аллельный полиморфизм генов hla класса ii в казахской
реклама
ФГБУ «ГНЦ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФМБА РОССИИ На правах рукописи Куранов Александр Борисович АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ HLA КЛАССА II В КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ И ЕГО ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ И ТУБЕРКУЛЁЗЕ 03.03.03 – иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, Болдырева Маргарита Николаевна доктор биологических наук, доцент Момыналиев Куват Темиргалиевич Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 6 Актуальность темы исследования ................................................................................. 6 Цель исследования .......................................................................................................... 7 Задачи исследования ....................................................................................................... 7 Научная новизна .............................................................................................................. 8 Научно-практическая значимость исследования ......................................................... 8 Объем и структура диссертации .................................................................................... 9 Благодарности .................................................................................................................. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 11 1.1 Главный комплекс гистосовместимости человека (HLA-комплекс) ................. 11 1.2 Номенклатура HLA ................................................................................................. 15 1.3 HLA-полиморфизм .................................................................................................. 18 1.4 HLA-полиморфизм и связь с заболеваниями ....................................................... 19 1.4.1 Ассоциация HLA с инфекционными заболеваниями ....................................... 21 1.4.1.1 Иммуногенетика синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) .... 21 1.4.1.2 Иммуногенетика гепатита ................................................................................ 24 1.4.1.3 Иммуногенетика малярии ................................................................................ 25 1.4.1.4 Иммуногенетика туберкулёза .......................................................................... 26 3 1.4.2 Ассоциация HLA с аутоиммунными заболеваниями ....................................... 28 1.4.2.1 Ассоциация с органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями ... 28 1.4.2.2 Ассоциация с системными аутоиммунными заболеваниями ....................... 30 1.4.2.3 Иммуногенетика ревматоидного артрита ....................................................... 33 1.5 Популяционный полиморфизм генов HLA .......................................................... 34 1.6 Этногеографическая характеристика казахской популяции .............................. 37 1.7 Заключение .............................................................................................................. 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 40 2.1 Материалы и оборудование ................................................................................... 40 2.1.1 Среды и растворы ................................................................................................. 40 2.1.2 Оборудование ....................................................................................................... 40 2.2 Методы исследования ............................................................................................. 41 2.2.1 Выделение геномной ДНК .................................................................................. 41 2.2.2 Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК ...................... 41 2.2.3 Очистка ПЦР-продуктов ..................................................................................... 42 2.2.4 Очистка продуктов амплификации для ПЦР-секвенирования........................ 42 2.2.5 Секвенирование и анализ последовательностей ДНК ..................................... 43 2.2.6 Применение методов клонирования при определении HLA- генотипа ......... 43 2.2.7 Компьютерный анализ последовательностей ................................................... 44 4 2.3 HLA-генотипирование ............................................................................................ 46 2.4 Характеристика обследованных групп ................................................................. 47 2.4.1 Здоровые представители казахской популяции ................................................ 47 2.4.2 Популяции для межпопуляционного анализа ................................................... 48 2.4.3 Пациенты с диагнозом легочный туберкулёз (ЛТБ) ........................................ 48 2.4.4 Пациенты с диагнозом ревматоидный артрит (РА) .......................................... 50 2.5 Статистический анализ ........................................................................................... 51 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................................................... 54 3.1 Полиморфизм генов HLA II класса в казахской популяции .............................. 54 3.1.1 Распределение аллелей генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1........................... 54 3.1.2 Идентификация новых HLA-аллелей ................................................................. 57 3.1.3 Гаплотипы HLA-DRB1-DQA1-DQB1 ................................................................ 59 3.1.4 Генетические расстояния между казахской популяцией и другими этническими группами ................................................................................................. 62 3.2 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к легочному туберкулёзу .................................................................................................................... 66 3.2.1 Ассоциации аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с легочным туберкулёзом.................................................................................................................. 66 3.2.2 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с легочным туберкулёзом. ..... 71 5 3.2.3. Ассоциации аллелей HLA с мультирезистентным и монорезистентным легочным туберкулёзом. ............................................................................................... 72 3.3 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к ревматоидному артриту............................................................................................................................ 75 3.3.1 Ассоциации групп аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с ревматоидным артритом ............................................................................................... 75 3.3.2 Ассоциации аллелей HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 с ревматоидным артритом. ........................................................................................................................ 78 3.3.3 Ассоциации генотипов HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 с ревматоидным артритом. ........................................................................................................................ 79 3.3.4 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с ревматоидным артритом ..... 80 3.3.5 Мета-анализ ассоциаций HLA-DRB1 с ревматоидным артритом .................. 83 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .............................................................. 87 4.1. Межпопуляционный аспект HLA-полиморфизма. ............................................. 87 4.2 HLA-полиморфизм и восприимчивость к легочному туберкулёзу. .................. 91 4.3 HLA-полиморфизм и восприимчивость к ревматоидному артриту. ................. 93 4.4 Заключение .............................................................................................................. 98 ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 99 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 100 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 101 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Иммунная система, возможно, наиболее сложная система человеческого организма, состоящая из огромного количества клеток и растворимых медиаторов, которые скоординированно противодействуют патологическим изменениям собственных белков и проникновению в организм микроорганизмов, возбудителей инфекций. В настоящее время известно, что развитие многих заболеваний, включая злокачественные опухоли, зависит от иммуногенетического статуса, различных регуляторных механизмов иммунной системы, таких как толерантность, иммуносупрессия и т.д. Соответственно, существует большая проблема, уточнить генетические факторы, предопределяющие патологический процесс, чтобы в будущем использовать полученные данные в борьбе с заболеваниями. Главный комплекс гистосовместимости (HLA-комплекс) играет ключевую роль в иммунной системе человека [1,2,3,4,5,6,7]. На сегодняшний день установлено большое количество ассоциаций между HLA-аллелями и многими заболеваниями [3,8,9,10,11,12], которые часто различаются в генетически отличающихся друг от друга группах населения. Поэтому установление взаимосвязей между HLA, другими высоко полиморфными молекулами иммунной системы, такими как KIR, LILR и тд. [13,14], и иммунозависимыми заболеваниями имеет важное значение для каждой отдельной популяции [3,11,12,15]. Первые популяционные исследования HLA-комплекса были выполнены более 40 лет назад, в результате чего появилась возможность проведения сравнительного анализа частот аллелей, неравновесного сцепления между HLAгенами для различных групп населения. Эти исследования, в свою очередь, продемонстрировали обширную географическую вариабельность HLA-генов [16,17,18], стали первыми иммуногенетическими доказательствами миграционной истории человека и на основании которых было сформировано понятие "классические" полиморфные гены [19]. 7 Исследования HLA-полиморфизма в группах населения с разным этническим составом являются необходимой основой для развития нескольких направлений: популяционная диагностика заболеваний, прикладное значение генетика, идентификация развития этих клиническая личности. направлений трансплантология, Фундаментальное делают и актуальными исследования HLA-разнообразия в популяциях Казахстана. Предыдущие исследования показали, что аллели HLA класса II могут поразному влиять на восприимчивость к заболеваниям, специфично для каждой отдельной популяции. В настоящее время известны ассоциации между молекулами HLA класса II и социально-значимыми заболеваниями, в том числе ревматоидный артрит и туберкулез. Цель исследования Изучить полиморфизм генов HLA II класса (HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1) у казахов в норме, при туберкулёзе и ревматоидном артрите. Определить генетические расстояния между казахской популяцией и некоторыми мировыми популяциями на основании частот HLA-генов. Задачи исследования 1. Оценить полиморфизм генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 и их гаплотипов среди представителей казахской популяции. 2. Определить генетические расстояния между казахами и мировыми популяциями на основе полиморфизма гена HLA-DRB1. 3. Оценить полиморфизм генов HLA-DRB1, -DQB1, -DQA1 и их гаплотипов у пациентов с туберкулёзом легких (ЛТБ) в казахской популяции. 4. Оценить полиморфизм генов HLA-DRB1, -DQB1, -DQA1 и их гаплотипов у пациентов с ревматоидным артритом (РА) в казахской популяции. 8 Научная новизна В диссертационной работе впервые проведен анализ аллельного полиморфизма генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1, а также трехлокусных гаплотипов (DRB1-DQA1-DQB1), представителей казахской на популяции уровне на высокого основе разрешения у ДНК-секвенирования. Установлены HLA-DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипы, которые, могут являться специфичными для казахской популяции. Впервые на основе частот генов HLA класса II рассчитаны генетические расстояния между исследованной популяционной группой казахов и различными мировыми популяциям, которые продемонстрировали влияние на генофонд казахов популяций Европы, Азии и Сибири. Наиболее близкими по распределению аллельных частот гена DRB1 казахи оказались к популяциям Азии и Сибири: монголы, тувинцы, тоджа и т.д. Идентифицированы 7 новых аллелей гена HLA-DRB1: DRB1*03:56, DRB1*03:57, DRB1*13:102, DRB1*13:02:04, DRB1*13:103, DRB1*11:04:06 и DRB1*14:12:02 (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/). Установлено, что аллели HLA-DRB1*08:01, -DRB1*08:03 и -DQA1*03:02 (P<0.05) и гаплотип DRB1*08:03-DQА1*01:03-DQВ1*06:01 (P<0.05) ассоциированы с восприимчивостью к легочному туберкулёзу у представителей казахской популяции. Показано, что аллель HLA-DRB1*04:01 (P<0.05) и гаплотип DRB1*04DQA1*03-DQB1*03 (P<0.05) ассоциирован с предрасположенностью к ревматоидному артриту, а аллель HLA-DRB1*13:01 – с устойчивостью к данному заболеванию у представителей казахской популяции. Научно-практическая значимость исследования Данные о частотном распределении аллелей генов HLA-DRB1, -DQA1, DQB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 среди лиц, принадлежащих к казахской популяции, могут быть использованы в качестве контрольных при проведении 9 исследований по проблеме «HLA и болезни» в данной популяции, а также для формирования регистров доноров гемопоэтических стволовых клеток. Полученные данные об ассоциации аллелей генов HLA II класса с генетической предрасположенностью к развитию ревматоидного артрита и легочного туберкулёза могут быть использованы для генетического прогнозирования и дифференциальной диагностики в семьях пациентов с соответствующими болезням для выявления лиц, имеющих повышенный риск развития легочного туберкулёза и ревматоидного артрита. В свою очередь, это будет способствовать повышению эффективности профилактики данных заболеваний в казахской популяции. Представленные материалы могут быть использованы в образовательном процессе для студентов медицинских ВУЗов, в учебных программах повышения квалификации на факультетах последипломного образования и в практическом здравоохранении. Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, глава с описанием материалов и методов исследования, глава с результатами собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список сокращений, список использованной литературы. Список литературы включает 21 отечественных и 280 зарубежных источников. Рукопись содержит 8 рисунков и 24 таблицы. Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность генеральному директору Национального профессору центра биотехнологии Раманкулову Е.М., и Республики коллегам Казахстан Национальной (НЦБ РК) лаборатории коллективного пользования НЦБ РК за ценные комментарии и полезные замечания, полученные во время обсуждений различных материалов исследования. 10 Среди них: к.б.н. Жолдыбаева Е.В., д.м.н. Акильжанова А.Р., Искакова А.Н., к.б.н. Кожамкулов У.А., к.б.н. Шевцов А.Б., Кулмамбетова Г.Н. Большое влияние на направление исследований в разное время оказали совместная работа и творческие контакты с проф. Мюллер К. (Müller CA), проф. д.м.н. Абильдиновой Г.Ж., проф. д.м.н Абишевой С.Т., Вавиловым М.Н. Автор приносит благодарность им и всем, кто содействовал выполнению этой работы. Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям д.м.н. Болдыревой М.Н. и д.б.н. Момыналиеву К.Т., без которых данная работа не могла состояться. