л. КИЕВ— 1966 6)•nil i. 9, m.i,-jj <<л/и lyyf'- )ММ* С • /7 // '(/ f/ , АКАДЕМИЯ НАУК УССР НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ ТРОЯН В. М„ Гидразид малеиновой кислоты — ингибитор обмена йуклеиновых кислот и азотистых соединений Автореферат диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель — доктор биологических наук, . • профессор КАЛИНИН Ф. Л. , -/ Цепрадыи Научяая Баблмте*» f МОСКОВСКОЙ «рд. Левина Сели та.. Академия «и. К,л A, Jn.jngsjtB* № КИЕВ — 1966 Диссертационная работа выполнялась в лаборатории физио­ логии роста и развития растений на протяжении 1962—1965 гг. Диссертация' изложена на 233 страницах машинописи и со­ стоит из введения, обзора литературы, пяти глав эксперимен­ тального материала, обсуждения результатов и выводов. В работе приведено 52 таблицы и 62 рисунка. Список использованной литературы включает 288наимено : ваний, в том числе 213 на иностранных языках. ,.\ ,;. . . • ; » i i ' , . • ;.' . . .? ~'\ .'•.....,• •- • • " •'' ,".. . : . t -' .защита диссертации состоится в Институте физиологии рас> • тений АН УССР '. •' 1966 г. Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: Киев-22, Васнльковская, 49, секретарю Ученого Совета. <* В решениях декабрьского Пленума • ЦК КПСС (1963 г.) указывается, что ускоренное развитие химической промыш­ ленности является одним из главных'условий повышения про­ дуктивности сельскохозяйственного производства. ^Важное место в химизации сельского хозяйства на совре­ менном этапе должны занять биологически активные, веще­ ства, применяемые как средства управления рортом, развити­ ем и другими жизненными процессами растений с целью по­ вышения их продуктивности, уменьшения потерь при выращи­ вании, уборке и хранении урожая. Среди них большое прак• тическое значение имеет применение химических соединений, способных, затормозить или прекратить рост растений. По мнению многих исследователей (Webber, 1955; Ракитин, 1961; Крафтс, 1963 и др.) одним из самых эффективных ингибиторов ростовых процессов является гидразид'малешювой кислоты, сокращенно обозначаемый ГМК. -. / •'•'.. Результаты исследований, посвященных изучению физио­ логии действия и возможностей практического применения этого соединения, сведены в ряде обзоров (White, 1952; Zukel, 1954; Radwany, 1955; Weller at al., 1957; Баскаков, 1958; Коз­ лова', 1962; Крафтс, 1963; Калинин, Мережинский,. 1965)Л '«• Однако остается дискуссионным, вопрос о механизме ростингибирующего влияния этого вещества. Соответственно мно. госторшнему воздействию ГМК на процессы метаболизма в растении, существует и несколько точек зрения на способ его •действия. Основные из них следующие: ГМК является антиауксином (Leopold, Klein, 1951; Andreae, 1952, 1954; Ракитин, Сваринская, 1957). ГМК угнетает рост через'торможение митозов (Greulach Atchison, 1950; Darlington, Mc Leish, 1951; Carlson,J954; Gif ^ ford, 1956). • ГМК — дыхательный ингибитор (Naylor, Davis, 1951; Isenberg at al., 1951, 1954). • ГМК нарушает нормальную дифференциацию флоэмы и приводит к некрозу сосудистой системы (Mc Ilrath, 1950; Cur­ rier at al., 1951; Крафтс, 1963). 3 ГМК подавляет активность дегидраз и других соединений, реагируя с сульфгидрильными группами (Mnir, Hansh, 1953; Dugnani, 1954). ' • ' ч ГМК, являясь структурным аналогом урацила, >фгибирует рост растений, вмешиваясь в синтез нуклеиновых кислот ; (Kihlman, 1952; Greulach, 1955; Баскаков, 1958; Бутенко, Баскаков, 1960; Поволоцкая с сотр., 1960). • На наш взгляд особого внимания заслуживает последнее предположение о заместительном антагонистическом взаимо­ действии гидразида малеиновой кислоты и урацила при син­ тезе нуклеиновых кислот, которое предполагает связь между ростингибирующим влиянием ГМК и образованием нуклеино- t вых кислот, ответственных.за ростовые и формообразователь­ ные процессы. Учитывая опыты Грейлаха (Greulach; 1955) о снятии ростингибирующего влияния ГМК не только урацилом, но и тимином', мы предположили далее, что ГМК. может вы­ ступать антиметаболитом и тимина, молекула которого отли= чается от структуры молекулы урацила лишь наличием метилыюй группы у 5-го углеродного атома. В связи с вышеизложенным, задачей наших исследований было изучение влияния раздельной и совместной обработки растений растворами гидразида малеиновой кислоты.и пиримидиновых оснований урацила и тимина на-содержание и .