тема: методы генетики человека

О
Оссннооввы
ы ггееннееттииккии ччеел
лооввееккаа
n Генетика человека как наука. Задачи генетики человека
на современном этапе
o Человек как объект генетических исследований
p Характеристика основных методов генетики человека
q Характеристика экспресс-методов генетики человека
r Характеристика методов пренатальной диагностики
Генетика человека - наука, изучающая закономерности
наследования нормальных и патологических признаков
человека.
1
c
Известно более 4000 наследственных болезней человека. 2,5%
новорожденных имеют наследственные болезни. 40% случаев ранней детской смертности и инвалидности обусловлено наследственной патологией.
В 2000 г. определена полная нуклеотидная последовательность генома человека и создан банк информации о секвенировании (определение первичной структуры ДНК) генов человека.
Задачи генетики человека:
1. Ранняя диагностика наследственных заболеваний путем совершенствования экспресс-методов и пренатальной диагностики.
2. Разработка методов генной терапии наследственных заболеваний на основе генной и клеточной инженерии.
3.
Широкое
внедрение
в
медицинскую
практику
медико-
генетического консультирования.
4. Выявление генетически опасных факторов внешней среды и разработка методов их нейтрализации.
2
d Человек - сложный объект генетических исследований.
Трудности изучения человека как генетического объекта:
1. Невозможность применения гибридологического метода.
2. Большое число хромосом (46 в 2n наборе): ≈ 30 - 60 тыс. генов.
3. Позднее половое созревание (11-16 лет).
4. Малое количество потомков в большинстве семей.
5. Редкая смена поколений.
6. Нельзя создать одинаковые условия жизни для всех людей в изучаемой группе.
Преимущества человека как генетического объекта:
1. Большое количество особей в популяциях людей.
2. Социальный характер человека.
3. Человек лучше других объектов изучен клинически.
4. Существует большое число методов, позволяющих компенсировать вышеприведенные трудности изучения.
3
e Клинико-генеалогический метод (Ф. Гальтон 1883 г).
Суть метода: построение и анализ родословной. Родословная –
схема родственных связей в пределах одной или нескольких семей.
Этапы метода:
1. Сбор сведений как минимум о трех поколениях родственников
пробанда – человека для которого составляется родословная.
2. Составление родословной.
3. Анализ родословной.
Метод позволяет установить:
1. Наследственный характер изучаемого признака.
2. Тип наследования признака.
3. Зиготность членов родословной.
4. Пенетрантность и экспрессивность гена, отвечающего за признак.
Правила построения родословных:
а) использование специальных символов;
4
б) символы, обозначающие особей одного поколения, располагаются
строго по горизонтали;
в) сибсы одного поколения нумеруются арабскими цифрами;
г) каждое поколение нумеруется римскими цифрами.
Типы наследования признаков:
аутосомное
доминантное
гоносомное
рецессивное
Х-сцепленное
Y-сцепленное
(сцепленное с полом)
(голандрическое)
доминантное
рецессивное
Для аутосомного наследования характерно равновероятное проявление признака и у мужчин и у женщин. При гоносомном наследовании
признаки наследуются в зависимости от пола особей. Доминантный признак проявляется в каждом поколении сибсов (больной ребенок у больных родителей), а рецессивный – только в некоторых поколениях.
5
Близнецовый метод (Ф. Гальтон 1876 г.) - изучение генетических закономерностей на близнецах.
Суть метода: установление роли наследственности и среды в формировании отдельных признаков у человека, исходя из сходства и различия монозиготных и дизиготных близнецов.
Этапы метода:
1. Составление выборки близнецов.
2. Диагностика зиготности близнецов.
3. Определение степени конкордантности выборок близнецов по
изучаемому признаку.
4. Вычисление коэффициента наследования.
Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной
яйцеклетки (полиэмбриония), дизиготные – из двух.
Критерии дизиготности близнецов:
1. Разнополость.
2. Отличия по комплексу фенотипических признаков.
6
3. Отличия по моногенно наследуемым признакам (антигены по
системе АВО, МN, Rh, группы белков сыворотки крови и т.д.).
4. Различия в дерматоглифических показателях.
5. Положительный тест на аутоагрессию лейкоцитов и на кожный
трансплантант.
6. Отличия в последовательности нуклеотидов ДНК.
Конкордантность (сходство близнецов) – отношение числа близнецов, у которых признак одинаков к общему числу выборки (выражается в
процентах). Дискордантность – различия близнецов по изучаемому признаку.