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Главный комплекс гистосовместимости человека (HLA-комплекс) Главный комплекс гистосовместимости человека, HLA (Human Leukocyte Antigen - человеческие лейкоцитарные антигены) представляет собой кластер, содержащий сотни генов [1,2,3,6,7,20], размером около 3500 kb (тысяч пар оснований), располагается на коротком плече хромосомы 6 и является одним из самых сложных регионов в геноме человека с высоким уровнем полиморфизма [8, 21, 22]. Молекулы HLA делятся на два основных класса: класс I (HLA-А, -В и -С) и класс II (HLA-DRB1, -DQB1, -DQА1 и -DPB1), которые кодируются в разных регионах главного комплекса гистосовместимости [1,2,3,6,7]. Локусы I класса HLA-A, -B и -C участвуют в иммунном ответе, взаимодействуя с цитотоксическими Т-клетками; локусы класса II (HLA-DR, -DQ и –DP) играют важную роль в клеточном иммунитете, взаимодействуя с Тхелперами [1,2,3,6,7,23]. В регионе между генами HLA класса I и II расположены многие гены, не связанные с HLA-комплексом, кодирующие белки, также участвующие в иммунном ответе: фактор некроза опухоли (ФНО), лимфотоксин-альфа (LTA), комплемент С4 (C4a и C4b) и бутирофилин-подобный белок 2 (Butyrophilin-like protein 2 -BTNL2) [2,5,24,25,26,27]. Третий класс системы HLA (класс III) включает в себя гены, контролирующие синтез белков, являющихся частью системы комплемента, цитокины, белки теплового шока и фермент 21-ОН гидроксилазу, большинство из которых также участвуют в иммунном ответе [1,2,5,27]. Молекулы класса I взаимодействуют с Т-клеточным рецептором (TCR), а также иммуноглобулиноподобными рецепторами киллерных клеток (КIR), которые экспрессируются на поверхности естественных киллерных клеток (NK) и некоторых Т-клеток [2,3,5,7,13]. 12 Структурная карта главного комплекса гистосовместимости человека представлена на рисунке 1. Рисунок 1. Карта главного комплекса гистосовместимости (Источник:.http://www.cixip.com/index.php/page/content/id/156). (HLA) Область HLA класса II содержит три локуса, DR, DQ и DP, каждый из которых состоит из переменного количества α-и β-цепей генов [1,2,3,6,7]. Локусы HLA класса II с известными функциональными белковыми продуктами выделены жирным шрифтом. В случае DR - в различных гаплотипах присутствует различное число DRB-генов, некоторые из которых являются нефункциональными псевдогенами (γ). DQ и DP субрегионы содержат по паре функциональных α и β цепей генов [1,2,3,6,7]. В области HLA I класса, находятся "классические" гены HLA-A, HLA-B, HLA-C и "неклассические" гены I класса, такие как MICB, HLA-E и HLA-G. В 13 центре области, занимаемой HLA-генами, располагаются гены, также связанные с функцией иммунного ответа, в том числе компоненты комплемента (C4A, C4B, С2 и фактора В), а также факторы некроза опухоли (TNF-α и -β). На схеме не показаны более 100 генов, многие из которых также расположены в центральной части HLAобласти [1,2,3,6,7]. Молекулы HLA класса I представляют собой трансмембанные гетеродимеры, которые прикрепляются к клеточной мембране тяжелой полиморфной альфацепью, к которой на внеклеточной части прикрепляется неполиморфная цепь β2микроглобулина (Рисунок 2). Генетическая локализация β2-микроглобулина находится за пределами HLA, на хромосоме 15. В то время как аминокислотная последовательность клеточной мембраны альфа-домена 3 является довольно постоянной, домены альфа-1 и 2 представлены гипервариабельными регионами, на которых и базируется полиморфизм класса I, участвующими в связывании антигенных пептидов паратопа, антиген-связывающего центра антитела [28,29,30]. Молекулы HLA класса I экспрессируются на всех ядросодержащих клетках, но в различной степени. Функция молекул HLA класса I заключается в презентации пептидов из собственных внутриклеточных белков и пептидов из вирусов, проникших в клетку, для Т-клеточного рецептора (TCR) на CD8+ Т-клетках (цитотоксических), участвующих в иммунном механизме, который разрушает клетки, измененные или зараженные вирусом [28,29,30]. Молекулы HLA класса I взаимодействуют также с киллер-ингибирующими рецепторами (KIR), которые экспрессируется на поверхности естественных клеток киллеров (NK-клеток), что приводит к торможению их клеточной активности [7,31,32]. 14 Рисунок 2. Схематичное сравнение структуры молекул HLA класса I и класса II. Молекула I класса образована α1 и α2 доменами, а молекула класса II образована α1 и β1 доменами (Источник: http://www.cixip.com/index.php/page/content/id/156). Распределение антигенов HLA класса II в тканях ограничивается иммунокомпетентными клетками, такими как макрофаги, активированные Тлимфоциты и В-лимфоциты. Существуют три типа HLA-молекул класса II: HLADR, HLA-DQ, HLA-DP, которые кодируются генами в различных регионах хромосомы 6. Каждый тип молекул содержит различное число аллелей для альфа и бета-цепей [1,2,3,6,7,33]. Молекулы класса II состоят из двух трансмембранных полипептидов, альфацепи и бета-цепи (Рисунок 1). Бета-цепь является гораздо более полиморфной, чем альфа-цепь. По этой причине в настоящее время исследования HLA-генов класса II направлены в основном на изучение полиморфизма бета цепи (HLA-DRB1, HLADRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 и HLA-DPB1) [34]. 15 Классические гены HLA, экспрессирующие высокополиморфные молекулы, характеризуются полигенностью и кодоминантностью, когда в одной клетке экспрессируются материнские и отцовские гены [1,2,3,6,7]. Сочетание полигенности и полиморфизма каждого из генов, главная функция которых представление пептидов антигенов клеткам собственной иммунной системы, гарантирует, что каждый человек будет иметь возможность представить широкий спектр пептидов и что каждая из популяций и человечество в целом будет состоять из лиц, представляющих пептиды (то есть имеющих возможность ответить на них адаптивным иммунным ответом) практически безграничного спектра [35]. HLA-комплекс первоначально был идентифицирован благодаря своей ведущей роли в отторжении трансплантата [36]. Признано, что высокополиморфные гены HLA класса I и II являются одними из важнейших компонентов адаптивного иммунного ответа. Различные гены HLA вовлечены в этиологию заболеваний, включая, такие сложные аутоиммунные заболевания, как диабет 1 типа, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Ходжкина; а также в чувствительность к таким инфекционным заболеваниям, как малярия и СПИД [3,8,9,10,11,12]. 1.2 Номенклатура HLA Актуальная версия специализированной базы данных последовательностей HLA (3.21.2015-07 из ''IMGT/HLA Database''), номенклатурного комитета по HLAсистеме Всемирной Организации Здравоохранения представлена на сайте http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla. По действующей номенклатуре на июль 2015 года общее количество идентифицированных аллелей для классических генов HLA составило 13412 [37]. Номенклатурный Комитет по факторам системы HLA (WHO) устанавливает руководящие принципы для обозначения как существующих, так и новых генов, аллелей и серологических специфичностей HLA [38]. В таблице 1 представлено актуальное распределение аллелей по локусам классических генов HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla). 16 Таблица 1. Распределение аллелей по классическим генам HLA (от 31.07.2015) Гены HLA I класса Гены A B C E F G Аллели 3192 3977 2470 17 22 50 Белки 2245 2938 1941 6 4 16 “N” Аллели 150 128 89 1 0 2 Гены HLA II класса Гены DRA DRB1 DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 Аллели 7 1764 54 807 40 550 Белки 2 1290 32 539 20 447 “N” Аллели 0 39 1 20 0 15 Обозначение HLA-специфичности включает название гена, локуса и числа. Число обозначает конкретный вариант гена, аллель, например, DRB1*07:01. Название гена и номер аллеля разделяются друг от друга значком "*". Серологические методы HLA-типирования не позволяют определять тонкие различия между HLA-молекулами, что необходимо для идентификации аллеля, это можно сделать только на молекулярном уровне. На серологическом уровне можно выявить только выраженные различия между HLA-молекулами. Это низкий уровень разрешения HLA-тиипирования (2 цифры, группа аллелей). Типирование различных аллелей на высоком уровне разрешения обеспечивает возможность установления до 4 и более цифр для конкретизации названия аллеля: первые две цифры обозначают группу аллелей, которая соответствует определенному антигену, две последующие цифры обозначают аллель, 5 и 6 цифры указаны для дифференциации вариантов аллелей (Таблица 2). 17 Таблица 2. Номенклатурное обозначение аллелей. HLA-DRB1 Обозначение локуса (гена) *07: Группа аллелей 01: Аллель 01:01 Вариант аллеля Пятая и шестая цифры добавляются для обозначения вариантов аллелей, которые содержат молчащие замены в кодирующей последовательности, не меняющие аминокислотной последовательности [39]. Так, например, аллель DRB1*14:01 имеет два варианта последовательностей ДНК, поэтому чтобы их различить эти два варианта обозначают, соответственно, как DRB1*14:01:01 и DRB1*14:01:02. После номера аллеля, в случае отсутствия его экспрессии, указывают «N». Отсутствие экспрессии, возможно, свидетельствует о серологических "пробелах" по сравнению с молекулярным типированием. Так, например, аллель DRB1*01:39N не экспрессирует белок и, следовательно, не обнаруживается серологически (пустая или нулевая аллель), но на уровне ДНК он может быть обнаружен. В какой степени это имеет клиническое значение неизвестно, необходимо продолжение исследований. Номера с пятого по седьмой обозначают различия последовательностей во вне кодирующей области (в интроне, например, HLA-DRB1*07:01:01:01). Использование молекулярно-биологических методов (в основном, благодаря ДНК-секвенированию), позволяет каждый день обнаруживать все новые варианты HLA-генов: новые аллели и их подтипы, причем для некоторых из которых нет серологических эквивалентов. В настоящее время База данных Комитета IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla) еженедельно пополняется новыми аллелями HLA. В указанной базе данных хранится информация последовательностях аллелей, утвержденных о нуклеотидных Номенклатурным Комитетом. Обновленный список аллелей регулярно публикуется в журналах Tissue Antigens, Human Immunology и European Journal of Immunogenetics [11]. 18 1.3 HLA-полиморфизм Целесообразность популяциях исследования обусловлена HLA-полиморфизма необходимостью расшифровки в человеческих биологических механизмов, которые участвуют в адаптивном иммунном ответе у человека. Тем не менее, лишь немногие мировые популяции исследованы с помощью HLAтипирования. Распределение частот конкретных аллелей и гаплотипов колеблется среди различных групп населения и этнических групп. На сегодняшний день число зарегистрированных аллелей растет в геометрической прогрессии, поскольку новейшие молекулярно-биологические методы позволяют наиболее точно идентифицировать HLA-последовательности [11,40]. Большинство новых аллелей обнаруживаются лишь однократно, у большинства из них идентифицированы лишь экзоны, то есть кодирующие домены, хотя для других вариантов HLA-генов известны нуклеотидные последовательности и других областей [41]. Под популяцией принято понимать сообщество лиц, способных к воспроизводству, населяющее определенный географический регион. Совокупность генов и их аллельный полиморфизм составляет генофонд данной популяции. Различные группы населения Земли отличаются друг от друга по составу их генофонда. Изменения генофонда популяций могут происходить в результате исторических и природных событий. В образовании новых популяций, как правило, большую роль играют следующие факторы: мутации, естественный отбор, дрейф генов, миграция населения [42,43]. В результате этих естественных процессов разные популяции могут иметь различное частотное распределение аллелей полиморфных генов. Такие различия между популяциями особенно характерны для HLA-аллелей. Информация о распределении HLA-аллелей в конкретных популяциях представляет не только научный интерес точки зрения этнологии и эволюции человека, но также важно и для развития медицины, в частности таких направлений как трансплантация органов и иммуногенетика заболеваний. 19 Для анализа генофонда человека как вида, а также изучения генетических изменений в популяциях было разработано правило Харди-Вайнберга [43]. Этот закон помогает корректно оценить распределение HLA-специфичностей в популяции. Существенной характеристикой HLA-комплекса является также такой показатель, как неравновесное сцепление (LD) между HLA-аллелями из различных локусов [44,45], в результате чего исследование маркерных генов помогает определить связь заболевания не с одним, а с двумя и более генами. Неравновесие по сцеплению образуется, когда генофонде в результате мутаций, потока генов появляются новые аллели. Посредством рекомбинации новые аллели распределяются на различных гаплотипах таким образом, что с течением времени достигается баланс их распределения в популяции, причем чем меньше расстояние между двумя локусами, тем на более длительный срок устанавливается этот баланс. Однако точные механизмы формирования и поддержания неравновесного сцепления HLA-алеллей I и II класса, особенно между HLA-DRB1 и -DQB1 до сих пор неизвестны [46]. 1.4 HLA-полиморфизм и связь с заболеваниями Гены HLA являются одними из основных факторов, определяющих восприимчивость к аутоиммунным и инфекционным заболеваниям, участвуя в реализации иммунного ответа [9,10]. В таблице 3 представлены некоторые заболевания имеющие статистически достоверные ассоциации с HLA (P<0.05). Таблица 3. Ассоциации HLA класса I и класса II c заболеваниями. Заболевание HLA аллель Источник 1 2 3 Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани Болезнь Бехтерева / HLA-B27 [47] анкилозирующий спондилоартрит Синдром Рейтера / HLA-B27 [48] реактивный артрит 20 продолжение таблицы 3 1 Синдром Фелти Болезнь Бехчета Cистемная склеродермия (ССД) 2 DRB1*04:01 HLA-B*51 DRB1*11:04, DQA1*05:01, DQB1*03:01, DRB1*08:04, DQA1*05:01 и DQB1*03:01 DRB1*03:01 3 [49] [50] [51] Системная красная волчанка [52] (СКВ) Нервно-мышечные заболевания Миастения DRB1*14, DRB1*16, DQB1*05, [53] DQB1*05:02 Рассеянный склероз HLA-DRB1, HLA-DR15, гаплотип [54] DRB1*15:01-DQA1*01:02DQB1*06:02-DRB5*01:01 Синдро́м Гийе́на — Барре́ HLA-DRB1*03:01, DRB1*07:01, [55] DRB4*01:01, и HLA DR3, DR7 Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ Тиреоидит Хашимото HLA-DR3, HLA-DQ*2, HLA-DR5 [56] Болезнь Аддисона DR3-DQ2/ DRB1*04:04-DQ8 [57] (надпочечниковая недостаточность) Болезнь Грейвса HLA-B*35:01, HLA-B*46:01, HLA[58] DRB1*14:03, HLA-DPB1*05:01 Cахарный диабет I типа DRB1*03, DRB1*04 [59] Болезни кожи и подкожной клетчатки Витилиго HLA-A*02:01 [60] Вульгарная (обыкновенная) HLA-DRB1*04:02 [61] пузырчатка Герпетиформный дерматит HLA-DQB1*02:01 [62] Дюринга Болезни системы кровообращения Синдром Кавасаки HLA-B35, -B75, -Cw09 и HLA[63] DRB1*11, HLA-DRB1*09 Синдром Чардж HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*07, [64] HLA-DRB1*09 Геморрагический васкулит HLA-DRB1*01 [65] Болезни органов пищеварения Стеатогепатит HLA-DQB1*06:04 [66] Целиакия DQA1*05, DQB1*02, DQ8, [67] Болезнь Крона DRB1*04:05, DRB1*04:10, DQA1*03, [68] DQB1*04:01, DQB1*04:02 21 окончание таблицы 3 1 2 Инфекционные заболевания (бактерии или вирусы) Вирус иммунодефицита HLA-B*40:06, HLA-DRB1*15:01 и человека (HIV) DRB1*15:02 Папилломавирус человека DQB1*03:01, DRB1*11:01, (HPV) DRB1*07:01, DQA1*02:01 Болезнь Лайма (клещево́й HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*17(03) боррелио́з) Новообразования Колоректальный рак DRB1*13:01 Глиома HLA-A*25, HLA-B*27, HLADRB1*15 Неходжкинские лимфомы HLA-A*26 Болезни мочеполовой системы Синдром Гудпасчера HLA-DRB1*15:01 и DRB1*15:02 Гломерулонефрит HLA-A*23, A*25, B*15, B*40, B*53 и DR*18 3 [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] 1.4.1 Ассоциация HLA с инфекционными заболеваниями 1.4.1.1 Иммуногенетика синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) С генетической точки зрения, HLA-система, вероятно, является одним из основных механизмов отвечающих за разнообразие клинических форм некоторых инфекционных заболеваний [9,10,77]. Это может быть связано с тем, что различные аллельные варианты HLA-молекул участвуют в иммунном ответе по-разному, тем самым играя важную роль в резистентности или восприимчивости к инфекционным заболеваниям [9,10]. Для эффективного иммунного ответа в отношении конкретного инфекционного агента, HLA-молекулы должны образовать комплекс с пептидами, происходящими из этого патогена, и индуцировать Т-клетки, которые могут быть активированы только комплексом HLA-пептид [6,7]. По-видимому, полиморфизм HLA-комплекса является преимуществом для организма. Как известно, некоторые из HLA-аллелей, связаны с устойчивостью к нескольким смертельным заболеваниям, например, ассоциация 22 HLA-B*27, HLA-B*51 и HLA- B*57 - с лучшим прогнозом развития СПИДа ("синдром приобретенного иммунодефицита") [23,78,79,80,81,82,83]. Дополнительным доказательством важной роли HLA-генов служат также данные о том, что у индивидуумов, у которых HLA-молекулы не функционируют должным образом, может проявляться дефектный иммунный ответ на патогенные микроорганизмы [14]. Восприимчивость к инфекционным заболеваниям может быть связана с недостатками функционирования на нескольких уровнях HLA-системы. Человек, имеющий определенное сочетание HLA-аллелей, которые не связываются должным образом с пептидом/ами инфекционного агента, и таким образом, не вызывают адекватную реакцию со стороны лимфоцитов, будет менее эффективно сопротивляться в отношении инфекционных агентов, чем человек, который не имеет этих недостатков [11]. Наоборот, у пациентов, у которых HLA обеспечивает защиту, комплекс HLA-пептид, вероятно, более надежно стимулирует Т-клетки, которые размножаясь, ликвидируют проникших в организм инфекционных возбудителей посредством синтеза воспалительных цитокинов или путем уничтожения инфицированных клеток [79]. HLA-полиморфизм значительно варьируется в этнически разных группах населения. Исследования показывают, что аллели, придающие устойчивость к определенным инфекционным возбудителям, преобладают среди населения в районах, где эти инфекционные возбудители вызывают эндемичные заболевания. Высокая устойчивость к инфекционным заболеваниям наблюдается у лиц, которые гетерозиготны по конкретным аллелям HLA потому, что гетерозиготные индивидуумы имеют возможность представлять более широкий спектр пептидов инфекционного происхождения для индукции Т-лимфоцитов [11, 80]. Разные HLA-аллели также различаются и по роли, которые они играют в патогенезе заболеваний [10]. Геномный анализ семей, в которых зафиксированы несколько случаев инфекции определенного типа, часто используется для выявления генетических локусов, от которых зависит восприимчивость к этим заболеваниям [11]. 