*• состав нуклеиновых кислот, а также на азотистый и амино­ кислотный обмены растений сахарной свеклы с целью выясне­ ния механизма действия ГМК.. Кроме этого, в виду возмож- . ности практического применения ГМК в растениеводстве для подавления израстания корней в зимний период, изучалось влияние гидразида малеиновой кислоты и пиримидинбв на накопление-и превращение Сахаров (интенсивность дыхания, активность окислительно-восстановительных ферментов) ••, в корнеплодах при уборке и. через пять месяцев хранения. На- , конец, была предусмотрена проверка некоторых, полученных in vivo закономерностей, на культуре ткани in vitro. Исследования проводились в 1962—1965 гг. В качестве объекта были взяты растения сахарной свеклы сорта Рамонский-06. Выращивание материала в полевых условиях произ­ водилось на опытном участке Института физиологии растений АН УССР, а экспериментальная «асть и культивирование тка­ ней сахарной свеклы in vitro — в лаборатории физиологии роста и развития растений. Мы использовали ГМК в.виде триэтаноламинбвой-соли 30%-й концентрации в расчете на действующее начало. Обра­ ботка проводилась путем опрыскивания ботвы при помощи 4 ,х ручного пульверизатора водными растворамиТМК в двух кон­ центрациях — 0,3%.и 1% из расчета 1000 л/га. Урацил и тимин применялись в чистом виде в количестве 10 мг/л (0,001%). Часть растений, обработанных 0,3%-ным раствором ГАЖ, че­ рез два дня опрыскивались растворами пиримидинов. Чтобы охватить различные фазы развития растений, опрыст кивание проводилось в два qpoKa: за 90 дней (обработка 17.VII) и за 45 дней (обработка 3.IX) до уборки. За контроль принимались растения, опрысканные.водой. Содержание РНК определяли по методу Шмидта и Тангаузена (Ванюшин, 1964), ДНК—по реакции с дифениламином (Burton, 1956); нуклеотидный состав'нуклеиновых кислот по методу Спирина и Белозерского в описании Ванюшина (1964) с заменой электрофореза нисходящей хроматографией на бу­ маге для разделения нуклеотидов РНК. Растворимый.азот и его формы определялись по методике Ястрембовича и Калипина (1962), белковый — по Калинину и Ястрембовичу-(1963), аминокислоты — по схеме Зайцевой и Тюленевой (1958). Ды­ хание корнеплодов изучали методом Толмачева (1950), са­ хара — по прописи Починка (1958), активность перочксидазы и полифенолоксидазы по методике Keilin и Mann (1938). Влияние ГМК, урацила и тимина на содержание и нуклеотидный состав нуклеиновых кислот Изменения в обмене нуклеиновых кислот при введении этих веществ исследовались в точках роста корнеплодов са­ харной свеклы. Полученные данные показывают (табл. 1), что нанесение гидразида малеиновой кислоты вызывает снижение содержания рибонуклеиновой кислоты,, причём степень сни­ жения пропорциональна концентрации препарата. Это свиде­ тельствует об угнетении гидразидом реакций образования РНК. Пиримидиновые основания оказывают противоположный эффект: под .влиянием урацила и тимина содержание РНК увеличивается по сравнению с контрольным вариантом. " Последовательная обработка растений ГМК (0,3%) и урацилом'или ГМК и тимином приводит к частичному снятию пиримидинами ингибирующего влияния ГМК на, синтез РНК. Со временем содержание РНК в вариантах ГМК — 0,3%'+урацил и ГМК—0,3% -Ьтимин повышается по сравнению с вариантом", где обработка проводилась только 0,3%-ным раствором ГМК, и в образцах, отобранных 4.VIII, даже выше контроля. Аналогичные зависимости обнаружены при изучении содер­ жания дезоксирибонуклеиновой кислоты в точках роста обра. ' 5 ботанных растений (таблица 2). Как видно из приведенных данных, в присутствии ГМК содержание ДНК в точках роста снижается. Особенно сильно угнетает синтез ДНК 1%-ная концентрация гидразида: в образцах последнего срока-отбора (9.VIII) в этом варианте содержится всего 1,81 /чг ДНК на грамм сухого вещества, а в контроле — 3,84. Таблица I Рибонуклеиновая кислота в точках роста сахарной свеклы (в мг на 1' г сухого вещества, обработка 17.VII) Варианты 0> М н л • 51 Д5 • Ч ч оК оО. 22.VH 25. VII 30. VII 4.VIII 9.VIII 20,26 21,01 21,16 20,19 20,78 1 5«[ U o ^ 5£ 19,22 19,85 18,37 16,04 17,12 £ 1+ N3 SfO у :*£ l-fS™. U O T 19,85 21,72 22,60 22,10 21,35 18,00 18,90 19,26 20,87 20,43 20,09 21,80 21,26 21,82 21,47 t-o" 18,15 19,98 20,09 21,12 19,40 1 Ъ£ su *u 15,01 13,25 13,70 12,00 11,42 У—урацил, Т — тимин. Таблица 2 Дезоксирибонуклеиновая кислота в точках роста сахарной свеклы (мг на 1 г сухого вещества, обработка 17.V1I) Варианты о . с к о а • 2 «» га (ц Ч ч 22.VII 25.VII 30.VH 4.V1II 1 оо и о. UO ' 3,82 3,67 3,57 3,39 3,06 aviii У - у рацнл, Т — тимин. 4,36 i 4,99, . 4,72 4,77 3,84 ! H i >= 1+ 5 «я У uo 3,80 4,10 3,75 3,60 3,09 4,33 4,81 4,76 4,97 , 4,45 1+ 5" со U o 4,43 4,56 4,06 3,97 3,89 1 . т u,—. 