Формула Хольцингера (Н – коэффициент наследования):
Н=
признак зависит от среды
КМБ% - КДБ%
100% - КДБ%
0 ← Н→ 1
признак определяется генотипом
7
Цитогенетический метод. Термин «цитогенетика» предложен Сеттоном в 1903 г. Tijo и Levan (1956 г.) – в кариотипе человека 46 хромосом.
Суть метода: - изучение кариотипа при помощи микроскопической
техники.
Этапы метода:
1. Получение и культивирование клеток на искусственной питательной среде (лимфоциты, фибробласты).
2. Добавление в среду ФГА для стимуляции деления.
3. Остановка деления клетки в метафазе колхицином.
4. Обработка клеток гипотоническим раствором NaCl (клетка разрывается и хромосомы доступны окрашиванию).
5. Окрашивание хромосом специфическими красителями.
6. Микроскопирование и фотографирование хромосом.
7. Составление идиограммы и ее анализ.
Метод применяется для диагностики геномных, хромосомных мутаций, для установления генетического пола организма.
8
Метод генетики соматических клеток (Барский 1960 г.) – изучение
генетических закономерностей человека, используя его соматические
клетки.
Особенности соматических клеток:
1. Имеют диплоидный набор хромосом.
2. Долго хранятся в замороженном состоянии.
3. Хорошо растут на различных питательных средах.
4. Быстро делятся митозом.
Существуют 3 разновидности метода:
а) клонирование (получение клона клеток);
б) селекция (отбор клеток с исследуемым признаком);
в) гибридизация (слияние клеток особей одного вида или разных
видов с образованием гетерокариона и синкариона).
Метод позволяет изучать многие вопросы генетики человека в эксперименте, устанавливать группы сцепления и строить цитологические
карты хромосом.
9
10
Популяционно-статистический метод - изучение генетического состава популяции. Основан на законе Харди-Вайнберга, позволяет определить частоту генов и генотипов в популяциях.
Биологическое моделирование - основано на законе гомологических рядов Н. И. Вавилова. На животных (мыши, крысы, собаки) моделируют наследственные заболевания (создают мутантные линии сахарного
диабета у крыс или гемофилии у собак и т. д.), изучают патогенез, разрабатывают методы диагностики, лечения и используют полученные данные применительно к человеку.
Математическое моделирование - создание математических моделей генетической структуры популяции человека для прогнозирования ее
изменений под влиянием антропогенных изменений окружающей среды.
В рамках программы «Геном человека» создаются специальные компьютерные программы моделирующие функционирование генетической информации, полученной при секвенировании ДНК.
11
Биохимические методы – основаны на определении концентрации
первичного белкового продукта гена, фермента или патологических метаболитов в моче, крови, или внутри клетки. Используются для диагностики наследственных болезней обмена веществ, развивающихся в результате генных мутаций.
Количественные биохимические методы позволяют определить гетерозиготное носительство патологического рецессивного гена (фенилкетонурии) по скорости метаболизма пред-
Концентрация ФА
в крови
4
варительно введенного ФА. Если уровень ФА быстро нормализуется, то в
3
организме достаточно фермента фени-
Аа
лаланин-4-гидроксилазы и патологиче-
2
АА
1
ского гена нет, а если уровень ФА дли-
0
тельно повышен, то фермента мало
1
2
3
4
5
(человек является носителем этого ге-
6
Часы
Введение ФА
на).
12
Молекулярно-генетические методы (рекомбинантной ДНК). Метод
позволяет обнаружить патологический ген в геноме.
1. Образцы ДНК пациента под действием рестриктаз разрезаются на более короткие фрагменты имеющие точки узнавания.
2. Полученные фрагменты разделяют электрофорезом в полиакриламидном
геле на фракции, отличающиеся размером (молекулярной массой).
3. Получение необходимого числа копий определенных фракций ДНК при
помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
4. Тепловая денатурация размноженной фракции двухцепочечной ДНК на
одноцепочечные фрагменты.
5. Помещение этих фрагментов в среду с радиоактивным зондом (одноцепочечная ДНК, соответствующая патологическому гену). Если среди
фрагментов ДНК имеется комплементарная зонду патологическая последовательность, то происходит образование двухцепочечной ДНК.
6. Регистрация результата исследования происходит при помощи рентгеночувствительной пленки.
13
fМетоды экспресс-диагностики (“скрининг тесты”, просеивающие
программы) – методы предварительной диагностики наследственных заболеваний.
1. Дерматоглифический анализ изучение гребешковой кожи.