23 Генетические исследования инфекционных заболеваний не только позволяют лучше понять механизмы развития заболеваний, они также могут помочь в разработке новых вакцин. Так, некоторые HLA-аллели связаны с лучшим исходом инфекции, например, HLA-B*53 - при малярии, эффективно представляя патогенные пептиды Т-лимфоцитам, тем самым способствуя их более сильной цитотоксической реакции. В то же время другие аллели, например, HLA-B*35, наоборот, ассоциированы с быстрым прогрессированием СПИДа у ВИЧ-инфицированных лиц. Имеются доказательства того, что сниженная цитотоксическая способность Тлимфоцитов обусловлена сниженной способностью связывания этими аллелями пептидов [27,78,79]. ВИЧ (вирус ретровирусом с иммунодефицита разрушительным человека) является воздействием на цитопатическим иммунную систему. Прогрессирование ВИЧ-инфекции происходит за счет выхода иммунного ответа из-под контроля цитотоксических Т-лимфоцитов [23,81,82,83]. Оказалось, что некоторые аспекты восприимчивости к болезни связаны с HLA-молекулами. Есть предположение, что вирус способен уйти от иммунного ответа, и существует больше шансов на его передачу от больных здоровым лицам с аналогичными HLAгенотипом, чувствительным к заражению ВИЧ. В то же время индивидуумы, которые имеют другие, отличающиеся от чувствительных к заражению ВИЧинфекцией HLA-генотипы, возможно, способны лучше реагировать на вирусное вторжение. Субъекты, гетерозиготные по HLA-аллелям лучше реагируют на вирусные инфекции, вероятно, по причине их способности представить Тлимфоцитам большее число вирусных антигенов [23,83]. Установлено, что аллели HLA-B*35, в частности HLA-B*35:01, которые находятся недалеко от HLA-Cw*4 в HLA-комплексе, ассоциированы с быстрой прогрессией СПИДа [80,84,85], а аллели HLA-B*57, HLA-B*14, HLA-C*08, и, главным образом, HLA-B*27, наоборот, отрицательно связаны с прогрессированием болезни, и, возможно, являются одним из защитных факторов [27,79,80,81]. Вероятно, указанные варианты HLA-генов кодируют HLA-молекулы, 24 которые распознают вирусные эпитопы, являющиеся основной частью структуры вируса, поэтому лица с данными аллелями HLA-генов, могут иметь более эффективную иммунную защиту против ВИЧ [81]. С HLA-генами связана чувствительность к вертикальной передаче ВИЧинфекции между матерью и плодом. Аллели HLA-B*18 связаны со значительно более низким риском ранней передачи ВИЧ-1. Наоборот, увеличение риска заражения ВИЧ наблюдается у детей, которые имеют аллель HLA-А*29 [86]. Вероятность передачи ВИЧ-инфекции увеличивается, если плод или новорожденный имеет аллель HLA-DRB1*03:01:01, в то время как антиген HLADR13 и аллель HLA-DRB1*15:01 повышают возможность защититься от инфекции [87]. Развитие некоторых оппортунистических инфекций при СПИДе также связано с HLA-генами. Так, например, аллель HLA-A*36:01 был ассоциирован с большим риском развития туберкулёза у ВИЧ-положительных пациентов [88]. На основании проведенных исследований было сделано предположение, что HLAA1,-В8, DR3-антигены являются защитными факторами против таких инфекций, как цитомегаловирус и Mycobacterium avium у ВИЧ-инфицированных пациентов с тяжелым состоянием иммунодефицита и которые еще не были подвержены высокоэффективной антиретровирусной терапии [89]. Хотя большинство подобных исследований проводится относительно ВИЧ-1, были получены доказательства того, что прогрессирование инфекции ВИЧ-2 также связано с HLAгенами: больший риск прогрессирования СПИДа наблюдали при наличии аллеля HLA-B*35 и гаплотипов HLA-B*35-Cw*4 и HLA-А*23-Cw*7 [90]. 1.4.1.2 Иммуногенетика гепатита Другой социально значимый важный вирус, вирус гепатита В передается, главным образом, парентерально. Половой путь менее распространен. В 5-10% случаев заболевание может перерасти хроническую их форму [91]. По-видимому, есть несколько причин, от которых зависит большая склонность некоторых людей 25 к хронизации заболевания. Такими, наиболее значимыми факторами могут быть ко-инфекция с ВИЧ, иммуносупрессия, мужчины-гомосексуалисты, преклонный возраст в момент инфицирования и HLA-гены [83]. Судя по имеющейся информации, у лиц, которые излечились от гепатита В, развивается более сильный ответ Т-клеток, в то время как у пациентов с хроническим заболеванием развивается слабый клеточный ответ. Было показано, что это связано с конкретными вариантами HLA I и II класса [92]. Оказалось, что аллели HLADRB1*13:02 [91,93] и -*03:01 [91] ассоциированы с большей способностью к успешной ликвидации вирусной инфекции, а развитие инфекции было связано с HLA-B*08 и гаплотипами HLA-A*01-B*08-DRB1*03,-B*44-Cw*1601 и -B*44Cw*05:01 [91]. По другим данным аллели HLA-DRB1*03:01, -DQA1*05:01 и DQB1*03:01, были связаны с хронизацией болезни, в то время как аллели HLADRB1*11:01, -DRB1*11:04 и -DQA1*03:01 - с меньшей вероятностью перехода болезни в хроническую форму [91]. Среди турецкого населения, HLA-A24 и -CW1 антигены были признаны как ассоциированные с более низким риском развития хронического заболевания печени, по сравнению с HLA-B13, -В8, -DR7, DR13 и DQ3 [94]. Среди корейского населения HLA-антиген DR6, и более конкретно DR13, был связан с самоограничением гепатита В [95]. 1.4.1.3 Иммуногенетика малярии Малярия является инфекционным заболеванием, которое вызывает внутриклеточный простейший из рода Plasmodium. Есть предположение, что гены, расположенные в HLA-комплексе, защищают население в эндемичных районах против тяжелых форм болезни, вызываемой Plasmodium falciparum. В Таиланде увеличение частоты HLA-B46 и B56- антигенов и HLA-DRB1*10:01 аллелей были обнаружены в группе пациентов с тяжелыми формами, не-мозговой и церебральной малярии [96]. Установлена ассоциация HLA-B53 антигена с устойчивостью к тяжелым формам болезни. Наличие данного антигена обусловливает сокращение риска смерти на 40% [9,10]. Гаплотип HLA- 26 DRB1*13:02-DQB1*05:01 также ассоциирован с устойчивостью к тяжелым формам заболевания [10]. Считается, что эта ассоциация связана с паразитарными антигенами, имеющими значение для печеночной стадии болезни, и это можно учитывать при разработке вакцин, путем использования пептидов этого антигена в качестве одного из ее компонентов [97]. HLA-пептидные вакцины (эпитопные), которые содержат HLA-эпитопы Т-лимфоцитов, представляют собой новый и многообещающий подход к иммунизации. В последние годы исследования по разработке HLA-пептидных вакцин для лечения опухолей и для профилактики вирусных, бактериальных и паразитарных индуцированных инфекционных заболеваний существенно продвинулись [98,99]. В Индии, в районах эндемичных для малярии, было обнаружено увеличение частоты HLA-A3,-B27 и B49-антигенов и HLA-DRB1*04 и -DRB1*08:09 аллелей [100]. В этой же популяции антигены HLA-A19, -A34, -B18, -B37 и аллель HLADQB1*02:03 связаны с устойчивостью к болезни [101]. Джонсон и соавторы предположили, что иммунитет против Plasmodium falciparum. изменяется в соответствии с возрастом человека [102]. Они нашли, что у детей от 5 до 15 лет, аллели HLA-DQB1*03:01 и DQB1*03:03:02 в зависимости от возраста имеют разную связь с уровнем антител против rRAP1 белков Plasmodium. Аллель HLADRB1*03:01 связан с более высоким уровнем антител к rRAP2 белкам паразита у взрослых старше 30 лет. Эти данные показывают, что влияние HLA на эволюцию инфицирования малярией имеет различия, зависящие от возраста, что иммунитет стимулируется за счет различных антигенов плазмодия, и что от HLA-генов может зависеть количество противопаразитарных антител [102]. 1.4.1.4 Иммуногенетика туберкулёза Туберкулёз развивается в результате заражения организма Mycobacterium tuberculosis. Инфицирование может привести к развитию болезни в различных органах, но наиболее распространенной формой является легочный туберкулёз. Есть предположение, что вариации к восприимчивости к туберкулёзной инфекции 27 M.tuberculosis, имеют генетическую основу связанную с полиморфизмом HLAрегиона [103,104,105,106,107]. Антиген HLA-DR2 (аллели HLA-DRB1*15:01 и DRB1*15:02) связан с развитием тяжелой и мультибациллярной формы туберкулёза, а также с большей распространенностью устойчивых к медикаментозной терапии форм [103]. HLA-DRB1*07 и -DQA1*01:01 аллелей связаны с большей восприимчивости к развитию легочного туберкулёза, в то время как HLA-DQA1*03:01 и -DQA1*05:01 аллели, ассоциированы с защитой против этой инфекции [104]. Selvaraj и др. предположил, что гетерозиготное сочетание различных антигенов HLA-DR влияет на проявление туберкулиновой реакции при туберкулёзе легких [105]. Другие исследователи установили аллели не связанные с тяжестью заболевания туберкулёзом, но связанные с предрасположенностью или устойчивостью к развитию заболевания. Так, Ravikumar выявил ассоциации аллеля HLA-DPB1*04 с устойчивостью к туберкулёзу, а DRB1*15:01 и DQB1*06:01 - с восприимчивостью к заболеванию [106]. Mehra и др. сообщили об ассоциации HLA-DRB1*15:01 аллеля с восприимчивостью к туберкулёзу, подчеркивая значимость гаплотипа HLA-DRB1*15:01-DRB5*01:01-DQA1*01:03-DQB1*06:01 [107]. Польскими исследователями было установлено, что у поляков HLA-DR16 антиген увеличивает риск развития туберкулёза, в то время как антиген HLA-DR13 защищает от болезни [108]. В Индии, результаты оказались противоречивыми: одно исследование показало, что антигены HLA-A10,-В8 и -DR2 представлены чаще у больных туберкулёзом, чем у здоровых [109], а в другом исследовании связь между HLA антигенами II класса и легочным туберкулёзом найдена не была [110]. Сароянц Л.В. с соавторами, опубликовали первые данные о распределении аллелей и гаплотипов генов HLA II класса среди больных туберкулёзом легких и у здоровых доноров казахской национальности, проживающих в Астраханском регионе России туберкулёзом и [111]. Установлена HLA-гаплотипом положительная ассоциация между DRB1-17-DQA1-05:01-DQB1-02:01 и отрицательная с DRB1-13-специфичностью. Было отмечено, также повышение 28 частоты встречаемости DRB1-08, DRB1-12, DQA1-0201, DQA1-0501, DQB1-0601. [111]. Проблема туберкулёза, несмотря на осуществление национальных и международных программ борьбы с туберкулёзом, по-прежнему является одной из основных для организаций здравоохранения [112] разных стран. Согласно докладу Ш. Исмаилова, главного специалиста Национального центра проблем туберкулёза Министерства здравоохранения Республики Казахстан (Алматы, 2009г.), в Казахстане, заболеваемость туберкулёзом (ТБ) в 2008 году составила 125,5 случая на 100 тысяч человек, а смертность составила 16,9 на 100 тысяч человек [113]. Идентификация генов, которые участвуют в процессах, обуславливающих восприимчивость или устойчивость человека к развитию легочного туберкулёза (ЛТБ) является одной из возможностей профилактики этого заболевания. 1.4.2 Ассоциация HLA с аутоиммунными заболеваниями Значение роли системы HLA в развитии HLA при аутоиммунных заболеваниях известно уже на протяжении многих лет. В настоящее время обнаружены ассоциации между определенными аллелями HLA-комплекса и инсулинозависимым сахарным диабетом, хроническим ювенильным ревматоидным артритом, рассеянным склерозом и т.п. Предложены разные гипотезы в какой именно стадии развития заболевания связь с HLA-антигенами наиболее важна. Предполагается, что у больных аутоиммунными болезнями восприимчивость к определенным аутоиммунным заболеваниям формируется в тимусе, в процессе селекции Т-клеток для образования T-клеточного репертуара [2]. 1.4.2.1 Ассоциация с органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями Болезнь Крона (БК), гранулематозное воспаление желудочно-кишечного тракта, еще одно хроническое воспалительное заболевание неизвестной этиологии, для которого найдена связь с генами HLA. В недавнем обзоре Mahdi M.B (2015) 29 [68] наиболее подробно рассмотрел важность ассоциации HLA-аллелей с болезнью Крона и показал, что HLA-ассоциации варьируются в зависимости от расовой принадлежности. Например, в японской популяции болезнь Крона имеет положительную связь с DRB1*04:05, DRB1*04:10, DQA1*03, DQB1*04:01, DQB1*04:02, а аллели DRB1*15:01, DRB1*13:02 и DQB1*06:02 отрицательно связаны с этой патологией. Немного другие данные демонстрирует французская популяция, в которой отмечено повышение частоты аллеля DQB1*05:01 и снижение DQB1*06:02/06:03 [68]. У пациентов с передним увеитом, есть данные об ассоциации заражения граммотрицательными бактериями Bartonella henselae и наличием HLA-B27 антигена [114,115]. В 2004 году Heiligenhaus и др. обнаружили связь переднего увеита с HLA-DR антигенами, но только у пациентов отрицательных по HLA-B*27 [116]. Положительная связь с HLA-DR-антигенами у отрицательных по HLA-B27 пациентов, плазматический уровень HLA-DR антигенов был значительно выше у пациентов с хроническим течением заболевания, чем у больных с острой стадией. Миастения гравис (МГ) является аутоиммунным заболеванием, характеризующееся синдромом патологической утомляемости мышц и имеющее некоторые генетические факторы, предрасполагающие его развитие. Так восприимчивость к различным формам MГ связана с рядом аллельных вариантов комплекса HLA. В недавнем исследовании была подтверждена тесная связь МГ с DQB1*05. Абсолютное отсутствие DRB1*13 аллеля в группе пациентов, может свидетельствовать о его защитной роли относительно миастении [53]. В европейских популяциях, более 95% пациентов, страдающих от сахарного диабета первого типа, имеют в генотипе аллель DRB1*03 или DRB1*04, 60% их являются гетерозиготами с генотипом DRB1*03/04 [59,117]. Отрицательная ассоциация с диабетом 1 типа, наблюдаемая у европейцев, связана с аллелями DRB1*15:01, DQA1*01:02, DQB1*06:02, однако она не подтверждается в других популяциях [59]. 30 1.4.2.2 Ассоциация с системными аутоиммунными заболеваниями Целиакия является расстройством с мультифакториальной этиологией, в котором глютен является пусковым внешним фактором, а антигены HLA-DQA1 и HLA-DQB1 выступают генетическими факторами возникновения заболевания. Известно, что 90-95% пациентов с целиакией несут DQ2.5 гетеродимеры, кодируемые группами аллелей DQA1*05 и DQB1*02, и молекулы DQ8, кодируемые DQB1*03:02 в сочетании с DQA1*03 [67]. Шарипова М. Н. (2008) установила, что у детей казахской популяции при диагностике скрытых, латентных форм целиакии необходимо учитывать наличие не только аллелей DQA1*05:01, DQB1*02:01 и DQA1*03:01, DQB1*03:02, но и DRB1*10 [118]. Пузырчатка обыкновенная (Pemphigus vulgaris), антитело-опосредованное органо-специфичное аутоиммунное расстройство. Ассоциация данного аутоиммунного заболеваний с HLA - известный феномен, например, с аллелем HLA-DRB1*04:02 [119]. Синдром Шегрена системное аутоиммунное заболевание cоединительной ткани, ассоцированное с HLA. Cогласно последнему мета-анализу, аллели DQA1*05:01, DQB1*02:01 и DRB1*03:01 являются факторами риска развития заболевания. Наоборот, аллели DQA1*02:01, DQA1*03:01 и DQB1*05:01 представлены как защитные факторы [120]. Нарколепсия - это расстройство сна, характеризуется главным образом чрезмерной дневной сонливостью, ассоцировано с аллелем HLA-DQB1*06:02 [121]. Синдром Фогта-Коянаги-Харада (ФКХ) является системным аутоиммунным заболеванием, которое поражает ткани, содержащие меланин (глаза, кожа, мозговые оболочки и т.