4,84 5,21 4,46 4,80 4,77 3,39 2,70 2,30 2,70 1,81 Под" влиянием урацила содержание ДНК остается почти на уровне контроля и только под конец несколько увеличива­ ется; тимин же вызывает более заметное усиление синтеза ДНК. Совместная обработка свеклы ГМК (0,3%) и пиримидинами, как и в случае РНК, отчасти снимает угнетающее 6 действие ГМК. Тимин в этом, отношении оказался более эф­ фективным, чем урацил. , Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что под влиянием гидразида малеиновой кислоты происходит глу­ бокое торможение биосинтеза как рибонуклеиновой, так и дезоксирибонуклеиновой кислот в точках роста сахарной свек­ лы. Это согласуется с результатами опытов по воздействию ГМК ла ростки,картофеля (Поволоцкая, 1961) и клетки хло­ реллы (Kim, Greulach, 1963). Кроме этого, данные анализов указывают также на наличие антиметаболитических взаимо-. отношений между ГМК и пиримидино!ВЫми\пролзводными — урацилом и тимином, что проявляется в частичном снятии по­ следними ингибирующего влияния ГМК на образование ну­ клеиновых кислот.. > \ Исходя из предположения о заместительном антагрнистическом взаимодействии гидразида малеиновой кислоты, с од­ ной стороны, урацила и тимина — с другой, представлял .инте­ рес вопрос о влиянии ГМК на содержание пиримидиннуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот. Результаты определения нуклеотидного состава РНК пока­ зали (табл. 3), что в присутствии ГМК происходит снижение содержания уридинмонофосфата в молекуле РНК: • Таблица 3 Нуклеотидный соста^ РНК в точках роста сахарной свеклы (обработка 17.V1I, определение 9.VIII) Варианты молярные проценты отклонение от среднего±0,6 Г : у Ц •'• . А .А+Г У+Ц Г+Ц А+У 1,18 0,93 0,96 0,92 0,88 1,22 1,38 1,27. 1,32 1,55 / Контроль ГМК—0,3% ГМК—0,3+У ГМК—0,3+Т ГТ—1%. 30,3 24,8 25,2 26,5 23,0 20,9 18,8 20,0 21,6 15,6 4 25,9 32,6 31,9 30,6 37,3 25,1 22,8 24,8 21,7 23,3 .• Г — гуаниловая кислота (ГМФ), У — уридиловая кислота (УМФ), Ц — цитидиловая кислота (ЦМФ), А — адениловая кислота (АЛ1Ф). Однако, кроме этого, уменьшается количество и гуанилового нуклеотида, причем даже в большей степени, чем УМФ:, от 30,3 молярных процентов в контроле до 23 при обработке 1%-ной концентрацией ингибитора. Заметно падает также и содержание другого пуриннуклеотида — аденозинмонофосфор- ной кислоты. В результате уменьшается соотношение пурины/ пиримидины от 1,18 в контроле до 0.88 в варианте ГМК — 1 % . Величина коэффициента специфичности '(ГЦ), наоборот, по­ вышается за счет увеличения количества цитидиннуклеотида. При обработке растений ГМК (0,3%) и урацилом наблю­ дается обратная картина: немного повышается количество ГМФ, АМФ и УМФ и снижается содержание цитидилового нуклеотида. • Это приводит к повышению соотношения А + Г/У+Ц. В варианте ГМК+тимин также увеличивается содержание ГМФ и УМФ по сравнению с вариантом — ГМК—0.3%, однако количество АМФ еще больше падает, в результате чего отношение пурины/пирнмидины ниже, чем при нанесении только 0,3%-го раствора ГМК. Под влиянием гидразида малеиновой кислоты- происходят изменения и в нуклеотидном составе ДНК,, выделенной из то­ чек роста обработанных растений сахарной свеклы (табл. 4): , • ' Таблица 4 ' Нуклеотидкый состав ДНК точек роста сахарной свеклы (обработка 17.VII, анализ 9.VIII) \ молярные проценты . отклонение от среднего ±042—0,3 Варианты Г А •> Т А4-Г А+Т мц1 т-ьш-мц г+ц+мц Ц - 1,39 27,77 20,00 26,86 13,83 5,46 1.03 Контроль 1,08 25,80 19,30 25,20 20.58 7,50 0,85 ГМК—0,3% ' 22,23 1,31 30,30 14,33 6,50 0,95 ГМК—0,3%+У 26.26 23,00 1,27 29,43 13,94 5,84 •0,98 ГМК—0,3%+ Т 25,10 0,93 '24,00 17,70 20,68. 22,00 .8,50 0,81 ГМК—1% А—аденин; Г—гуанин; Т—тимин; Ц—цитозин; МЦ—метилцитозин. уменьшается содержание аденина, тимина и гуанина н по-1 вышается количество цитозина и метнлцитозина. Это приводит к понижению соотношения пурины/пиримидины от 1,03 в* контроле до 0,81 при концентрации ГМК—1%. Снижается также и величина коэффициента специфичности. Совместное нанесение ГМК с урацилом увеличивает^ количество пуриновых основа­ ний и тимина, а содержание цитозина и 5-метилцитозина, на­ оборот, уменьшается по сравнению с вариантом ГМК—0,3%. При обработке растении тимином после нанесения ГМК—0,3% молярное количество аденина еще снижается, но содержание цитозина и 5-метилцитозина приближается к контролю, а гуа8- . , ! ' , • . • нина и тимина—даже больше контроля. И в результате близка к контролю величина отношения пуриновых оснований- к пнримидиновым. * . • • + Из полученных данных следует, что гидразид малеиновой кислоты, по-видимому, угнетает включение в молекулы нукле­ иновых кислот не только уридин- и тимидиннуклеотидов, но и пуриннуклеотидов; включение же цитидиннуклеотида, наобо­ рот, заметно увеличивается, вследствие чего повышается со­ держание его и в РНК и в ДНК. При совместной, обработке