Применяется для диагностики
врожденной
компоненты
наслед-
ственных заболеваний (при геномной
патологии
отмечаются
радиальные
петли на 4 и 5 пальцах, ЧПБ, главный ладонный угол от 600 до 800 и др.) и
для установления зиготности близнецов.
2. Химические методы (качественные цветные реакции). Для диагностики фенилкетонурии к мокрым пеленкам ребенка прикладывают бумагу,
смоченную 10% раствором FeCl3 (при наличие в моче ФПК - зеленоватое
окрашивание).
14
3. Микробиологические тесты – основаны на свойствах бактерий
нуждаться в определенных химических веществах для их нормальной
жизнедеятельности.
Тест Гатри: кровь новорожденных, наносят на диски фильтровальной бумаги и помещают на агаровую среду, в которой находится штамм
бактерий, рост которого подавлен антиметаболитом. Если концентрация
ФА слишком велика, (фенилкетонурия), то отмечается бурный рост бактерий.
4. Биохимические: флюорометрические, хроматографические, радиоиммунологические экспресс-методы используют для быстрой предварительной диагностики наследственных болезней обмена.
5. Определение Х- и Y- полового хроматина – исследуют клетки буккального эпителия или лейкоциты. Х-хроматин определяется при окрашивании ацеторсеином, а Y-хроматин - акрихинипритом. Устанавливают
генетический пол, диагностируют хромосомные болезни пола.
15
gМетоды
пренатальной диагностики (диагностика наследствен-
ных дефектов плода на ранних стадиях беременности).
Непрямые методы (объект исследования – женщина): медикогенетическое, серологическое обследование и определение эмбрионспецифичных белков (α–фетопротеин, хориональный гонадотропин) показаны
всем беременным женщинам. Белки продуцируются клетками плода и плаценты и поступают в кровь матери. Исследование проводится на 13-15 неделях беременности.
Уровень α–фетопротеина повышен :
а) при угрожающем выкидыше;
г) при многоплодной беременно-
б) при внутриутробной гибели пло-
сти;
да;
е) при дефектах нервной трубки;
в) при Rh- несовместимости матери
ж)
при
врожденном
нефрозе;
и плода;
Низкий уровень α–фетопротеина отмечается при синдроме Дауна.
16
Прямые методы (объект исследования – плод):
1. Прямые неинвазивные методы показаны всем беременным женщинам, так как считаются безопасным для матери и плода.
Ультрасонография (УЗИ) - использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек. Метод применяется на 12-15 неделях беременности, позволяет выявить многоплодную беременность,
грубые пороки развития нервной и опорно-двигательной системы.
2. Прямые инвазивные методы используются по показаниям, так
как возможны осложнения (0,5-6 % случаев – выкидыш):
ƒ возраст старше 35 лет (риск синдрома Дауна повышен в десятки раз);
ƒ структурные перестройки хромосом у одного из родителей;
ƒ 1-й ребенок имеет болезнь с рецессивным типом наследования;
ƒ доминантно наследуемое заболевания у родителей;
ƒ при сцепленном с Х-хромосомой наследовании, если плод - мальчик;
ƒ беременность на фоне психологических травм, тяжелых заболеваний, неблагоприятного действия среды.
17
Хорионбиопсия
(взятие
эпителия
ворсинок хориона) - проводится под контролем УЗИ на 8-12 неделях беременности.
Есть трансабдоминальный и трансцервикальный методы. Катетером с пластической канюлей, соединенной со шприцом,
извлекают 10-25 мг ворсинок хориона.
Амниоцентез (взятие 20-30 мл амниотической жидкости с находящимися в ней
клетками плода). Проводят на 15-17 неделе
беременности
трансабдоминально
под
контролем ультрасонографии.
Амниотическую жидкость используют для биохимических исследований
(генные мутации), а клетки хориона и плода - для цитогенетических исследований
18
(хромосомные и геномные мутации). Методы позволяет диагностировать
различные мутации в ранние сроки беременности.
Фетоскопия проводится на 18-22 неделях беременности фиброоптическим эндоскопом, вводимым под местным обезболиванием в полость амниона через брюшную стенку матки.
Метод позволяет осмотреть плод, плаценту, пуповину и взять кровь плода из пуповины для диагностики наследственных болезней крови.
Недостаток метода - узкое поле зрения (ограничивает визуальную диагностику патологии плода). В 5-10% возможен выкидыш.
В Беларуси прямые инвазивные методы проводятся в Минске, Гомеле
и Могилеве. Ежегодно выполняется около 4000 исследований.
19