д.). Первые данные о связи HLA-BW22J (японский специфичный вариант HLA-Bw22) и ФКХ были опубликованы 40 лет назад [122]. Мета-анализ подтвердил связь между синдромом ФКХ и HLA-DR4/DRB1*04. Выявленные ассоциации отличаются в зависимости от этнической группы. HLADRB1*04:04, *04:05 и *04:10 ассоциированы с развитием заболевания, в то время 31 как HLA-DRB1*04:01 – защитная, возможно обладает протективным эффектом [123]. Наследственный гемохроматоз (HГ) является рецессивно наследственным заболеванием, проявляется нарушением обмена железа. Данное заболевание вызвано мутацией C282Y в HFE гена (hemochromatosis gene, high Iron Fe), локализованного на хромосоме 6p21.3, и сцепленного с локусом HLA-A, в частности сильная ассоциация установлена для HLA-A*03 и HLA-B*07 [124, 125]. Было показано, что только 9% представителей западноевропейских популяций являются носителями аллеля HLA-B*27, но срeди пациентов с анкилозирующим спондилоартритом (АС) этот аллель обнаруживался в 97% случаев [47,126]. Вероятность развития анкилозирующего спондилоартрита у близнецов, при наличии HLA-B*27 у одного из двух сибсов равна 90% [47, 127]. Cильная ассоциация АС с антигеном гистосовместимости HLA-B27, известна с 1973 года [128], однако, вклад HLA-B*27 в развитие АС составляет примерно 16% [129]. Результат проведенного мета-анализа оказался неоднозначным: было показано, что HLA-B*27:04 может быть потенциальным фактором риска, а HLAB*27:03, HLA-B*27:06 и HLA-B*27:07, возможно, являются защитными факторами, особенно в популяциях Азии [130]. Синдром Рейтера характеризуется не-гонококковым уретритом, конъюнктивитом и артритом. Манифестация заболевания проявляется в период от одной до четырех недель после инфицирования мочеполового или желудочнокишечного тракта такими инфекционными возбудителями, как Chlamydia, Ureoplasma, Shigella, Yersinia, наряду с другими бактериями и в сочетании с антигеном HLA-B*27. Кроме того, некоторые исследования показывают ассоциации этого синдрома с HLA-B*51 у японских пациентов, которые не имеют HLA-B27 [48,131]. Восприимчивость к болезни Бехчета неизменно ассоциируется с полиморфизмом гена HLA-B, в частности c аллелем HLA-B*51 [50]. Это было подтверждено во всех этнических группах, хотя эта ассоциация более сильно выражена у пациентов Средиземноморья и Азии, чем центральной Европы [132]. 32 Кроме того, известно, что аллель HLA-A*26 является еще одним аллелем, который связан с болезнью Бехчета в греческой [133] и японской популяции [134]. В нескольких исследованиях другого заболевания с невыясненной этиологией, каким является псориаз, было отмечено, что существуют клинические различия между ранним началом псориаза и поздним началом псориаза. Авторы отметили, что ранний I тип псориаза, с тяжелым клиническим течением скорее всего связан с HLA-Cw6, -B13 и -B57. Позднее развитие заболевание, или II тип псориаза, как правило коррелирует с HLA-Cw2 и -B27 [135]. Сильная генетическая связь наблюдается между cистемной склеродермией (ССД) и генами HLA. Большое геномное исследование (GWAS) показало, что различные генотипы HLA не только влияют на восприимчивость к болезни, но также связаны с экспрессией аутоантител в зависимости от этнической принадлежности. Высокая экспрессия анти-РНК полимеразы III (ARA) у европейцев статистически достоверно связана с аллелем HLA-DRB1*0404 (OR = 5.13), в то время как у представителей негроидной расы ассоциируется с аллелем DRB1*0804 (OR = 2.98) [51]. Наиболее сильная связь с ССД у европейцев и латиноамериканцев наблюдается с аллелями DRB1*11:04, DQA1*05:01 и DQB1*03:01, а у представителей негроидной расы - с DRB1*08:04, DQA1*05:01 и DQB1*03:01 [51]. Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием неизвестной этиологии. Восприимчивость к этому системному воспалительному заболеванию связана с генетическими и экологическими факторами. В частности, некоторые HLA-DRB1 аллели, положительно связаны с предрасположенностью к СКВ: у европейцев это DRB1*03:01 [52] и DRB1*15:01 [136]; у представителей черной расы - DRB1*15:03 [137] и DRB1*08:02 у латиноамериканцев [138]. В японской популяции с предрасположенностью к ССД ассоциирован DRB1*15:01, а протективный эффект связан с аллелями DRB1*13:02 и DRB1*14:03 [139]. 33 1.4.2.3 Иммуногенетика ревматоидного артрита Ревматоидный артрит (РА) является наиболее распространенным воспалительным заболеванием суставов, для которого хронический полиартрит наиболее важная характеристика. Ревматоидным артритом страдают примерно от 0,5 до 1% людей по всему миру. Женщины подвержены этой болезни примерно в 3 раза чаще, чем мужчины. Данная патология может возникнуть в любом возрасте, но наиболее часто в возрасте от 40 до 60 лет [140]. Без скорейшего и эффективного лечения заболевание может за короткое время привести к необратимому повреждению суставов и последующим ограничениям на передвижение и способность работать. С социально-экономической точки зрения ранняя диагностика и надежный прогноз развития болезни имеет огромное значение. Начиная с 1988 года диагноз устанавливается на основании критериев Американского колледжа ревматологии (ACR) [141], которые включают в себя основные симптомы РА. Хотя в последние годы исследования ревматоидного артрита имеют много достижений, но реальные причины болезни до сих пор еще не выяснены. В настоящее время, к основным причинам развития РА относят нарушение регуляции иммунной системы, в результате РА характеризуется как "аутоиммунное заболевание". Ревматоидный артрит является мультифакторным заболеванием, с мультиплексным взаимодействием между генами и окружающей средой [142,143], результатом которого является аутореактивная активация B- и Т-клеток. На генетические факторы приходится около 60% восприимчивости к данному заболеванию [144], конкордантность у монозиготных близнецов составляет 15%, что в четыре раза выше, чем у дизиготных близнецов [145]. Продолжающийся во всем мире поиск генов, предрасполагающих к развитию РА, привел к пониманию наличия этнической составляющей в предрасположенности к развитию заболевания среди населения разных стран, а также наличия большого числа генетических локусов, в частности с аллельных вариантов, имеющих связь с РА. На сегодняшний день установлена главным образом связь отдельных аллелей HLA 34 с РА, однако эта связь не является одинаковой для всех этнических групп из различных географических районов [144]. Многолетние исследования HLA-генов, показали, что определенные аллели связаны с существенным риском развития аутоиммунных заболеваний. Lenz T.L. c соавторами предположили [12], что различия в репертуарах аутоантигенного связывания у гетерозигот по сравнению с гомозиготами, могут привести к дополнительным не-аддитивным эффектам риска. Авторы протестировали неаддитивный вклад классических аллелей HLA в возникновении таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит, сахарный диабет 1 типа (СД1), псориаз, идиопатическая ахалазия и целиакия. В четырех из пяти заболеваний, авторы наблюдали статистически значимые не-аддитивные эффекты доминант (ревматоидный артрит, P = 2,5 × 10-12; СД1, Р = 2,4 × 10-10; псориаз, Р = 5,9 × 10-6; целиакия, Р = 1,2 × 10-87). В трёх этих заболеваниях не-аддитивный эффект доминант авторы объясняют взаимодействием между конкретными классическими аллелями HLA (ревматоидный артрит, P = 1,8 × 10-3; СД1, Р = 8,6 × 10-27; целиакия, Р = 6,0 × 10-100). Эти взаимодействия повышают риск заболевания, хотя и достаточно умеренно (ревматоидный артрит - 1,4%; СД1 4,0%; целиакия – 4,1%) [12]. 1.5 Популяционный полиморфизм генов HLA Известно, что существует географическое распределение генетического разнообразия человека, который помогает познать человеческую эволюцию, процессы миграции и адаптации к различным условиям внешней среды, включая инфекционное и паразитарное окружение [19]. Множество исследований, направлены на изучение глобального генетического разнообразия человека, включая проект «1000 Genomes» [146], проект «Hap Map» [147], и т.д. Хотя число известных HLA-аллелей увеличивается из года в год, но только малая часть этого полиморфизма может быть обнаружена в отдельных популяциях из-за статистических ограничений (низкий уровень типирования, маленький 35 размер выборки). Тем не менее, проведенные мировым сообществом исследования установили, что большинство человеческих популяций демонстрируют высокий уровень HLA-разнообразия [148]. Целый ряд исследований посвящен изучению HLA-полиморфизма, распределению частот аллелей и гаплотипов, а также межпопуляционному взаимодействию [149,150]. В глобальном масштабе, в географически разделенных регионах есть заметные различия в HLA-распределении, включая различную степень HLA-разнообразия, тем не менее большинство HLA-локусов демонстрирует высокий аллельный полиморфизм в различных группах населения [151,152,153,154,155]. Знания о глобальном распределении HLA-генов обеспечивает понимание миграционных процессов человека и могли бы помочь понять, как подействовали предшествующие патогенные воздействия, например, эпидемии, на популяции [148]. Поэтому проведение HLA-типирования в неисследованных до настоящего времени популяциях сможет увеличить сумму знаний об HLA-разнообразии на планете. Рассматривая HLA-полиморфизм, следует также отметить, что существует очень сильное неравновесное сцепление (LD), или неслучайная ассоциация, между HLA-аллелями из разных локусов, которые наиболее часто одновременно встречаются в конкретной популяции [42,43]. Например, некоторые аллели DRB1локуса демонстрируют сильное неравновесное сцепление с конкретными аллелями DQA1 и DQB1 локусов. Кроме того, во многих популяциях гомологичные аллели DRB1-локуса, имеют сильное сцепление с одними и теми же аллелями DQA1 и DQB1-локусов, что указывает на эволюционную связь между аллелями [156,157]. Различия в комбинациях аллелей, составляющих HLA-гаплотипы, между разными популяциями объясняются комплементарными/компенсационными способностями аллельных продуктов, составляющих гаплотип, представлять Тлимфоцитам пептидные эпитопы разных патогенов. Различия в комбинации аллелей, составляющих HLA-гаплотипы, в свою очередь, также демонстрируют смешение между различными группами населения [148]. 36 Так как полиморфизм HLA аллелей и гаплотипов этнически и географически ограничен и специфичен в популяциях по всему миру [158,159], наиболее практическое значение информации об HLA-разнообразии является то, что эти данные могут быть использованы для облегчения поиска подходящего донора [160] гемопоэтических стволовых клеток, для поиска HLA-аллелей, генетических маркеров заболеваний, а также познания процессов образования популяций [160]. В своей работе Cronstein [161] пишет, что персонализированная медицина использует высокоспецифичные лекарственные препараты, которые ориентированы на индивидуальные потребности пациента: в то время как одни соединения хорошо работают для большинства пациентов, другие могут быть неэффективными для некоторых из них, или даже вызывать побочные реакции. Существует необходимость определения биомаркеров, связанных с лучшим или худшим ответом на методы лечения. В качестве таких биомаркеров могут использоваться клеточные реакции, аутоантитела, гены и другие молекулярные структуры [161,162], в том числе и HLA-аллели. Примером служат недавние исследования, связанные с аллопуринолом, препаратом, используемым для лечения подагры и гиперурикемии. Исследования показывают, что аллель HLAB*58:01 является маркером кожных побочных реакций, вызванных аллопуринолом у пациентов, носителей данного аллеля [163]. Хорошую диагностическую значимость показывают результаты тестирования гиперчувствительности к препарату абакавир, среди носителей аллеля HLA-B*57:01 [164]. Результатом функционального полиморфизма, когда иммунный ответ на конкретный пептид эпитопа патогена может зависеть от HLA- аллелей, имеющихся у человека, является тот факт, что лица гетерозиготные по HLA-аллелям имеют более широкий репертуар пептидного связывания по сравнению с гомозиготными и, следовательно, возможность реагирования на более широкий спектр возбудителей. С другой стороны, существование нескольких различных локусов и в классе I (А, В и С) и классе II (DR, DQ и DP) молекул могут в какой-то степени компенсировать гомозиготность по HLA-генам в одном из локусов [148]. 37 Новое направление разработки пептидных вакцин, вакцинации на основе нескольких Т-клеточных эпитопов, включая HLA, может быть использовано для иммунизации целевых, четко охарактеризованных этнических групп населения. Поскольку ответ на Т-клеточные эпитопы ограничивается HLA-белками, то HLA специфичность Т-клеточных эпитопов становится одним из главных факторов для проектирования вакцины на основе эпитопов. На сегодняшний день для профилактики инфекционных заболеваний, разработан новый подход к дизайну вакцин на эпитопной основе. Так как географическое распределение болезнетворных вирусов хорошо изучено, как и спектр этнических групп населения нуждающихся в вакцинации, может быть предложен "этнос -ориентированная подход " к вакцинации [165]. Вакцинация на основе нескольких Т-клеточных эпитопов может быть использована для целевых этнических групп населения, поскольку ответ на Т-клеточный эпитоп ограничивается HLA-пептидами, т.е. HLA специфичность Т-клеточных эпитопов становится одним из главных факторов для проектирования вакцины для каждой отдельной популяции [165]. 1.6 Этногеографическая характеристика казахской популяции Казахское ханство, первое казахское государство, было создано в 1456г (1465/66гг) [166,167] и располагалось на территории современной Республики Казахстан, которое находится на границе Европы и Азии, и исторически являлась областью пересечения транспортных маршрутов с запада (Европа), на восток Азия и Сибирь. Казахстан занимает территории, население которых характеризуется многообразием языков, религий и культур. Многие древние племена были вовлечены в формирование казахской национальности. Антропологи считают, что формирование казахского этноса началось в первом тысячелетии нашей эры. Считается, что древний казахский антропологический тип включал характеристики европейских или средиземноморских антропологических типов. В последующие периоды, во время монгольских завоеваний, в результате 38 интенсивного перемешивания, казахи приобрели монгольские черты [168]. На генофонд современной казахской популяции оказали влияние разные предшествующие этносы, включая тюркские племена (кипчаки, аргыны, хазар и т.д.), тюрко-монгольские племена (дулаты, жалайыры, найманы и т.д.), и другие азиатские племена [169]. Даже при том, что Казахстан в основном характеризуется как полиэтническая страна, одним из основных этносов (более 60%) являются казахи. В настоящее время казахи являются одним из наиболее многочисленных тюркоязычных народов Средней Азии. Всего же мире сейчас насчитывается более 14 млн. казахов, из них – 11,5 млн. проживает в Казахстане [170]. Наиболее многочисленные диаспоры казахов проживают в Китае (1,3 млн) [171], в Узбекистане (0,8 млн) [172] и в России (0,5 млн) [173]. 