растений растворами ГМК (0,3%) и пиримидинов нуклеотидный состав нуклеиновых кислот изменяется в основном в сто­ рону приближения к контролю. • ' Эти результаты до некоторой степени согласуются с рабо­ той Kim и Greulach (1963), где изучалось влияние раздель­ ного и совместного нанесения ГМК, пуринов и пиримидинов на число клеток хлореллы. Было обнаружено четкое снятие тормозящего влияния ГМК на увеличение количества клеток • при добавлении гуанина, а также тимина. Потом шли аденин, урацил и тицозин. Это заставляет предположить, что введе­ ние в ткани растения гидразида малеиновой кислоты затраги­ вает метаболизм' не только пиримидинов, но и пуринов, что. подтверждается и в, наших опытах. . АЗОТИСТЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В ТОЧКАХ РОСТА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, ОБРАБОТАННОЙ ГМК, УРАЦИЛОМ И ТИМИНОМ Изменения, происходящие в нуклеиновом обмене при воз­ действии гидразида малеиновой кислоты, заметно сказываются также на метаболизме азотистых соединений: Эксперименталь­ ные результаты показали, что в присутствии ГМК-происходит закономерное увеличение содержания как общего растворимо­ го азота, так и его форм — аммиачного, амидного и аминного азота. ч При этом эффект, оказываемый ГМК, пропорционален кон­ центрации препарата: при обработке свеклы 1%-ным раство­ ром гидразида содержание растворимого азота выше, чем при применении 0,3%-ной концентрации, и в образцах последнего срока отбора больше, чем в полтора раза превышает-конт-, рольную величину. Нанесение ГМК приводит также к накоп­ лению в тканях растений значительных количеств аммиака. Наряду.с этим, происходит активизация процессов, направ­ ленных на быстрое связывание и обезвреживание этого соеди­ нения, о чем свидетельствует повышение амидного и аминного азота; Сходные данные были получены другими авторами,при 9 обработке гидразидом табака (Petersen, Naylor,- 1953):и земляппки (Vatsu, Boynton, 1959). При воздействии пиримидиновых оснований получены ре­ зультаты, аналогичные влиянию ГМК:.в присутствии урацила и тимипа повышается содержание растворимых азотистых со­ единений в точках роста сахарной свеклы, однако в основном в меньшей степени, чем при введении гидразида. В итоге, в вариантах совместного внесения ГМК и пиримидинов содер­ жание' растворимого азота и его форм тоже оказывается за­ метно повышенным по •сравнению с контролем. Однако иные зависимости получены при изучении дина­ мики белкового азота в, точках роста, сахарной свеклы под влиянием испытуемых веществ (табл'. 5). ' . ' • Таблица 5 Белковый азот в точках роста сахарной свеклы (в мг на 1 г сухого вещества, обработка 17.VII) анализа 22.VII 30.VII. 9.VIII конт­ роль Дата .10,14 9,06 11,10 1 У 1+ (-.© 8,39 8,00 9,17 Г .• т 1_0" 9,89 ' 9,57 U.57 9,28 9,10 10,05 . • S s 11,34 9,48 9,77 ""'•• 9,30 11,92, 10,20 7,40 5,30 4,05 • . У — урацил, Т — тимин. Как свидетельствуют цифры, гидразид малеиновой кисло­ ты вызывает, снижение содержания белкового азота, причем 1 %-ная концентрация препарата оказывает более сильное вли­ яние в'этом направлении по сравнению с действием 0,3%-го раствора. Аналогичные данные были получены другими иссле­ дователями. (Haskins, Ghapman, 1956, Fults,. Payne, 1956). Содержание белкового азота в точках роста сахарной свек-. лы при введении пиримидинов выше контроля,.то есть эти ве­ щества, очевидно, стимулируют процесс образования белка. Повышение количества белкового азота, при обработке урацилом наблюдал Kessler (1956) в опытах, на винограде и оливках* Совместная обработка 0.3%-ным раствором ГМК с урацилом или тимином повышает содержание белкового азота по сравнению с вариантом, где наносилась только 0,3%-ная доза. малеингидразида. Повидимому.'в этом случае пиримидиновые ю основания . лрепятствуют полному проявлению угнетающего влияния ГМК на биосинтез белковых соединений. Одной из .причин снижения белкового синтеза при воздей­ ствии ГМК может быть недостаточная обеспеченность ткани аминокислотами или1-заметное снижение количества некото­ рых,'.наиболее важных аминокислот, например, моноаминодикарбоновых, занимающих центральное место в реакциях переаминирования. ; . .• ' • Однако количественное изучение содержания 16-ти свобод­ ных аминокислот в точках роста'сахарной свеклы.показало, что. при воздействии гидразида малеиновой кислоты повыша­ ется количество почти всех аминокислот (табл. 6): глицина, лейцина, серина, моноаминодикарбоновых кислот и их ами­ дов, диаминомонокарбоновых и циклических аминокислот, Таблица .-'. t 3 § ^ о.. • >> 1 §3? 