1.7 Заключение HLA молекулы играют важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний, тяжелых хронических инфекций и других заболеваний. Обнаружение HLA-аллеля, связанного с заболеванием, указывает на генетическую предрасположенность, однако, носители генетического признака не обязательно заболеют. Патогенез аутоиммунных заболеваний, например, является очень сложным и не до конца изученным, для развития заболеваний, как правило, имеют большое значение разные, в том числе экологические факторы. HLA-типирование можно использовать в качестве скринингового теста. При подозрении на конкретное заболевание, обнаружение определенного HLA-аллеля является важным доказательством для дифференциального диагноза. В дополнение к оценке риска заболевания, определение имеет HLA-аллелей прогностическое значение (например, обнаружение эпитопа чувствительности/устойчивости к ВИЧ, РА и тд). В основном HLA-типирование показано при заболеваниях, для которых известна очень сильная ассоциативная связь с определенными характерными для каждой отдельной популяции. HLA-аллелями, 39 Информации об ассоциативной связи генов HLA с заболеваниями в казахской популяции, а также об уровне HLA-полиморфизма в настоящее время накоплено недостаточно, в связи с чем нами была поставлена цель изучить генетическое разнообразие генов HLA II класса среди казахов, и оценить значение аллельного полиморфизма HLA для развития таких социально-значимых заболеваний, как туберкулёз и ревматоидный артрит. 40 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Данное исследование было одобрено этическим комитетом Национального центра биотехнологии, Казахстан (№ 10, 14.02.2010 г.). Исследование проводилось в соответствии с принципами гуманных и этических исследований Национального центра биотехнологии. Каждый, из 521 участника исследования, подписал информированное согласие на исследование и заполнил анкету-вопросник. 2.1 Материалы и оборудование 2.1.1 Среды и растворы В работе использовали следующие среды и растворы: 3 М ацетат натрия рН 4.6 (5.2), 10 мМ дНТФ, 0,5 M ЭДТА, рН 8,0, 10 мг/см3 этидиум бромида, 95 %, 80 % и 75 % этанол. 50хТАЕ (40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА), ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). 2.1.2 Оборудование Генетический анализатор 3730XL Genetic Analyzer, (Applied Biosystems); Мультипараметрический флуоресцентный анализатор Luminex 100 (Luminex Corporation); термоциклер Tetrada, (BioRad); аналитические весы TE 313S 2006, (Sartorius); рН-метр Delta 320, (Mettler Toledo); спектрофотометр PD 303 UV, (Aplel); микроволновая печь, (Samsung); термоплаты DryBlockHeater, (Techne); термостатирующие шейкеры Thermo Block TDB-120, Латвия; автоматические микропипетки, (Eppendorf); спектрофотометр Nanodrop 1000, (Thermo Fisher Scientific); аппарат для электрофореза нуклеиновых кислот PowerPac, (Bio-Rad); аппарат для электрофореза нуклеиновых кислот “Consort EV 265”, (Consort); пакет прикладных программ для анализа последовательностей – Vector NTI Advance™ 9.0 (Invitrogen), Sequence Scanner v1.0 (Applied Biosystems), SeqScape v 2.6 (Applied Biosystems, USA).; cистема для документирования гелей “Quantity One”, (Bio-Rad); система для документирования гелей Gel Doc, (Bio-Rad); рефрижераторная 41 микроцентрифуга "Centrifuge 5417R", (Eppendorf); низкоскоростная центрифуга "Centrifuge 5702", (Eppendorf); микроцентрифуга "MiniSpin", (Eppendorf); шейкер PSU-20, (МuIti BIOSAN); фильтрационное оборудование и установки для получения высокоочищенной деионизированной воды, (Sartorius); ламинарные боксы (ASSAB). 2.2 Методы исследования 2.2.1 Выделение геномной ДНК Геномную ДНК для проведения типирования HLA аллелей выделяли из венозной крови с помощью наборов «Wizard®Genomic DNA Purification kit» (фирмы Promega) и QIAamp Blood Mini Kits (фирмы Qiagen) согласно инструкциям производителя. Концентрация ДНК для выполнения типирования SSO – методом составляла 20 нг/мкл и SBT-методом - 50 нг/мкл. Количественная и качественная оценка выделенной ДНК осуществлялась с помощью метода спектрофотометрии (спектрофотометр Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific). Качество ДНК должно было соответствовать нормативному соотношению оптических плотностей – 1,61,8; при длинах волн 260/280 nm. 2.2.2 Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на TАE-буфере. Для визуализации ДНК в агарозный гель вносили бромистым этидий (к/к 1 мкг/см3). Электрофорез продуктов амплификации проводили в аппарате для горизонтального электрофореза PowerPac, (Bio-Rad), при напряжении 8 В/см. Документирование полученных результатов проводили, с помощью системы документирования гелей Gel Doc, (Bio-Rad). Размеры амплифицированных молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – 42 фрагментами ДНК известной молекулярной массы. В качестве маркера молекулярных масс использовали "DNA Ladder 1kb", (Ferments). 2.2.3 Очистка ПЦР-продуктов Очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием ферментов – экзонуклеазы (Exo I, 20 ед/мкл) и щелочной фосфатазы (SAP 1ед/мкл) по следующему протоколу: Общий объем реакционной смеси 10 мкл: SAP ( к/к 0.5 ед) - 0.5 мкл Exo I (k/k 5 ед) - 0.250 мкл 10х ПЦР буфер – 1 мкл Н2О – 8.25 мкл Температруно-временной режим 37 °С – 30 мин 85 °С – 10 мин 2.2.4 Очистка продуктов амплификации для ПЦР-секвенирования Очистку продуктов для ПЦР-секвенирования проводили спиртовым осаждением: к 10 мкл образца добавляли 40 мкл полученной смеси из (3М NaOAc рН 4.6, 95 % C2H5OH). Перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее к осадку добавляли 150 мкл 75 % этанола, перемешивали и осаждали центрифугированием при 15600 g в течение 30 мин при температуре 40С. Супернатант выбрасывали, осадок подсушивали при 56°С в течение 2 мин. Растворяли в формамиде, с последующим инкубированием при комнатной температуре. Далее денатурировали при 95°С в течение 2 мин., после охлаждали во льду и загружали в автоматический генетический анализатор. 43 2.2.5 Секвенирование и анализ последовательностей ДНК Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили с использованием набора для термоциклического секвенирования Big DyeTM Terminator v.3.0 Cycle Sequencing (Applied Biosystem), согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3170 xl Genetic Analyzer, (Applied Biosystems). 2.2.6 Применение методов клонирования при определении HLA- генотипа Несмотря, на высокую дискриминационную способность, в практике часто встречаются один или более нуклеотидов в комбинации аллелей, которые не позволяют предельно точно определить нуклеотидную последовательность, а, следовально, и наименование аллеля. Данная проблема чаще всего характерна для образцов гомозиготных по группе аллелей, но гетерозиготных по внутригрупповому делению, а также для неизвестных аллелей HLA. Поэтому с целью определения точного аллельного полиморфизма для образцов гомозиготных по группе аллелей, образцы типировали с применением методов клонирования. Суть данного типирования заключалась в следующем: геномную ДНК выделяли из периферической крови с использованием набора для экстракции геномной ДНК фирмы PROMEGA Wizard®genomic DNA Purification Kit согласно протоколу изготовителя. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "PTC-0240 DNA EngineTetrad2 Cycler" (BioRad, USA). Второй экзон гена DRB1 амплифицировали с использованием группо-специфичных праймеров. Постановку ПЦР проводили следующим образом: 50 μL ПЦР - смесь состояла из: ПЦР буфер (Литех), 0.25 mМ каждого дНТФ, 0.5 μМ каждого праймера, 2,0 единицы Taq ДНК-полимеразы (Литех) и от 50 до 100 нг ДНК. После первоначального шага денатурации 94°C в течение 5 мин, образцы были подвергнуты 10 температурным циклам, каждый из которых состоял из следующих шагов: денатурации при 94°C за 30 сек, отжига праймеров при 65°C за 50 сек, после чего следовало 20 температурных циклов: отжиг праймеров при 62°C в течении 50 44 сек и эллонгации при 72°C за 1 мин. Последний этап - длительная эллонгация в течении 5 мин при 72°C. ПЦР-продукты детектировали 2% агарозном геле с добавлением этидия бромида (0,2 мг/мл), для постановки электрофореза использовали по 50 μL каждой пробы. После проведения препаративного электрофореза, бэнды с ПЦР-продуктами были вырезаны из геля, затем экстрагировали ДНК из геля с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Лигирование проводили использованием набора для клонирования Promega’s pGEM®-T- Easy Vector System (Promega, Madison, WI), в соответствии с инструкциями производителя. После всех манипуляций 4,5 мкл полученной смеси были трансформированы в компетентные клетки Escherichia coli (XL-Blue), отбор трансформантов проводился с помощью бело-голубой селекции на среде Luria Bertani (LB), в чашках Петри с добавлением ампициллина, X-gal и isopropyl-ßgalactosidase. Колонии были отобраны, и подвергнуты лизису в 1Х ТЕ-буфере при 990С в течении 15 мин. Далее с полученными лизатами была поставлена ПЦР с использованием М13 - праймеров (прямой и обратный). Определение нуклеотидной последовательности аллелей проводили на 96-капиллярном генетическом анализаторе 3730xl Genetic Analyzer (AppliedBiosystems), с помощью набора BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Идентификацию аллелей проводили используя международную базу данных EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/) (Рисунок 3) и программу SBTINTERFACE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/sbt.cgi?cmd=main) (Рисунок 4). 2.2.7 Компьютерный анализ последовательностей Для множественного и парного выравнивания последовательностей использовали программы Vector NTI Advance™ 9.0 (Invitrogen) и Sequence Scanner v1.0 (Applied Biosystems, USA). 45 Рисунок 3. Определение аллелей в международной базе данных EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/) Рисунок 4. Определение аллелей в международной базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/sbt.cgi?cmd=main) 46 2.3 HLA-генотипирование Идентификация аллельного полиморфизма генов HLA – II класса (DRB1, DQB1 и DQA1) проводилась с помощью методов полимеразной цепной реакции с применением метода сиквенс-специфичных олигонуклеотидных проб (PCR-SSOP) и метода прямого секвенирования (SBT) [174]. Геномную ДНК из образцов цельной крови выделяли с использованием набора для выделения ДНК (Wizard® genomic DNA Purification Kit, PROMEGA, Madison, WI) в соответствии с протоколом производителя. Концентрация ДНК составляла 50 нг/мкл. ПЦР и секвенирование выполняли для 2 экзона генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1, в соответствии с литературными источниками [175,176,177,178, 179,180,181]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 50 мкл реакционной смеси 100 мМ Тris-HCl (рН 8,0), 2,5 мМ MgCl 2, 100 мМ каждого дНТФ, 10 пмоль каждого праймера, 2.0 U-полимеразы Taq-ДНК и исследуемой ДНК 50 нг/мл. Для амлификации применялся 96-луночный амплификатор «PTC0240 DNA Engine Tetrad 2 Cycler» (BioRad, Hercules, CA). Режим термоциклирования для амплификации 2 экзона генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 был следующий: начальная денатурация в течение 5 мин при 94◦C, а затем 10 циклов при 94◦C в течение 30с и 65◦C в течение 50с, затем 20 циклов, каждый из которых состоит из денатурации 94◦C в течение 30с, отжига праймеров 50с при 62◦C и элонгации 60с при 72◦C, с конечным удлинением течение 5 мин при 72◦C. Детекция результатов ПЦР проводилась на 2% агарозном геле при использовании электрофореза. Секвенирование проводили на 96-капиллярном генетическом анализаторе 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Foster City, CA) с помощью BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystem). Аллели HLA были проанализированы с использованием HLA-номенклатуры, релиз 3.7.0 (IMGT / базы данных HLA). HLA-типирование РА-пациентов проводили по следующему алгоритму. Выделение геномной ДНК из цельной крови проводили с использованием набора QIAamp Blood Mini kits (Qiagen N.V., Германия) согласно протоколу 47 производителя. Аллели HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 идентифицировали методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с использованием сиквенс-специфичных олигонуклеотидных проб. ПЦР-анализ HLA II класса проводился согласно протоколу набора LUMINEX LABType(®) SSO typing kit (One Lambda, США). Для анализа данных использовалось программное обеспечение HLA Fusion ™ Software Version 2.0 (One Lambda, США). 2.4 Характеристика обследованных групп Опытные и контрольная группы состояли из представителей казахской национальности и были классифицированы как моноэтнические, в соответствии с фенотипическими характеристиками. Все участники подписали письменное информированное согласие на использование их образцов в исследовании. Образцы крови (5.0 мл) собирали после письменного информированного согласия всех участников исследования. 2.4.1 Здоровые представители казахской популяции Контрольная группа представителей казахской национальности: 157 человек из различных регионов Казахстана, живших в Астане в период 2010-2011 гг. Все субъекты этой группы были отобраны случайным образом, не были связаны родственными узами, без клинических симптомов заболеваний. Группа состояла только из представителей казахской национальности и была классифицирована как многоэтничная в соответствии с характеристиками фенотипа исследованных субъектов и семейного происхождения [168]. Контрольная группа состояла из здоровых людей, без наличия в анамнезе HLA-ассоциированных заболеваний (гепатит, аутоиммунные заболевания, ВИЧ и туберкулёз). Возраст группы на момент исследования составил 20 - 58 лет (средний возраст 31,1), из них 69 (43,9%) составляли мужчины и 88 (56,1%) женщины. 48 2.4.2 Популяции для межпопуляционного анализа Также в данной работе были использованы литературные данные о следующих популяциях из разных географических регионов - западноевропейские популяции: австрийцы [182], англичане [183], немцы [182], французы [184], итальянцы (Северная Италия) [182], голландцы [182], португальцы [182], испанцы (Мадрид) [185], испанцы (Гранада) [186]; восточноевропейские популяции: албанцы [187], башкиры [188], белорусы [189], болгары [190], чуваши [191], поляки [192], русские (Урал [188], Северо-запад России [193]), сербы [182], словаки [194], украинцы [11]; средиземноморские популяции: армяне [195], греки [182,196], грузины [197], итальянцы (Южная Италия) [182], евреи ашкенази [198], арабы [199], курды [200], ливанцы [201], македонцы [202], палестинцы [203]; скандинавские популяции: финны [182], ханты-манси [204], коми [205], норвежцы [206], поморы [207], саамы [207], шведы [208]; сибирские популяции; алеуты [209], чукчи [210], эвенки (2 популяции) [204,210], кеты [211], коряки [210], буряты [204], недигал [204], ненцы [182], нивхи [210], нганасаны [211], тоджа [204], тофалары [204], тувинцы (2 популяции) [204,212], удегейцы [210], ульчи [204]; азиатские популяции; монголы [182], китайцы [213], японцы [214], корейцы [215], казахи (Тарбагатай, Казахстан)[данное исследование], казахи (Китай) [216], тайваньцы [182], уйгуры [217], малайцы [218], тайцы [182], вьеты [219], турки [220]; американские популяции: аргентинцы [182], мацатеканцы [221], ачи [222], эскимосы (2 популяции) [210,223], Юпик [224]. 2.4.3 Пациенты с диагнозом легочный туберкулёз (ЛТБ) Семьдесят шесть случайно выбранных не иммуносупрессированных пациентов с диагнозом легочного туберкулёза (ЛТБ) были включены в данное исследование: 75,5% с диагнозом инфильтративный туберкулёз, 25,5% - фибрознокавернозный туберкулёз. В исследовании участвовали неродственные пациенты казахской национальности, жители различных регионов Казахстана, госпитализированные в Национальный центр проблем туберкулёза Министерства 49 здравоохранения Республики Казахстан в г. Алматы (НЦПТ МЗ РК). Во всех случаях, диагноз туберкулёза был подтвержден с помощью световой микроскопии, которая показала наличие кислотоустойчивых микобактерий в мокроте, а также ростом культуры M.tuberculosis. Критерии отбора для пациентов с ЛТБ были следующими: подтвержденный диагноз легочного туберкулёза, отсутствие ВИЧинфекции. Пациенты с диабетом, силикозом, циррозом печени, или другим системным заболеванием, были исключены. Возраст пациентов на момент исследования составил 21 - 63 года (средний возраст 32,7). Сорок девять (64,5%) пациентов были мужчины и двадцать семь (35,5%) - женщины. Клинические изоляты M. tuberculosis были выделены и проанализированы в 2010 году и хранились в референс-лаборатории Национального центра проблем туберкулёза Республики Казахстан (г.Алматы). Изоляты культивировались на твердой среде Löwenstein–Jensen (LJ), как описано ранее [225]. Видовая дифференциация M. tuberculosis и чувствительность к лекарственным препаратам были выполнены в референс-лаборатории. Тест на лекарственную чувствительность проводился методом абсолютной концентрации в соответствии с протоколом Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [225,226]. Из всех 76 пациентов, изоляты от 62 пациентов проверяли на лекарственную чувствительность к препаратам первой линии, 14 изолятов были исключены из исследования, в связи с обнаружением двойной инфекции. Данные по чувствительности к препаратам представлены в таблице 4. Tаблица 4 Чувствительность к препаратам в группе ЛТБ – пациентов Чувствительность к препаратам 1 чувствительность монорезистентность Препараты 2 все основные препараты (этамбутол, стрептомицин, изониазид и рифампицин) устойчивость только к одному препарату Количество случаев 3 9 (11.84%). 1 (1.32%) 50 продолжение таблицы 4 1 мультирезистентность множественная лекарственная резистентность 2 устойчивость к двум или более лекарственных средств, без присутствия комбинации изониазида и рифампицина устойчивость к двум основным препаратам (изониазид и рифампицин) 3 3 (3.94%) 49 (64.5%) 2.4.4 Пациенты с диагнозом ревматоидный артрит (РА) В данной работе, в течение 2010-2011 гг. для проведения исследования были отобраны пациенты с ревматоидным артритом в больницах города Астана. Образцы были собраны только от казахов. Национальность была определена в соответствии с генеалогической историей участников исследования. Распределение HLA-аллелей II класса изучалось у представителей казахской национальности: у 131 пациентов. Изучение аллельных вариантов HLA класса II было проведено во всех образцах пациентов с ревматоидным артритом в сравнении с контрольной группой. В группу пациентов с РА вошли индивидуумы, которые соответствуют критериями Американского колледжа ревматологии [141]. Пациенты представлены взрослыми индивидуумами т.е. от 16 лет и старше. Сто тридцать один пациент с РА (средний возраст 49,4 ± 12,4, 22 мужчин, 109 женщин). Индивидуальные данные, включающие возраст, пол, этническую принадлежность, возраст начала заболевания, а также клинические симптомы, характеризующие заболевание, были получены хорошо обученным персоналом. Клиническое описание группы пациентов представлены в таблице 5. 51 Tаблица 5. Демографические и клинические характеристики пациентов с ревматоидным артритом. Женщины Мужчины Количество (%) 109 (83.2) 22 (16.8) Возраст (Ср. значение ± лет) 49,0 (12.7) 51,2 (10.7) Продолжительность заболевания 9,06 (8.65) 7,22 (6.9) (Ср. значение ± лет) Признаки и симптомы (n, %) Утренняя скованность 106 (94.6) 20 (89.96) Артрит трех и более суставов 110 (98.2) 23 (100,0) Артрит суставов кисти 104 (98.2) 22 (95,7) Симметричный артрит 105 (93,6) 20 (89,9) Ревматоидные узелки 62 (55,4) 10 (43,5) Ревматоидный фактор 70 (62,5) 13 (56,5) (положительный) Рентгенологические изменения 89 (79,5) 16 (69,6) Положительный семейный 28 (25,0) 2 (8,70) анамнез Всего 131 (100.0) 49,4 (12.4) 8,78 (8.40) 126 (93.3) 133 (98,5) 126 (93,3) 125 (92,6) 72 (53,3) 83 (61,5) 105 (77,8) 30 (22,2) 2.5 Статистический анализ Частоты аллелей HLA-DRB1, -DQB1 и -DQA локусов были оценены методом прямого подсчета. Для сравнения популяции казахов с некоторыми мировыми популяциями были использованы частоты аллелей, частоты гаплотипов, метод объединения ближайших соседей, построение дендрограмм и многомерное шкалирование. Статистический анализ проводился с использованием программы Arlequin v.3.11. Полученные генетические расстояния были использованы в качестве матрицы для многомерного шкалирования по двум осям. Для оценки генетических расстояний вычисляли матрицу Эвклида [227,228], используя программу PAST v.2.17. Частоты гаплотипов вычисляли с помощью программы Arlequin v3.11. методом максимального правдоподобия. Тот же пакет программ был использован для вычисления соответствия соотношению Харди-Вайнберга. Филогенетические 52 дендрограммы были созданы с применением программы PHYLIP, на основе частот аллелей с использованием метода объединения ближайших соседей (NJ) на основании генетических расстояний, вычисленных по Нею (http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html). Все статистические расчеты были выполнены с использованием программы Epi Info ™ Version 7.0.8.3 (Clifton Rd, США). Все P-значения были получены с использованием двустороннего теста (two-sided test). Сила ассоциации оценивалась с применением отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Для статистической оценки различий по частотам HLA-аллелей между пациентами и здоровыми участниками исследуемых групп был использован Хи-квадрат, Pзначение (P value), и OR с 95% CI. Для подтверждения статистической достоверности P value (P) была применена поправка Бонферрони (Рc), показатели Р были скорректированы путем умножения значения Р на количество выявленных в локусе аллелей. Уровень значимости P (P value) был установлен на уровне P<0.05. Коррекция Бонферрони была применена к P-значениям [229]. Силу связи между генами HLA и болезнями обозначают величиной отношения шансов (OR), указывающего на то, насколько выше риск развития заболевания у носителей определенных вариантов HLA-генов по сравнению с неносителями этих вариантов. Многие пациенты являются гетерозиготами по HLAассоциированым аллелям, которые, как правило наследуются по аутосомнодоминантному типу наследования. Клинически и диагностически значимым является принцип эффекта дозы гена. Это означает, что гомозиготные пациенты, которые унаследовали от обоих родителей по ассоциированному HLA-аллелю с соответствующими характеристиками, способны показать более раннюю манифестацию и более сильное проявление соответствующих симптомов заболевания (http://www.dorak.info/mtd/glosstat.html). Кроме того, двух-локусные гаплотипы и неравесное сцепление (LD или D´) были определены c помощью программного обеспечения Arlequin (v3.11). Силу неравновесного сцепления трактовали согласно следующим критериям: LD>0,80 сильная; LD, -0.5 умеренная; LD, -0 слабая LD) [45]. 53 Данные по частотам аллелей, OR и СI из 23 РА-исследований, проведенных в некоторых мировых популяциях и настоящего исследования были сопоставлены и проанализированы с использованием программного обеспечения Comprehensive Meta-Analysis (ver 2.0). 54 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Полиморфизм генов HLA II класса в казахской популяции 3.1.1 Распределение аллелей генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 Настоящее исследование – первое, в котором был проведен анализ частот аллелей локусов HLA-DRB1, -DQA1 и –DQB1 у казахского населения в сравнении с средиземноморскими, европейскими, азиатскими и сибирскими популяциями. Таблица 6. Данные о количестве аллелей в казахской популяции и средней гетерозиготности. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность Локус Гетерозиготностьнабл. Гетерозиготностьожид. P-значение HLA-DRB1 0.93631 0.94593 >0.05 HLA-DQB1 0.91083 0.91758 >0.05 HLA-DQA1 0.87898 0.91144 >0.05 В таблице 6 приведены данные о количестве HLA-DRB1, -DQB1, и -DQA1 аллелей в исследуемой популяции. В группе, включающей 157 казахов из, были определены 37 аллелей локуса HLA-DRB1, 19 аллелей локуса HLA-DQB1 и 17 аллелей локуса HLA-DQA1. Наблюдаемая гетерозиготность не отличалась от ожидаемой, что свидетельствовало о соответствии соотношению Харди-Вайнберга и, таким образом, об адекватном выборе субъектов для проведения генетических исследований. Распределение частот аллелей HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 локусов у казахского населения из Астаны, приведены в таблице 7. Частоты аллелей DRB1*07:01 и DRB1*03:01 были наиболее высокими и наблюдались соответственно в 13,1% и 10,0%. Аллель DRB1*13:01 был обнаружен у казахов с частотой 8,6%. Частота шести HLA-DRB1 аллелей (DRB1*01:01, DRB1*09:01, DRB1*13:03-102, DRB1*14:01, DRB1*14:05-72 и DRB1*15:01) была выше 4%, а их 55 суммарная частота составила 28,6%. Локус HLA-DQB1 является вторым основным среди генов HLA второго класса локусом, по которому было исследовано формирование генетической основы казахского населения. Самыми частотными аллелями у казахов оказались три аллеля HLA-DQB1: DQB1*02:01 - 13,6%, DQB1*03:01 - 17,6%, DQB1*03:04-22 - 11,7%. Их суммарная частота в исследуемой популяции составила более 40%. Таблица 7. Частоты аллелей генов HLA-DRB1, DQA1 и DQB1 в казахской популяции. Аллели HLA-DRB1 1 *01:01 *01:02 *03:01 *03:02 *03:07 *03:12 *03:16 *03:29-56 *04:01 *04:02 *04:03 *04:04-32 *07:01 *08:01 *08:02 *08:03 *08:04-24 *09:01 *09:02 *10:01 *11:01 *11:02 *11:03 *11:04 *11:06-62 *12:01 *12:02 Частота Аллели Частота аллелей, % 2 4,2 0,3 10,0 0,3 0,6 0,3 1,9 0,6 3,8 0,6 0,9 2,8 13,1 0,9 0,6 1,6 0,6 4,5 0,3 1,2 2,2 0,6 2,8 3,8 2,5 1,9 0,6 HLA3 DQA1 *01:01 *01:02 *01:03 *01:04 *02:01 *03:01 *03:02 *03:03 *04:01 *04:02*05:01 04 *05:02 *05:03 *05:05 *05:06*06:01 10 *06:02 аллелей, % 4 3,5 10,2 9,6 9,0 9,6 13,1 8,3 5,1 2,6 0,3 9,6 0,6 1,0 9,0 5,7 2,6 0,3 Аллели HLA5 DQB1 *02:01 *02:02 *02:03 *02:04 *03:01 *03:02 *03:03 *03:04-22 *04:01 *04:02 *05:01 *05:02 *05:03 *05:04 *05:05 *06:01 *06:02 *06:03 *06:04-39 Частота аллелей, % 6 13,6 6,3 1,3 2,6 17,6 7,5 2,6 11,7 0,6 2,6 7,9 4,8 5,1 1,0 0,3 2,6 5,1 5,1 1,6 56 продолжение таблицы 7 1 *13:01 *13:02 *13:03-103 *14:01 *14:03 *14:04 *14:05-72 *15:01 *15:02 *16:01 2 8,6 2,9 5,7 4,9 1,9 1,9 4,2 5,1 1,2 0,6 3 4 5 6 Наиболее частым в DQA1 локусе был аллель DQA1*03:01 (13,1%), затем DQA1*01:02 (10,2%), DQA1*01:03 (9,6%), DQA1*02:01 (9,6 %) и DQA1*05:01 (9,6%). Другие аллели встречались с частотой от 0,3% до 9,0%. Для межпопуляционного анализа по гену DRB1 было дополнительно проведено HLA-типирование изолированной группы казахов, проживающих в Восточном Казахстане (регион Тарбагатай). Распределение частот аллелей в HLADRB1 локусе в казахской популяции из Тарбагатайского района приведены в таблице 8. В целом, у 157 представителей казахской популяции Тарбагатая было выявлено 35 аллелей гена HLA-DRB1, наиболее распространенными аллелями являются DRB1*13:01 (8,0%), DRB1*15:01 (7,6%), DRB1*03:01 (7,6%), DRB1*01:01 (5,4%), DRB1*13:03-102 (4,8%) и DRB1*09:01 (4,8%). Tаблица 8. Частота аллелей гена HLA-DRB1 в казахской популяции региона Тарбагатай. Аллель Частота Аллель Частота Аллель Частота DRB1 аллелей, % DRB1 аллелей, % DRB1 аллелей,% 4 1,9 1,6 1,9 1,9 3,5 5 *12:02-08 *13:01 *13:02 *13:03-102 *14:01 6 4,1 8,0 3,8 4,8 1,9 1 *01:01 *01:02 *03:01 *03:02 *03:07 2 5,4 1,3 7,6 0,6 1,6 3 *07:01 *08:01 *08:02 *08:03 *08:04-24 57 продолжение таблицы 8 1 *03:12 *03:16 *03:29-56 *04:01 *04:02 *04:03 *04:04-32 2 0,6 0,3 2,5 3,0 1,0 0,6 2,2 3 *09:01 *09:02 *10:01 *11:01 *11:04 *11:06-62 *12:01 4 4,8 1,3 1,3 3,5 4,1 2,5 2,5 5 *14:03 *14:04 *14:05-72 *15:01 *15:02-05 *16:01 6 1,6 0,3 7,1 7,6 3,0 0,3 На основании полиморфизма гена DRB1 двух групп казахов было выявлено, что изолированная группа из Тарбагатая отличается от основной группы по распространенности аллелей, так например аллель DRB1*07:01 среди казахов Тарбагатая встречалась с частотой 1,9%, а в основной группе казахов частота данной аллели составила 13,1%. 3.1.2 Идентификация новых HLA-аллелей В ходе выполнения работы были установлены новые аллели, обозначения которым были официально присвоены номенклатурным Комитетом Всемирной организации здравоохранения [230]. Новые аллели получили следующие обозначения: DRB1*03:56, DRB1*03:57, DRB1*13:102, DRB1*13:02:04, DRB1*13:103, DRB1*11:04:06 и DRB1*14:12:02 [231]. Семь новых аллелей HLADRB1 локуса были обнаружены в пробах от здоровых представителей казахской национальности. HLA-DRB1 аллели идентифицированы с помощью метода клонирования локус-специфических ампликонов [175,176,177,232]. Новые аллели DRB1 были выделены в результате секвенирования продуктов ПЦР, полученных с помощью амплификации групповыми DRB1*03/08/11/12/13/14-специфическими праймерами, амплифицирующими фрагмент ДНК между от 1 и 2 интроном гена DRB1 [175,233]. Секвенирование обеих нитей ДНК проводили с использованием праймеров M13, Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), определение нуклеотидной последовательности проводили на генетическом анализаторе 3730xl Genetic 58 Analyzer (Applied Biosystems). (Applied Biosystems, Foster City, CA). Новые аллели были официально подтверждены Номенклатурным комитетом Всемирной организации здравоохранения [230,231]. В таблице 9 приведены новые последовательности и их сравнение с наиболее близкими аллелями. Пять из новых аллелей представляют собой одиночные нуклеотидные замены, три из которых приводят к изменениям аминокислот и две являются молчащими заменами (сайлент-замены). Остальные аллели, отличаются от наиболее близкого аллеля двумя нуклеотидными заменами, которые приводят к двум аминокислотным заменам в последовательности аллеля DRB1*03:57, но не аллеля DRB1*13:02:04. Таблица 9. Образцы и описание новых последовательностей HLA-DRB1 аллелей. Образец Новый аллель aНаиболее bИзменение Изменение cНомер гомологичный кодона аминокислоты GenBank аллельa 143KZ DRB1*03:56 DRB1*03:01 82 AAC на 82 Asn на Ser FN908199 на 26 Phe на Ser FN908200 AGC 145KZ DRB1*13:102 DRB1*13:01 26 TTC TCC 153KZ DRB1*11:04:06 DRB1*11:04 93 CGG на 93 Arg сайлент FN908201 AGG 41KZ DRB1*03:57 DRB1*03:01:01:01 17 TTC на 17 Phe на Ser, FN908202 TCC, 86 GTG 86 Val на Ala на GCG 71KZ DRB1*13:103 DRB1*13:02:01 12 ACG на 12 Thr на Met FN908203 ATG 130KZ DRB1*13:02:04 DRB1*13:02:01 86 GGT на 86 Gly сайлент, FN908204 GGG, 93 CGG 93 Arg сайлент на AGG 140KZ DRB1*14:12:02 DRB1*14:12 93 CGG на 93 Arg сайлент FN908205 AGG Примечание: aНаиболее близкие последовательности были получены из IMGT/HLA sequence database (www.ebi.ac.uk\imgt\hla\). bНумерация от первого кодона белка. Измененный кодон, номер и последовательность аллеля, наиболее 59 близкого к новому. Изменение нуклеотида выделено жирным шрифтом. c Инвентарный номер новых HLA-DRB1 аллелей (экзон 2)- Сайлент (silent) аминокислота не меняется. 3.1.3 Гаплотипы HLA-DRB1-DQA1-DQB1 Частоты трех-локусных гаплотипов DRB1-DQB1-DQA1 (Таблица 10) были вычислены с использованием программы Arlequin v.3.11. Для сравнения полученных данных HLA-типирования с данными по различным популяциям была использована всемирная база данных частот аллелей HLA для населения разных стран [182]. Самые частотные гаплотипы, выявленные у казахского населения, наблюдались также в большинстве европейских и азиатских популяций. Наиболее распространенными среди казахского населения оказались пять DRB1-DQA1DQB1 гаплотипов: DRB1*07:01-DQA1*02:01-DQB1*02:01/02:02 DRB1*03:01-DQA1*05:01-DQB1*02:01 (3,4%), (8,0%), DRB1*13:01-DQA1*01:03- DQB1*06:03 (2,9%), DRB1*14:01-DQA1*01:04-DQB1*05:02 (2,9%), и DRB1*13:01DQA1*03:01-DQB1*03:01 (1,6%). Трех-локусные гаплотипы DRB1-DQB1-DQA1 с частотой ≥1,0% у казахского населения представлены в таблице 10, где частота этих гаплотипов сравнивается с частотами соответствующих гаплотипов в различных группах населения всего мира. Оценка частот двух-локусных гаплотипов (DRB1-DQB1 и DQB1-DQA1) и параметры неравновесного сцепления (LD) для них приведены в таблице 11. Таблица 10. Наиболее частые гаплотипы HLA-DRB1-DQA1-DQB1. Гаплотип 1 DRB1*07:01DA1*02:01DQB1*02:01/02:02a DRB1*03:01DQA1*05:01DQB1*02:01b Частота среди казахов, % 2 Распространение в мировых популяциях,% Возможное происхождение 3 4 8,0 Очень часто Европейско/Азиатское 3,4 Очень часто Европейско/Азиатское 60 продолжение таблицы 10 1 DRB1*13:01DQA1*01:03DQB1*06:03c DRB1*14:01DQA1*01:04DQB1*05:02d DRB1*13:01DQA1*03:01DQB1*03:01e DRB1*15:01DQA1*01:02DQB1*06:02f DRB1*07:01DQA1*03:01DQB1*02:02e DRB1*15:01DQA1*01:02DQB1*06:02g DRB1*07:01DQA1*03:02DQB1*02:02e DRB1*15:01DQA1*01:02DQB1*06:03h DRB1*15:02DQA1*01:03DQB1*06:01i DRB1*03:01DQA1*03:01DQB1*03:02e DRB1*09:01DQA1*03:03DQB1*02:02e DRB1*14:03DQA1*05:01DQB1*03:01j DRB1*13:01DQA1*01:03DQB1*06:04k 2 3 4 2,9 Очень часто Европейско/Азиатское 2,9 Часто Азиатское 1,6 Не найдено Казахское 1,3 Очень часто Европейско/Азиатское 1,3 Не найдено Казахское 1,3 Очень часто Европейское 1,0 Не найдено Казахское 1,0 Редко Европейско/Азиатское 1,0 Очень часто Европейско/Азиатское 1,0 Не найдено Казахское 1,0 Не найдено Казахское 1,0 Часто Европейско/Азиатское 1,0 Очень редко Африканское 61 окончание таблицы 10 1 2 3 4 DRB1*13:02DQA1*01:021,0 Часто Европейско/Азиатское l DQB1*06:04 DRB1*04:01DQA1*03:021,0 Не найдено Казахское e DQB1*03:01 DRB1*13:01DQA1*01:031,0 Не найдено Казахское k DQB1*05:01 Примечание: aНайдено у кучун-бурят (22,0%); у ханты-манси (16,9%) у казахов (Китая) (8,3%), bнайдено у итальянцев (Южная Италия) (25,3%); у русских (СевероЗапад) (9,0 %); у казахов (Китая) (13,1%), c найдено у ханты-манси (8,1%); у итальянцев (Северная Италия) (7,6%), у тоджинцев (6,8%); у русских (СевероЗапад) (5,5%); у казахов (Китая) (4,8%); dнайдено у корейцев (2,9%), eне было обнаружено в других популяциях, fнайдено у тоджинцев (22,5%); у англичан (14,1%), у аборигенов (Австралия) (10,0%); у русских (Северо-Запад) (9,0%); у казахов (Китая) (2,4%), gу итальянцев (Северная Италия) (14,1%); у словенцев (11,4%), hу аборигенов (Австралия) (7,0%),iу японцев (8,2%); у монголов (6,5%); у казахов (Китая) (2,4%), jу ханты-манси (8,1%); у итальянцев (Северная Италия) (7,6%); у казахов (Китая) (4,8%), kу камерунцев (1,2%), l у итальянцев (Северная Италия) (1,9%); у тувинцев (1,1%). Таблица 11. Частоты двух-локусных гаплотипов и параметры неравновесного сцеплении. Гаплотип DRB1-DQB1 na HFb D´c td 1 2 3 4 5 DRB1*07:01 - DQB1*02:01 23 0.0732 0.4650 5.48 DRB1*03:01 - DQB1*02:01 11 0.0350 0.2552 4.15 DRB1*07:01 - DQB1*02:02 10 0.0318 0.4249 2.61 DRB1*13:03-102 - DQB1*03:01 7 0.0223 0.2562 3.21 DRB1*11:04 - DQB1*03:01 6 0.0191 0.3915 2.14 DRB1*14:05-72 - DQB1*03:01 6 0.0191 0.3446 2.32 DRB1*03:01 - DQB1*03:02 4 0.0127 0.0754 2.37 62 продолжение таблицы 11 1 2 3 4 5 4 0.0127 -0.1693 4.82 na HFb D´c td DQB1*02:01 - DQA1*02:01 23 0.0732 0.7296 4.11 DQB1*03:02 - DQA1*03:01 15 0.0478 0.5687 3.13 DQB1*03:01 - DQA1*05:01 15 0.0478 0.3914 5.35 DQB1*03:01 - DQA1*05:05 12 0.0382 0.3045 4.99 DQB1*02:01 - DQA1*05:01 10 0.0318 0.2275 4.11 DQB1*03:04-22 - DQA1*03:02 8 0.0254 0.2123 3.15 DQB1*05:01 - DQA1*01:04 7 0.0223 0.2095 2.23 DQB1*03:01 - DQA1*05:06-10 7 0.0223 0.2562 3.21 DQB1*03:04-22 - DQA1*05:05 6 0.0191 0.1061 3.39 DQB1*03:04-22 - DQA1*03:01 6 0.0191 0.0314 4.96 DQB1*03:01 - DQA1*03:01 6 0.0191 -0.1794 7.31 DQB1*03:04-22 - DQA1*05:06-10 5 0.0159 0.1783 2.18 DQB1*05:01 - DQA1*01:02 4 0.0127 0.0647 2.55 DRB1*13:01 - DQB1*03:01 Гаплотип DQB1-DQA1 DQB1*03:01 - DQA1*03:02 4 0.0127 -0.1373 4.64 Примечание:aКоличество гаплотипов; bЧастота гаплотипа; cНеравновесное сцепление; dt value ≥2.0 признается статистически достоверным. 