5со (-о У 0.87 .0,80 Глицин ' 0,90 Алании 0,63 0,55 , 0,60 Лейцин 0,54 0,61 0,78 Серии 0,38 0,38 0,35* Цистин 0,94 1,44 1,27 Метионин + +валин 0,39 0,42 " 0,45 Асларагиновая кислота 0,22 0,30 0,55 Глютаминовая кислота 0,85 " 0,89 1.1? Аспарагин . 1,34 1,43 1,51 Глютамин, 0,31 0,39 0,48 Аргинин.. 0,41 0,41 0,48 Лизни 0,46 0,63 0,72 Фенилаланин 0,33 0,53 0,50 Тирозин 0,52 0,62 1,12 Гистидин 0,42 0,51 0,68 •j-аминомасляная кислЬта 0,48 0,60 0,68 Сумма амино­ кислот . 9,09 10,61 12,14 1+ \ 1 .t"°". t-— 0,84 0,52. '0,81 0,50 1,21 , 0,98 0,67 0,65 0,56 1,59 т t-o* 1,16 0,59 0,62 0,40 1,35 6 +Т Свободные аминокислоты в точках роста сахарной свеклы (мг на г сухого вещества, обработка • 17.VII, анализ 9.VIII) 1,06 0,50 0,68 0,48 1,16 . 0,43 0,46 0,57 &. 0,46 0,56 0,66 1,25 2,30 0,63 0,45 0,63 0,42 0,62 0,53 1.01 1,37 0,34 0,44 0,48 0,59 0,88 0,40 0,76* 2,20 0,36 0,52 0,65 0,65 •0,71 0,55 0,47 ' 0,36* 0,98 • 1,54 0,30 0,30 0,50 0,40 0,92 0,38 ... 1,30 13,34 i ' . . • 0,88 . 0 , 5 3 ., . 10,90 10,91 * / 1,20 13,17 * Некоторое снижение содержания этих аминокислот отмечено только под конец опыта. В пробах, отобранлых 22.VII я 30.VII, содержание их выше контрольной величины. -• • , ... ГМК увеличивает также количество сёросодёржащйхЛаминокислот, особенно цистина: при обработке 1%-ным раствором в образцах последнего срока определения (9.VIII) содержится 1,59 мг этой аминокислоты на г сухого вещества, в то время как в контроле всего 0.94 мг. Заметно повышается в присут­ ствии ГМК также и количество -у— аминомасляной кислоты. Исключение'составляет аминокислота аланин, количество которой снижается при нанесении 0,3%-го раствора инги­ битора в июле месяце. При сентябрьской обработке растений гидразидом содержание аланина выше, чем'в контроле: ' ' ' Действие азотистых оснований в основном сходно с влия­ нием ГМК: введение их в ткани вызывает увеличение коли­ чества почти всех аминокислот, Исключение из этой законо­ мерности составляет уменьшение содержания глицина при опрыскивании урацилом, и гистидина и аргинина при нанесе­ нии тимина. Кроме этого, пиримидины, как и ГМК, снижают количество аланина при обработке в июле. • • • • • ' • • • На основании полученных данных можно предположить следующее объяснение рос*тингибирующего действия гйдразида малеиповой кислоты: попадая в растение, ГМК угнетает включение пуринов, а также уридин- и тимидиннуклеотидовв молекулы нуклеиновых кислот, вследствие чего содержание их" значительно уменьшается. В результате нехватки "молекул РНК замедляются реакции включения аминокислот в поли­ пептидную цепь, что приводит к уменьшению содержания. белка и накоплению свободных аминокислот: Угнетение гид­ разидом малеиновой кислоты синтеза важнейших соединений живого организма — белков и 'нуклеиновых кислот вызывает подавление процессов^деления и новообразования протоплаз-. мы, а в итоге — торможение роста растений. •..>.. Пиримидиновые основания урацил и тимин, повышая со­ держание аминокислот, что указывает, по-видимому,, на - сти­ мулирующее влияние их на реакции образования данных со­ единений, усиливают и процессы их использования, о чем мо­ жет свидетельствовать увеличение содержания белка при вве­ дении этих веществ. "'•/ ДЕЙСТВИЕ ГМК И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИИ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЗАЦИИ VCAXAPOB v И ПРОЦЕССЫ ОКИСЛЕНИЯ В КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ ПРИ ХРАНЕНИИ , Эти вопросы изучались в корнеплодах.сахарной свеклы,' опрысканной растворами ГМК и ГМК + пиримидины 17-го июля и 3-го сентября. Свеклу убирали во второй половине ок12 I тября и хранили в ящиках с песком при температуре 3—4°СМ Анализы проводили при закладке корнеплодов на хранение — конец сентября и через пять месяцев хранения, то есть в конце ч марта месяца. . Опыты показали, что рлияние ГМК на содержание сахдра1 в корнеплодах свеклы при уборке зависит от времени обра­ ботки и концентрации препарата. Нанесение 0,3%-го рас­ твора ГМК в июле . уменьшает количество сахара в корнях, однако обработка этой же концентрацией ГМК в сентябре вы­ зывает некоторое повышение сахаристости в сравнении с конт­ ролем. Под действием 1%-ной концентрации содержание са­ хара заметно снижается и при ранней, и при поздней обработ­ ке, что обусловлено, по-видимому, токсическим влиянием вы­ сокой дозы ГМК на ткани растения. Кроме этого, известно, что высокие концентрации ГМК снижают количество хлоро­ филла и интенсивность .