3.1.4 Генетические расстояния между казахской популяцией и другими этническими группами Дендограмма, построенная с помощью метода ближайших соседей была создана на основе частот аллелей гена HLA-DRB1 в различных популяциях, включая казахскую (Рисунок 5). Сравнивались частоты аллелей DRB1 у казахского населения с другими мировыми популяционными группами (европейскими, скандинавскими, средиземноморскми, сибирскими и азиатскими). Результаты анализа показали четкую дивергенцию между мировыми популяциями, 63 включенными в анализ. Дендрограмма генетических расстояний (Рисунок 6) показывает, что население Казахстана кластеризуется вместе с азиатскими и сибирскими популяциями отдельно от всех европейских, скандинавских и средиземноморских народов. Таким образом, по HLA-генам казахи, занимают промежуточное значение между европейцами и азиатами. Анализ генетического родства 74 этнических групп на основе аллельных частот HLA-DRB1 локуса, показаны на рисунке 6. Результаты показывают, что на основе анализа частот генов системы HLA класса II DRB1 все анализируемые этнические группы можно разделить на пять кластеров: азиатско-сибирский, американский, скандинавский, европейский и средиземноморский. Казахи вошли в кластер, в который также входят казахи Китая, уйгуры, монголы, тоджа, тувинцы и другие популяции Сибири и Азии. 64 Рисунок 5. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основе частот гена HLA-DRB1, показывающая генетические расстояния между казахской и некоторыми мировыми популяциями. 65 Рисунок 6. Многомерное шкалирование (MDS) 74 популяций на основе частот гена HLA-DRB1. Примечание: ■-Азия (1-13): 1) казахи (Астана), 2) казахи (Тарбагатай), 3) монголы,4) китайцы (ханьцы), 5) японцы, 6) казахи (Китай), 7) корейцы, 8) тайваньцы, 9) уйгуры, 10) малайцы, 11) тайцы, 12) вьеты, 13) турки. Δ-Сибирь (13-30): 14) алеуты, 15) чукчи, 16) эвенки, 17) кеты, 18) коряки, 19) буряты, 20) недигалы, 21) ненцы, 22) нивхи, 23) нганасаны, 24) эвенки (Охотск), 25) тоджинцы, 26) тофалары, 27) тувинцы 1, 28) тувинцы-2, 29) удегейцы, 30) ульчи. ♦-Америка (31-36): 31) аргентинцы, 32) мацатеканцы, 33) ачи, 34) эскимосы-1, 35) эскимосы-2, 36) юпик-аляска. ○-Eвропа (37-56): 37) австрийцы, 38) англичане, 39) немцы, 40) французы, 41) итальянцы (Северная Италия), 42) голландцы, 43) португальцы, 44) испанцы (Мадрид), 45) испанцы (Гранада), 46) албанцы, 47) башкиры, 48) беларусы, 49) болгары, 50) чуваши, 51) поляки, 52) русские (Северо-Запад), 53) русские (Урал), 54) сербы, 55) словаки, 56) украинцы. 66 ○-Средиземноморье (57-67): 57) армяне, 58) греки (Крит), 59) грузины, 60) греки, 61) итальянцы (Южная Италия), 62) арабы, 63) евреи Ашкенази, 64) курды, 65) ливанцы, 66) македонцы, 67) палестинцы, ○-Скандинавия (68-74): 68) финны, 69) ханты-манси, 70) коми, 71) норвежцы, 72) поморы, 73) саамы, 74) шведы. Стресс значение = 0.10 3.2 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к легочному туберкулёзу Распределение аллелей и гаплотипов для локусов DRB1, DQA1 и DQB1 у пациентов с ЛТБ и в контрольной группе приведены в таблицах 12, 13, 14, 15,16 и 17. Достоверность ассоциаций была рассчитана для всех трех локусов. 3.2.1 Ассоциации аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с легочным туберкулёзом. Всего при анализе HLA-DRB1, -DQB1 и -DQA1-аллелей среди пациентов с ЛТБ и контрольной группы были найдены 38 вариантов аллелей HLA-DRB1, из них 27 вариантов были найдены среди пациентов с ЛТБ, и 37 вариантов - в контрольной группе. DQB1-аллелей было идентифицировано 19, из них только 17 были обнаружены у пациентов с ЛТБ. DQA1-аллелей всего было идентифицировано 17, из них 15 - среди пациентов с ЛТБ. Частоты аллелей DRB1-локуса сравнивали между пациентами с ЛТБ и контрольной группой с использованием P value и χ2. Для данного локуса было установлено, что частоты аллелей, относящиеся к группам DRB1*08, значительно отличаются между двумя исследованными группами (таблица 12). Полученные результаты, представленные в таблице 12, свидетельствуют о том, что HLADRB1*08:01 встречался с большей частотой у пациентов (14,47%), чем у добровольцев из контрольной группы (OR = 8.69; 95% CI = 2.35-32.2; P = 0.0005), HLA-DRB1*08:03 также встречался с большей частотой в группе пациентов (10,53%), чем у добровольцев (3,18%) (OR = 3.58; 95% CI = 1.13-11.3; P = 0.047). 67 Достоверность результата сохранилась после коррекции Бонферрони, что указывает на ассоциацию указанных вариантов с ЛТБ. Tаблица 12. Частоты аллелей HLA-DRB1 у ЛТБ-пациентов и здоровых представителей казахской популяции. DRB1 ЛТБ Здоровые пациенты (n = 157), (n = 76), % (n) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d % (n) 1 2 3 4 5 6 7 *01:01 5,26 (4) 7,64 (12) 0.16 NS NS 7.17 [2.23-23.1] *01:02 0,00 (0) 0,64 (1) - - - - *03:01 14,47 (11) 18,47 (29) 0.35 NS NS 8.19 [3.80-17.6] *03:02 0,00 (0) 0,64 (1) - - - - *03:07 0,00 (0) 1,27 (2) - - - - *03:12 0,00 (0) 0,64 (1) - - - - *03:16 1,32 (1) 3,18 (5) 0.16 NS NS 0.41 [0.05-3.53] *03:29-56 1,32 (1) 1,27 (2) 0.35 NS NS 1.03 [0.09-11.6] *04:01 13,16 (10) 7,64(12) 1.23 NS NS 1.83 [0.75-4.45] *04:02 2,63 (2) 1,27 (2) 0.04 NS NS 2.09 [0.29-15.2] *04:03 2,63 (2) 2,55 (4) 0.03 NS NS 1.03 [0.18-5.77] *04:04-32 6,58 (5) 8,92 (9) 1.21 NS NS 0.42 [0.12-1.51] *07:01 14,47 (11) 24,20 (38) 1.78 NS NS 0.57 [0.27-1.19] *07:08 1,32 (1) 0,00 (0) - - - - *08:01 14,47 (11) 1,91 (3) 12.2 0.0005 0.02 8.69 [2.35-32.2] *08:02 1,32 (1) 1,27 (2) 0.35 NS NS 1.03 [0.09-11.6] *08:03 10,53 (8) 3,18 (5) 3.94 0.0471 NS 3.58 [1.13-11.3] 08:04-24 0,00 (0) 1,91(3) 68 продолжение таблицы 12 1 2 3 4 5 6 7 *09:01 1,32 (1) 8,92 (14) 3.73 NS NS 0.14 [0.02-1.06] *09:02 2,63 (2) 0,64 (1) 0.42 NS NS 4.22 [0.38-47.2] *10:01 0,00 (0) 2,55 (4) - - - - *11:01 7,89 (6) 4,46 (7) 0.59 NS NS 1.84 [0.59-5.67] *11:02 2,63 (2) 1,27 (2) 0.04 NS NS 2.05 [0.28-14.9] *11:03 1,32 (1) 5,73 (9) 1.48 NS NS 0.22 [0.03-1.76] *11:04 10,53 (8) 7,64 (12) 0.24 NS NS 1.42 [0.55-3.64] *11:06-62 9,21 (7) 5,14 (8) 0.84 NS NS 1.89 [0.66-5.42] *12:01 3,96 (3) 3,82 (6) 0.10 NS NS 1.03 [0.25-4.25] *12:02 5,32 (4) 2,55 (4) 0.48 NS NS 2.12 [0.52-8.74] *12:06 2,63 (2) 0,00 (0) - - - - *13:01 13,16 (10) 15,29 (24) 0.01 NS NS 1.04 [0.49-2.21] *13:02 3,98 (3) 6,37 (10) 0.20 NS NS 0.60 [0.16-2.26] *13:03-102 7,89 (6) 10,83 (17) 0.22 NS NS 0.71 [0.27-1.87] *14:01 10,53 (8) 8,92 (14) 0.02 NS NS 1.20 [0.48-3.00] *14:03 0,00 (0) 3,82 (6) - - - - *14:04 0,00 (0) 3,82 (6) - - - - *14:05-72 3,98 (3) 7,01(11) 0.39 NS NS 0.55 [0.15-2.02] *15:01 9,21(7) 10,19 (16) 0.00 NS NS 0.89 [0.35-2.27] *15:02 2,63 (2) 2,55 (4) 0.00 NS NS 1.03 [0.18-5.77] *16:01 0,00 (0) 1,27 (2) - - - - Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0,05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). Сравнение частот аллелей DQB1-локуса в двух исследованных группах представлены в таблице 13. У пациентов с ЛТБ аллель DQB1*02:01 был наиболее распространенным (28,95 %). В контрольной группе вариант DQB1*03:01 был 69 наиболее частыми 29,94%, далее следует DQB1*02:01 (25,47%). Было установлено, в локусе DQB1 имеются значительные различия в частоте DQB1*06:01 (таблица 13). Частота аллеля DQB1*06:01 составила 14,47% среди больных туберкулёзом и 5,14% в выборке здоровых людей (OR = 3.15; 95% CI = 1.21-8.20; P = 0.03). Tаблица 13. Частоты аллелей HLA-DQB1 у ЛТБ пациентов и здоровых представителей казахской популяции. ЛТБ DQB1 пациенты (n = 76), % (n) 1 Здоровые (n = 157), χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d % (n) 2 3 4 5 6 7 *02:01 28,95 (22) 25,47 (40) 0.16 NS NS 1.19 [0.65-2.20] *02:02 10,53 (8) 12,74 (20) 0.07 NS NS 0.81 [0.34-1.92] *02:03 2,63(2) 2,55 (4) 0.16 NS NS 1.03 [0.18-5.77] *02:04 1,32 (1) 5,14 (8) 1.08 NS NS 0.25 [0.03-2.02] *03:01 27,63 (21) 29,94 (47) 0.04 NS NS 0.89 [0.48-2.64] *03:02 13,16 (10) 14,01 (22) 0.03 NS NS 0.93 [0.42-2.07] *03:03 2,63 (2) 5,14 (8) 0.28 NS NS 0.50 [0.10-2.43] 13,16 (10) 19,10 (30) 0.89 NS NS 0.64 [0.29-1.39] *04:01 3,98 (3) 1,27 (2) 0.70 NS NS 3.18 [0.52-19.4] *04:02 3,98 (3) 4,46 (7) 0.03 NS NS 0.88 [0.22-3.50] *05:01 9,21 (7) 14,65 (23) 0.91 NS NS 0.59 [0.24-1.45] *05:02 5,26 (4) 9,55 (15) 0.32 NS NS 0.62 [0.19-1.95] *05:03 11,84 (9) 5,14 (8) 2.34 NS NS 2.43 [0.90-6.56] *05:04 0,00 (0) 1,91 (3) - - - - *05:05 0,00 (0) 0,64 (1) - - - - *06:01 14,47 (11) 5,14 (8) 4.83 0.03 NS 3.15 [1.21-8.20] *03:04-22 70 продолжение таблицы 13 1 2 3 4 5 6 7 *06:02 13,16 (10) 9,55 (15) 0.37 NS NS 1.43 [0.61-3.36] *06:03 7,89 (6) 8,28 (13) 0.01 NS NS 0.95 [0.35-2.60] *06:04-39 6,58(5) 3,18 (5) 1.54 NS NS 0.39 [0.11-1.39] Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). В исследованных группах выявлены различия между частотами определенных аллелей локуса HLA-DQA1: 25 пациентов (32,89%) и 21 здоровый испытуемый (13,36%) имели аллель DQA1*03:02 (OR = 3,17; 95% CI = 1.63-6.16; P = 0.008), аллель DQA1*03:03 встречается в 25,02% случаев среди больных и в 8,92% среди здоровых индивидуумов (OR = 3.40; 95% CI = 1.60-7.25; P = 0.0019) (Таблица 14). Tаблица 14. Частоты аллелей HLA-DQA1 у ЛТБ пациентов и здоровых представителей казахской популяции. ЛТБ пациенты Здоровые (n = 76), (n = 157), % (n) % (n) 2 *01:01 DQA1 χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d 3 4 5 6 7 13,16 (10) 6,40 (10) 2.02 NS NS 2.23 [0.88-5.61] *01:02 14,47 (11) 16,56 (26) 0.01 NS NS 0.89 [0.41-1.93] *01:03 17,11 (13) 17,83 (28) 0.02 NS NS 0.95 [0.46-1.96] *01:04 14,47 (11) 17,83 (28) 0.21 NS NS 0.78 [0.36-1.66] *02:01 10,53 (8) 17,83 (28) 1.57 NS NS 0.54 [0.23-1.25] *03:01 21,10 (16) 21,66 (34) 0.06 NS NS 1.16 [0.59-2.28] *03:02 32,89 (25) 13,36 (21) 11.1 0.0008 0.0136 1 3.17 [1.63-6.16] 71 продолжение таблицы 14 1 2 3 4 5 6 7 *03:03 25,02 (19) 8,92 (14) 9.61 0.0019 0.0323 3.40 [1.60-7.25] *04:01 2,63 (2) 5,14 (8) 0.28 NS NS 0.50 [0.10-2.43] *04:02-04 2,63 (2) 0,64 (1) 0.42 NS NS 4.22 [0.38-47.2] *05:01 11,84 (9) 11,47 (18) 0.01 NS NS 0.45 [0.44-2.43] *05:02 0,00 (0) 1,27 (2) - - - - *05:03 1,32 (1) 1,91 (3) 0.12 NS NS 0.68 [0.07-6.69] *05:05 17,11 (13) 19,11 (30) 0.04 NS NS 0.87 [0.43-1.79] *05:06-10 0,00 (0) 11,47 (18) - - - - *06:01 5,26 (4) 4,46 (7) 0.07 NS NS 1.19 [0.34-4.20] *06:02 5,26 (4) 0,64 (1) 3.25 NS NS 8.67 [0.95-78.9] Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым, NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). 3.2.2 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с легочным туберкулёзом. В исследуемых группах были проанализированы наиболее частые трехлокусные DRB1-DQA1-DQB1-гаплотипы (Таблица 15). Были обнаружены также статистически достоверные различия в частоте гаплотипов: частота встречаемости DRB1*08:03-DQА1*01:03-DQВ1*06:01 составила 6,58% среди пациентов и 1,27% в выборке здоровых людей (OR = 5.46; 95% CI = 1.03-28.8; P = 0.04). В контрольной группе наиболее распространенным (10,83%) был гаплотип DRB1*07:01DQB1*02:01-DQB1*02:01. У пациентов частота этого гаплотипа составила 2,63%, однако различия статистически не подтвердились (P<0.05). 72 Таблица 15. Распределение наиболее частых HLA-гаплотипов у ЛТБ-пациентов и здоровых казахов. Гаплотип ЛТБ Пациенты (n = 76), % (n) Здоровые (n = 157), % (n) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d DRB1*03:01DQA1*05:013,98 (3) 3,18 (5) 0.09 NS NS 1.25 [0.29-5.37] DQB1*02:01 DRB1*07:01DQA1*02:012,63 (2) 10,83 (17) 3.56 NS NS 0.22 [0.05-0.99] DQB1*02:01 DRB1*08:03DQA1*01:036,58 (5) 1,27 (2) 3.29 0.04 NS 5.46 [1.03-28.8] DQB1*06:01 DRB1*15:01DQA1*01:025,26 (4) 2.55 (4) 0.47 NS NS 2.13 [0.52-8.74] DQB1*06:02 Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P <0,05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). Положительное неравновесное сцепление (LD) было установлено для аллелей DRB1*08:03 и DQB1*06:01 (D´=0,041 среди пациентов и D´=0.006 среди здоровых; P<0.05). Неравновесное сцепление для аллелей DRB1*08:03 и DQA1*01:03 составило D´=0.028 у пациентов и D´=0.005 у контрольной группы, соответственно (P<0.05). Для аллелей DQB1*06:01-DQA1*01:03 связь по неравновесному сцеплению D´=0,030 в группе пациентов и D´=0,023 в группе здоровых участников (P<0.05). 3.2.3. Ассоциации аллелей HLA с мультирезистентным и монорезистентным легочным туберкулёзом. В дополнение было проведено сравнение частот аллелей HLA среди пациентов с мультирезистентным ЛТБ и контрольной группой (Таблица 16). 73 Результаты показали, что значительная различия были обнаружены только для аллелей HLA-DRB1*08:01 и DRB1*08:03 (P<0.05). Таблица 16. Частоты аллелей HLA у пациентов с мультирезистентным ЛТБ в сравнении со здоровыми. Пациенты с HLA мультирезистент аллели ным ЛТБ (n = 49), % (n) Здоровые (n = 157), χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d % (n) DQA1*03:02 24,49 (12) 13,36 (21) 2.65 NS NS 2.10 [0.95–4.66] DQA1*03:03 14,28 (7) 8,92 (14) 1.80 NS NS 2.23 [0.80–5.98] DQB1*06:01 14,28 (7) 5,14 (8) 3.41 NS NS 3.10 [1.06–9.06] DRB1*08:01 10,20 (5) 1,91 (3) 4.84 0.03 NS 5.83 [1.34–25.4] DRB1*08:03 12,24 (6) 3,18 (5) 4.40 0.04 NS 4.24 [1.23–14.6] Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P <0,05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). При сравнении частот аллелей у пациентов с мультирезистентным ЛТБ и пациентов с монорезистентным ЛТБ достоверных различий не выявлено (Таблица 17). Таблица 17. Частоты аллелей HLA у пациентов с мультирезистентным ЛТБ в сравнении с пациентами с монорезистентным ЛТБ. HLA аллели Пациенты с Пациенты с мультирезис- монорезис- тентным ЛТБ тентным ЛТБ χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d (n = 49), % (n) (n = 10), % (n) 1 2 3 4 5 6 7 DQA1*03:02 24,49 (12) 30,00 (3) 0.00 NS NS 1.24 [0.28-5.42] 74 продолжение таблицы 17 1 2 3 4 5 6 7 DQA1*03:03 14,28 (7) 20,00 (2) 0.00 NS NS 0.67 [0.12-3.81] DQB1*06:01 14,28 (7) 10,00 (1) 0.02 NS NS 1.50 [0.16-13.7] DRB1*08:01 10,20 (5) 10,00 (1) 0.31 NS NS 1.02 [0.11-9.84] DRB1*08:03 12,24 (6) 10,00 (1) 0.11 NS NS 1.26 [0.13-11.7] Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0,05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). 