фотосинтеза (Гончарик, Маршакова, 1962), а это приводит к снижению содержания углеводов. Совместное применение для опрыскивания-свеклы 0,3Го­ лого раствора ГМК и урацила вызывает повышение сахарис­ тости корнеплодов, что особенно выражено при осенней обра­ ботке. Возможно, это связано с участием урацила в образо­ вании уридиндифосфатглюкозы, с помощью которой проис­ ходит синтез Сахаров в растении. Опрыскивание свеклы ГМК и тимином в июле несколько увеличивает содержание сахара по сравнению с обработкой одним ГМК, но при сентябрьском опрыскивании наблюдается обратная зависимость. Изучение сахаристости корней после пяти месяцев хране­ ния свидетельствует, 'что за этот период контрольные корне­ плоды потеряли значительное количество сахара — 20,8% от начального содержания. Потери сахара в корнях свеклы, об­ работанной 0,3%-ным раствором ГМК в июле, составляли все­ го 8,7%, а при осеннем нанесении ингибитора — 7,6%. Таким .образом, обработка сахарной свеклы'в начале сен­ тября 0,3%-ной концентрацией малеингидразида приводит и к повышению сахаристости корней при уборке, и к уменьше­ нию потерь сахара при хранении. Эти данные подтверждают результаты работ других авторов (Mikkelsen at al., 1952; Ракитин и сотр., 1958; Калинин, 1964). Обратная зависимость получена при совместном введении ГМК и пиримидинов: потери сахара в этих вариантах после пяти месяцев хранения даже превышают контрольную величи­ ну в корнеплодах первой обработки. Во втором опыте также наблюдается большая потеря сахара в вариантах ГМК+ура' • ч J3 цил и ГМК+тимин по сравнению с вариантом ГМК—0,3%. Повидимому, под влиянием пиримидинов к.этому времени происходит снятие тормозящего действия ГМК на-период по­ коя корнеплодов, израстание их усиливается, на что расходу­ ется значительное количество сахара. Одним из показателей интенсивности протекания физиоло­ гических процессов является дыхание. Установлено, что корнп свеклы, обработанной гидразидом малеиновой кислоты, от­ личаются слабой интенсивностью дыхания и при уборке, и че­ рез пять месяцев хранения по сравнению с контрольными ва­ риантами (табл 7). Особенно заметно подавляет дыхание вы­ сокая 1%-ная доза препарата. Кроме того, действие ГМК за­ висит также от времени обработки: нанесение ГМК в сен­ тябре "приводит к более сильному ингибированию дыхания, чем при опрыскивании в июле. , Таблица 7 Дыхание корнеплодов сахарной свеклы (в мл СО на 1 кг сухого вещества за 1 час) Варианты Дата обра• ботки * Контроль - ГМК — 0,3% ГМК — 0,3%+У • ГМК — 0,3%+Т при закладке на хранение: 18,5 20,5 22,8 17,7 18,7 22,8 ч Г7. VII 3. IX 20,7 18,1 i через пять месяцев хранения: ' I7.VII 3. IX . 28,1 28,1 25,5 23,4 27,8 25,6 гмк—1 % 18,0 14,8 ' 28,6 • • 25,9 25,1 21,0 Вероятно, за этот промежуток времени,, который прошел от первой-обработки растений растворами ГМК, дыхание кор­ неплодов восстановились в большей степени по сравнению с вариантами осеннего опыта. . Под влиянием пиримидинов происходит частичное снятие ингибирующего действия ГМК на процесс дыхания, вследст­ вие чего интенсивность его в этих вариантах выше, чем при нанесении только .0,3%-го раствора маленнгидразида. Это особенно заметно при определении энергии дыхания; корней 14 после пяти месяцев хранения. Так, интенсивность дыхания корнеплодов июльской обработки 0,3%-ной концентрацией ГМК и урацилом в это время,близка к контролю, а в вариан­ тах ГМК + тимин даже превышает контрольную величину. Опрыскивание этими соединениями во второй срок также сти­ мулирует дыхание, но в меньшей мере. Следовательно, и в этом случае пиримидиновые.основания урацил и тимин усили­ вают процессы, направленные на снятие ингибирующего влия­ ния гидразида малеиновой кислоты. Заметное действие оказывает ГМК также на распределе­ ние активности окислительно-восстановительных ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы, участвующих в конечной фазе процессов дыхания у растений. Установлено, что эти ферментные системы находятся в из­ вестной мере в отношении взаимного замещения. При воздей­ ствии ГМК окислительные процессы вначале в большей сте­ пени осуществляются с помощью фермента пероксидазы, ак­ тивность которого повышается (определение при /уборке). Активность полифенолоксидазы в корнеплодах в присутствии ГМК в это время, наоборот, ниже контрольной величины. Но со временем происходят обратные изменения: после пяти ме­ сяцев хранения в процессах окисления в корнеплодах свеклы, обработанной ГМК, большее участие, повидимому, принимает фермент полифенолоксндаза. Активность его в это время зна­ чительно повышается по сравнению с первоначальной вели­ чиной, а пероксидазная активность падает. В контрольных корнеплодах, а также в корнях вариантов, где обработка производилась 0,3%-ным раствором ГМК и пиримидиновыми основаниями — урацилом или тимином, актив­ ность этих ферментов изменяется в противоположную сторону. Таким образом, экспериментальные данные свидетель­ ствуют об угнетающем действии гидразида малеиновой кис­ лоты на процесс гликсуштического распада сахарозы в корне­ плодах сахарной свеклы при хранении, а также на интенсив­ ность окислительных реакций, происходящих в их тканях при дыхании. Использование ГМК для обработки сахарной свек­ лы с целью уменьшения потерь с/ахара при хранении корне­ плодов может, иметь практическое значение. Введение в ткани растения вместе с ГМК пиримидиновых производных приводит к увеличению потерь сахара по срав­ нению с действием одного гидразида. Из этого следует, что в отношении изучаемого процесса урацил и тимин выступают как антагонисты ГМК. , 15 ИНТЕНСИВНОСТЬ РОСТА,' НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И САХАРА В ТКАНЯХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO . Ткани сахарной свеклы 1Йыращивались на среде Уайта в модификации Hildebrandt (1962). При добавлении в питатель­ ную среду гидразида малеиновой кислоты наблюдается замет­ ное угнетение роста эксплантатов. Кроме этого, ГМК умень­ шает оводненность тканей сахарной свеклы, вследствии чего возрастает содержание сухого( вещества. Введение в среду пиримидиновых оснований сопровождается противоположной картиной: рост эксплантатов стимулируется, активно образует­ ся каллус, повышается оводненность тканей, а содержание су­ хого вещества падает. Исходя изнпредположения об антагонистическом взаимо­ действии ГМК н пиримидииов нами были поставлены опыты по изучению влияния совместного внесения в среду этих сое­ динений на интенсивность роста ткани. Пиримидины исполь­ зовались в концентрации 10 мг/л, так как при добавлении такого количества их эксплантаты растут особенно интенсивно. Опытами установлено, что во всех вариантах, где кусочки тканей свеклы были посажены на среду ГМК +" пиримидины интенсивность их роста больше, чем на среде, содержащей только гидразид, и превышает интенс!гвность роста каллусов' на'контрольной среде. Только при-увеличении концентрации ГМК до 10 мг/л средний вес каллуса немного меньше коптрольной величины. Таким образом, можно констатировать, что урацил и тимин способны полностью или частично сни­ мать подавляющее влияние ГМК на рост тканей сахарной ^свеклы in vitro. ' . . В результате экспериментального исследования содержа­ ния нуклеиновых кислот в трасплантатах сахарной бвеклы было обнаружено, что при росте тканей заметно повышается количество луклеиновых кислот по сравнению с содержанием их в .тканях исходных корнеплодов: за двадцать дней роста эксплантата на питательной среде содержание нуклеиновых кислот увеличивается более, чем в 3,5 раза. Однако, добавле­ ние в среду ГМК угнетает процесс биосинтеза этих соедине­ ний. Степень угнетения пропорциональна' концентрации инги­ битора. Введение в среду азотистых оснований сопровождает­ ся обратными изменениями: с увеличением концентрации урацила и тимина до 10 мг/л стимулируется и.синтез нуклеиновых кислот.. • Одновременное введение в среду ГМК и пиримидииов так­ же приводит к снятию угнетающего действия ГМК на синтез 16 :. ' нуклеиновых кислот (табл. 8). Особенно отчетливо это высту­ пает при. добавлении в среду ГМК в концентрации 5 мг/л и вдвое большем количестве урацила (10 мг/л). Синтез нуклеи­ новых кислот, заметно угнетенный этой концентрацией ГМКне только восстанавливается урацилом, но даже немного пре­ вышает контроль. Это согласуется с результатами исследова­ ний -Бутенко и Баскакова (1960), которые наблюдали полное восстановление роста ткани моркови при таких же соотноше­ ниях ГМК и урацила в среде. \ # : , - .' Таблица 8 • - , i . Нуклеиновые кислоты в эксплантатах сахарной свеклы при воздействии ГМК и урацила ГМК .нг/л, • 0' . 0,10 . 0.1 . 1 • ' Урацил мг/л , л '• • 0 .0 10 10 0 мг НК на на 100 мг обезжи­ ренного остатка 0,47 0,45 0,89 . 0,69 0,40 ГМК Урацил мг/л мг/л t . 1 Ъ -. 5 10 10 : 10 О 10 0 10 мг НК на 100 мг . обезжи­ ренного остатка 0,46 0,36 0,50 0,21 0,46 • . Таким образом, при изучении влияния различных концен­ траций гидразида малеиновой кислоты и пиримидинов на син­ тез нуклеиновых кислот в изолированных тканях сахарной свеклы, получены закономерности, сходные с воздействием этих веществ'на интенсивность роста эксплантатов. . Конечно, зависимости, обнаруженные на тканях, культиви­ руемых in vitro, нельзя полностью относить к целым организ'мам, функционирование которых связано с воздействием мно­ гих внешних и внутренних факторов. Однако изучение росто­ вой реакции и изменения содержания нуклеиновых кислот свидетельствует, что ткани сахарной свеклы в опытах, прове­ денных и in vivo, и in vitro в основном сходно реагируют на влияние гидразида, Урацила и тимина. Изучение содержания форм Сахаров в изолированных тканях сахарной свеклы показало, что при введении ГМК по­ давляется процесс образования моносахаров и снижается расход сахарозы. При совместном добавлении в среду ГМК •и пиримидинов наблюдается обратная картина: количество моносахаров возрастает по сравнению с содержанием их. о ва- - - ^ ^ Б ^ З ? 17 .щзл №оск' UWJL**** риантах с ГМК, а сахарозы — понижается. Таким образом, результаты показывают, что гидразид малеиновой кислоты ингибирует процесс гликолитического распада Сахаров в тка­ нях сахарной свеклы in vitro. Это заключение согласуется с данными, полученными при исследовании сахаристости корне­ плодов при хранении. ВЫВОДЫ • 1. Гидразид малеиновой кислоты угнетает биосинтез нукле­ иновых кислот в точках роста сахарной свеклы, а также в тка­ нях свеклы, культивируемых in vitro. Пиримидиновые основа­ ния — урацил и тимин стимулируют этот процесс. При сов­ местном нанесении ГМК и пиримидинов наблюдается частич­ ное снятие последними ингибирующего влияния ГМК «а синтез .нуклеиновых'кислот. 2. При введении ГМК происходят качественные изменения РНК и ДНК точек роста сахарной свеклы: снижается содер­ жание уридин- и тимидиЕгауклеотидов, а также пури'ннуклеотидов. Повидимому, в присутствии ГМК подавляется'включе­ ние этих нуклеотидов в молекулы нуклеиновых кислот. Коли­ чество цитиднниуклеотида, наоборрт, повышается. Урацил и тимин уменьшают влияние ГМК на нуклеотидный состав ну­ клеиновых кислот. 3. Под воздействием гидразида малеиновой кислоты отме­ чено повышение содержания растворимых азотистых соедине­ ний в точках роста свеклы и заметное снижение содержания белкового азота. Накопление растворимых азотистых соеди­ нений, в частности свободных аминокислот, происходит, ве­ роятно, вследствие угнетения использования аминокислот 'в синтезе белка, что может быть связано с нехваткой молекул РНК, синтез которой ингибируется гидразидом. 4. Пиримидиновые основания урацил и тимин. повышая уровень свободных аминокислот, способствуют и их исполь­ зованию, о чем свидетельствует увеличение •белкового азота' в этих вариантах. При совместной обработке растений ГМК и пирнмидинамн наблюдается снижение ингибирующего дейст­ вия ГМК на биосинтез белка, что объясняется противополож­ ным влиянием ГМК и пиримидинов на образование нуклеино­ вых кислот, ответственных за синтез полипептидной цепи. 5. Обработка растений сахарной свеклы растворами ГМК оказывает влияние на сахаристость корнеплодов при уборке. /При этом действие ГМК зависит от времени обработки и кон­ центрации препарата; предуборочное опрыскивание посево'в 18 ', * : '.'' •".•'..'";• v< 'к 0,3%-ным раствором способствует увеличению сахаристости корней, тогда как более ранняя обработка'.—-в июле месяце, а также нанесение 1%-го раствора оказывают отрицательное действие. 6. Гидразид малеиновои кислоты снижает интенсивность дыхания корнеплодов сахарной свеклы,, что обуславливает уменьшение потерь сахара в них при пятимесячном храпении.. Пиримидины. частично снимают подавляющее влияние ГМК на1 процесс гликолитического распада Сахаров. Это подтверж­ дается исследованием содержания Сахаров в эксплантатах свеклы. ' ^ 7. ГМК вызывает изменение направленности окислнтельнб. восстановительных ферментов по сравнению с контролем. Осенью окислительные процессы, в корнеплодах опытных ва­ риантов осуществляются в большей мере при участии пероксидазы, а через пять месяцев хранения — полифенолокси\ дазы. В вариантах ГМК + пиримидины активность ферментов изменяется в сторону приближения к контролю, что также свидетельствует о наличии антиметаболитических отношений между ГМК и данными пиримидиновыми основаниями. • ..->• - список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Гидразид малеиновои кислоты — антиметаболнт обмена угеловодно.фосфорных соединений и нуклеиновых кислот. I Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов, в. 111, Ленинград, 1964. 2. О механизме действия гидразида малеиновои кислоты .на растение. IX Менделеевский съезд, Рефераты докладов, № 2, Москва, Наука, 1965. 3. Бюсинтез i нуклеотидннн склад ДНК i РНК в точках росту цукрового буряка при введена! пдразиду малеТново! кнслоти. I УкраТнський бшх1м'1чний зЧзд, Тези доповщей, Чершвщ, 1965. 4. Изучение процессов роста и. дифференциации в контролированных условиях. ' В сб. «Рост и устойчивость растений», К.; Наукова думка, 1965. 5. К выяснению, механизма действия гидразида малеиновои кислоты нах растения. . Там ^ке. . БФ 06232. Подписано к печати 12:Ш 1966 г. 1,25 п. л. Зак. 1043. Тираж 150. Киев, тип. № 3, цех 2, ул. Франко, 44.