75 3.3 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к ревматоидному артриту Распределение аллелей и гаплотипов в изучаемых группах для локусов DRB1, DQA1 и DQB1 представлены в таблицах 18, 19, 20, 21, 22, 23 и 24. Достоверность ассоциаций была рассчитана для всех трех локусов. 3.3.1 Ассоциации групп аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с ревматоидным артритом Полученные результаты, представленные в таблице 18, свидетельствуют о том, что у пациентов в локусе DRB1 наиболее часто представлены аллели группы DRB1*04 (45,0%), далее следуют аллели DRB1*15 (23,7%) и *07 (18,3%). В контрольной группе превалирующее число аллелей относятся к DRB1*13 (29,9%), далее по убыванию следуют DRB1*07 (24,2%), DRB1*03 (23,6%), DRB1*14 (23,6%) и DRB1*04 (18,5%). Частоты аллелей сравнивали между пациентами и контрольной группой с использованием χ2. Для DRB1-локуса было установлено, что частоты аллелей, относящиеся к группам DRB1*04 и DRB1*13, значительно отличаются между двумя исследованными группами (Таблица 18, 21). Аллель DRB1*04 более часто (45,0%) определяли среди пациентов, тогда как его частота в контрольной группе была довольно низкой (18,5%, P = 3Е-06, OR = 3.62 (95% CI = 2.13-6.15). Достоверность результата сохранилась после коррекции Бонферрони, что указывает на ассоциацию указанных вариантов с РА. Частота DRB1*13 была более низкой в группе пациентов (13,7%) и значительно более высокой - в контрольной группе (29,9%). Значение уровня достоверности была P<0.001, OR=0.37 (95% CI=0.20-0.68), соответственно, пациенты с РА и контрольная группа значительно различались по DRB1*13. 76 Tаблица 18. Частоты аллелей гена DRB1 в группах пациентов с РА и здоровых казахов. Количество %, (n) DRB1* Пациенты Здоровые (n = 131) (n = 157) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d *01 10,7 (14) 8,3 (13) 0.49 NS NS 1.33 (0.60-2.93) *03 14,5 (19) 23,6 (37) 3.75 NS NS 0.55 (0.30-1.01) *04 45,0 (59) 18,5 (29) 23.7 3Е-06 4Е-05 3.62 (2.13-6.15) *07 18,3 (24) 24,2 (38) 1.46 NS NS 0.70 (0.40-1.25) *08 6,9 (9) 7,6 (12) 0.06 NS NS 0.89 (0.36-2.19) *09 12,2 (16) 9,6 (15) 0.53 NS NS 1.31 (0.62-2.78) *10 6,1 (8) 2,5 (4) 2.27 NS NS 2.49 (0.73-8.46) *11 8,4 (11) 17,8 (28) 5.43 0.04 NS 0.42 (0.20-0.86) *12 10,7 (14) 5,1 (8) 3.16 NS NS 2.23 (0.90-5.49) *13 13,7 (18) 29,9 (47) 10.7 0.001 0.037 0.37 (0.20-0.68) *14 9,9 (13) 23,6 (37) 9.30 0.004 NS 0.36 (0.18-0.71) *15 23,7 (31) 12,7 (20) 5.85 0.023 NS 2.12 (1.14-3.94) *16 2,3 (3) 1,3 (2) 0.43 NS NS 1.81 (0.30-11.04) Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). Группа аллелей HLA-DQA1*03 также продемонстрировала ассоциативную связь с РА (OR оценивается в 1.87 (Р = 0.01)), однако после коррекции поправкой Бонфферони эта ассоциативная связь статистически не подтвердилась (Таблица 19). 77 Таблица 19. Частоты аллелей гена DQA1 в группах пациентов с РА и здоровых казахов. Количество %, (n) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d 51,6 (81) 1.49 NS NS 1.34 (0.84-2.14) 18,3 (24) 19,1 (30) 0.03 NS NS 0.95 (0.52-1.72) *03 55,0 (72) 39,5 (62) 6.87 0.01 NS 1.87 (1.17-2.99) *04 0,8 (1) 5,7 (9) 5.26 NS NS 0.13 (0.02-1.01) *05 30,5 (40) 39,5 (62) 2.50 NS NS 0.67 (0.41-1.10) *06 4,6 (6) 5,7 (9) 0.19 NS NS 0.78 (0.27-2.28) Пациенты Здоровые (n = 131) (n = 157) *01 58,8 (77) *02 DQA1* Хи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; d Отношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). a Сравнение частот аллелей DQB1-локуса в двух исследованных группах представлены в таблице 20. У пациентов с РА группа аллелей DQB1*03 была наиболее распространенной (66,4%), DQB1*06 и DQB1*02 имели частоту 39,7% и 31,3% соответственно. В контрольной группе вариант DQB1*03 также был наиболее частым (63,7%), далее следуют DQB1*02 (45,2%) и DQB1*05 (31,2%). Было установлено, в локусе DQB1 имеются значительные различия в частоте DQB1*02 (таблица 20), которая была выше в контрольной группе по сравнению с пациентами РА (P =0.02; OR = 0.55; 95% CI = 0.34-0.90) Tаблица 20. Частоты специфичностей гена DQB1 в группах пациентов с РА и здоровых казахов. Количество %, (n) DQB1* 1 Пациенты Здоровые (n = 131) (n = 157) 2 3 χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d 4 5 6 7 78 продолжение таблицы 20 1 2 3 4 5 6 7 *02 31,3 (41) 71 (45.2) 5.82 0.02 NS 0.55 (0.34-0.90) *03 66,4 (87) 63,7 (100) 0.23 NS NS 1.13 (0.69-1.83) *04 6,9 (9) 6,4 (10) 0.03 NS NS 1.08 (0.43-2.75) *05 27,5 (36) 31,2 (49) 0.48 NS NS 0.84 (0.50-1.39) *06 39,7 (52) 29,3 (46) 3.44 NS NS 1.59 (0.98-1.87) Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P <0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). 3.3.2 Ассоциации аллелей HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 с ревматоидным артритом. В таблице 21 приведены частоты HLA-DRB1*04 аллелей в контрольной группе и группе пациентов. Аллель HLA-DRB1*04:01 является самым частым, который обнаруживали у пациентов с РА, по сравнению с контрольной группой (30,5% против 7,6%, Pc = 1E-04). Аллель HLA-DRB1*04:02 не был представлен в группе пациентов, а в контрольной группе его частота была очень низкой. Частота аллеля DRB1*04:03 у пациентов и в контрольной группе была примерно одинаковой (2.3% у пациентов и 2.5% среди здоровых). Частоты аллелей DRB1*04:04-75 встречались чаще у пациентов с РА, чем у здоровых (15,3% против 5,7%, P = 0.01). В группе аллелей HLA-DRB1*13 у здоровых участников, было обнаружено увеличение частоты аллеля HLA-DRB1*13:01 (15,3%), по сравнению с пациентами (3,8%) (Р = 0.002), в то время как частота аллеля DRB1*13:02 в обеих группах (9,2% и 6,4%) статистически не различалась. Хотя частота DRB1*13:03 была выше в контрольной группе (10,8% против 0,8% в группе пациентов), после коррекции Бонферрони значение Рс = 0.001 не было статистически значимым (таблица 21). 79 Tаблица 21. Распределение аллелей HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 среди пациентов и здоровых индивидуумов. DRB1* Количество %, (n) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d 7,6 (12) 23.76 2E-06 1E-04 5.31 (2.65-10.65) 0,0 (0) 1,3 (2) 0.00 - - - 2,3 (3) 2,5 (4) 0.06 NS NS 0.90 (0.19-4.07) 15,3 (20) 5,7 (9) 6.15 0.01- NS 2.51 (1.30-6.75)- *13:01 3,8 (5) 15,3 (24) 9.14 0.002 NS 0.21 (0.08-0.59) *13:02 9,2 (12) 6,4 (10) 0.44 NS NS 1.48 (0.62-3.55) *13:03 0,8 (1) 10,8 (17) 10.68 0.001 NS 0.06 (0.01-0.48) Пациенты Здоровые (n = 131) (n = 157) *04:01 30,5 (40) *04:02 *04:03 *04:04-75 Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). 3.3.3 Ассоциации генотипов HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 с ревматоидным артритом. Следующим шагом данного исследования было изучение связи между HLADRB1*04 и HLA-DRB1*13 с восприимчивостью к ревматоидному артриту. Для этого мы распределили исследуемые группы на 6 условных диплотипов, которые представлены в таблице 22. Из данных, представленных в таблице следует, что количество гомозиготных пациентов c диплотипом DRB1*04/*04 составило 6,1%, однако среди группы контроля гомозигот выявлено не было. Примечательно, что в то время как диплотип DRB1*04/*04 был обнаружен у 32,8% пациентов, в контрольной группе эта комбинация была обнаружена только в 17,2% (Pc = 0.02, OR=2.35, 95% CI=1.35-4.08,). Разница в пропорции диплотипа DRB1*04-/*13между группами пациентов и контрольной не наблюдается (48,1% и 52,2% соответственно). Сочетание обоих вариантов гена HLA-DRB1*04 и DRB1*13 80 наблюдалась в исследуемых группах очень редко. Так, только 6,9% пациентов имело диплотип DRB1*04/*13, в контрольной группе пропорция этого диплотипа составила еще меньше - 1,9% случаев, однако разница между пациентами и контролем была статистически не достоверна. Статистически достоверной оказалась отрицательная связь диплотипа DRB1*04-/*13 с ревматоидным артритом (Pc = 0.0006, OR = 0.23, 95% CI = 0.11-0.50). Полученные данные свидетельствуют о том, что в отличие от группы пациентов, где носителями данного диплотипа являются 6,9% участников, в контрольной группе их количество составляет 24,2%. Интересно, что диплотип, содержащий двойную комбинацию аллеля DRB1*13 (DRB1*13/*13) в группе пациентов вообще не был представлен, в то время как данный диплотип встречался у 4,5% здоровых участников. Таблица 22. Риск развития РА у индивидумов с HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 Количество, % (n) Здоровые РАПациенты DRB1/DRB1 (n=157) (n=131) *04/*04 6,1 (8) 0,0 (0) Диплотип χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d - - - - *04/*04- 32,8 (43) 17,2 (27) 8,64 0.003 0.02 2.35 (1.35-4.08) *04-/*13- 48,1 (63) 52,2 (82) 0,34 NS NS 0.85 (0.53-1.35) *04/*13 6,1 (8) 1,9 (3) 2,38 NS NS 3.34 (0.87-12.85) *04-/*13 6,9 (9) 24,2 (38) *13/*13 0,0 (0) 4,5 (7) 14,47 0.0001 0.0006 - - - 0.23 (0.11-0.50) - Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P <0,05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). 3.3.4 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с ревматоидным артритом В дополнение к частотам аллелей, были проанализированы трех-локусные DRB1-DQA1-DQB1-гаплотипы, которые содержали DRB1*04 и DRB1*13, для 81 которых были найдены ассоциативные связи с РА (Таблица 23). Так, гаплотип DRB1*04-DQА1*03-DQB1*03 был наиболее распространенным (35,8% у пациентов против 12,1% у здоровых, P = 5Е-6). В контрольной группе наиболее распространенным (15,9%) был гаплотип DRB1*13-DQB1*01-DQB1*06. У пациентов пропорцию этого гаплотипа определили в 13,0%. Также наблюдается тенденция протективного эффекта у гаплотипа DRB1*13-DQB1*05-DQB1*03, второго наиболее частого гаплотипа в группе контроля (9,6%), против 0,8% в группе пациентов. Анализ полиморфизма аллелей показывает, что аллели с возможным протективным эффектом представляли собой аллели, которые имеют высокую частоту в азиатских популяциях. В то время как алелли, ассоциированные с риском развития РА более наиболее часто были представлены в европейских и средиземноморских популяциях. Таким образом, лица казахской популяции, имеющие в генотипе "европейские" аллели, имеют повышенную склонность к развитию РА, а несущие аллели азиатских популяций – устойчивость к его развитию. Наши данные согласуются с аналогичными данными, полученными в башкирской популяции Южного Урала [234]. Таблица 23. Частота гаплотипов DRB1- DQА1-DQB1 у больных РА в сравнении с группой здоровых людей. Гаплотип 1 DRB1*04 DQA1*03 DQB1*02 DRB1*04 DQA1*03 DQB1*03 Количество %, (n) Пациенты (n = 131) Здоровые (n = 157) χ2a Pb Pсc OR [95% CI]d 2 3 4 5 6 7 0,8 (1) 0,6 (1) 0.34 NS NS 1.2 (0.1-19.4) 35,8 (47) 12,1 (19) 21.5 5E-6 1E-4 4.06 (2.2-7.4) 82 продолжение таблицы 23 1 2 3 4 5 6 7 DRB1*04 DQA1*03 6,1 (8) 2,5 (4) 2.3 0.22 NS 2.5 (0.7-8.5) DQB1*04 DRB1*13 DQA1*01 13,0 (17) 15,9 (25) 0.5 0.59 NS 0.8 (0.4–1.5) DQB1*06 DRB1*13 DQA1*05 0,8 (1) 9,6 (15) 10.5 0.003 NS 0.1 (0.01- 0.6) DQB1*03 Примечание: aХи-квадрат; bзначение P; сПоправка Бонферрони для коррекции значения Р; dОтношение шансов и соответствующие доверительные интервалы приведены на 95%; P<0.05 считается значимым; NS - различие статистически недостоверно (P>0.05). В таблице 24 представлены результаты по неравновесному сцеплениею локусов DRB1 и DQB1, для которых наблюдается ассоциативная связь. Анализ показал, что слабая положительная связь по неравновесному сцепление (LD) наблюдается у пациентов между аллелем DRB1*04 и DQB1*03 (P<0.001, D'=0.4821), а также и среди здоровых (P<0.001, D' = 0.5968) (Таблица 24). Таблица 24. Частоты и параметры неравновесного сцепления для DRB1-DQB1 гаплотипов в группах пациентов с РА и здоровых участников. Пациенты (n=131) DRB1-DQB1 na HFb D´c r2d Pe 1 2 3 4 5 6 DRB1*04-DQB1*02 10 0.0382 -0.1310 0.0012 NS DRB1*04-DQB1*03 47 0.1793 0.4821 0.1086 <0.001 DRB1*04-DQB1*04 5 0.0191 0.4029 0.0168 0.04 DRB1*04-DQB1*06 1 0.0038 -0.9348 0.0892 <0.001 DRB1*13-DQB1*03 3 0.0115 -0.6067 0.0199 0.02 DRB1*13-DQB1*06 15 0.0573 0.7838 0.1526 <0.001 83 продолжение таблицы 24 1 2 3 4 5 6 Здоровые (n=157) DRB1-DQB1 na HFb D´c r2d Pe DRB1*04-DQB1*02 3 0.0095 -0.5669 0.0102 NS DRB1*04-DQB1*03 22 0.0701 0.5968 0.0541 <0.001 DRB1*04-DQB1*04 3 0.0095 0.2288 0.0169 0.02 DRB1*04-DQB1*05 1 0.0031 -0.7876 0.0122 NS DRB1*13-DQB1*03 24 0.0764 0.0721 0.0016 NS DRB1*13:DQB1*06 21 0.0669 0.2800 0.0749 <0.001 Примечание: aколичество гаплотипов в изучаемой группе; bчастота встречаемости; с неравновесное сцепление генов (альтернативная величина LD); dквадрат корреляционного коэффициента двух локусов; P <0.05 считается значимым; NS различие статистически недостоверно (P>0.05). 3.3.5 Мета-анализ ассоциаций HLA-DRB1 с ревматоидным артритом В мета-анализ вошло 7094 пациента с РА и 6710 здоровых участников из 24 популяций, которые мы исследовали на наличие ассоциации HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13 с РА (Рисунок 7, 8). Для анализа были использованы литературные данные исследований проведенных в следующих популяциях: французы [235], англичане [236], голландцы [237], шведы [238], немцы [239], швейцарцы [240], венгры [241], албанцы [242], греки [243], турки [244], египтяне [245], кувейтцы [246], индийцы [247], пакистанцы [248], корейцы [249], японцы [250], малайцы [251], китайцы [252], алжирцы [253], сирийцы [254], иранцы [255], русские [256], башкиры [234], казахи [данное исследование]. Наши результаты показывают, что носители HLA-DRB1*04 в казахской популяции имеют повышенный риск РА с OR=3.62. Сила этой ассоциации является самой высокой у западных европейцев (например, у британцев OR=7.02) и самой низкой - у азиатов (у пакистанцев OR=0.65). Об ассоциации HLA-DRB1*04 с РА в различных этнических популяциях сообщалось ранее [234,237,238,29,240,241,242,243]. Проведенный нами мета- 84 анализ подтверждает предыдущие данные об достоверной ассоциации HLADRB1*04 с РА. Проведенный анализ показывает, что прочность HLA и РА ассоциаций может различаться в зависимости от этнической группы. Риск развития РА, связанный с HLA-DRB1*04, выше среди представителей европейских популяций, и не наблюдается среди всех популяций Азии. Таким образом, различные этнические группы могут иметь различные HLA-ассоциации с РА. Так, например, у пакистанцев РА связан с HLA-DRB1*10 [248]. Казахская популяция показывает ассоциацию, аналогичную для большинства европейских популяций с OR=3.62. Проведенный мета-анализ подтверждает, что HLA-DRB1*13, возможно, обладает протекторным эффектом, не только в казахской популяции, но и в некоторых популяциях Европы и Азии, с OR=0.486 (95% CI 0.435-0.543). Необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы выяснить функциональное участие HLA-DRB1*13 в патогенезе РА. Нужно подчеркнуть, что для аллелей HLA-DRB1*11, DRB1*14, DRB1*15, DQA1*03 и DQB1*02 имеются различия частот между пациентами РА и здоровыми людьми. Однако, эта разница после коррекции Бонферрони стала статистически не значимой. Однако, в ряде исследований сообщалось об этих аллелях как связанных с иммунноопосредованными заболеваниями [51,67,68,87,91,103,117,117,136]. В заключение, данный мета-анализ демонстрирует сильную ассоциацию между HLA-DRB1*04 и РА. Эта ассоциации изменяется в зависимости от этнической принадлежности. Аллели из группы HLA-DRB1*04 являются фактором риска РА, в то время как аллели из группы HLA-DRB1*13, возможно, обладают защитным эффектом. Не удивительно, что именно DRB1*04 имеет высокую частоту у РА-пациентов Казахстана, это согласуется с общепринятой концепцией эпитопа, придающего восприимчивость к РА [257,258] На примере казахской популяции видна сложная система факторов риска, ассоциированных с различными генотипами HLA-DRB1. Географическое положение территории, на которой формировалась казахская популяция, возможно, также может обусловливать генетическую восприимчивость к развитию РА. Данные этнические особенности, оказывают влияние на генную экспрессию 85 среди РА-пациентов из казахской популяции. Как уже говорилось выше, HLADRB1*04 аллель с общим эпитопом (“shared epitope” (SE) [257,258], статистически достоверно ассоциирован с риском развития РА в казахской популяции, имеет пептидный мотив QKRAA Данный аллель HLA-DRB1*04 ассоциируется с РА у больных Европы [234,236,237,238,241,242,243]. У казахов DRB1*13, обладающий DRB1*10 обнаружено не было, данные аллели связаны с РА в средиземноморских популяциях. Однако следует обратить внимание, что в данных популяциях протективным аллелем относительно РА является HLA-DRB1*11 [259,260], который имеет тенденцию к протективности в нашей исследуемой группе пациентов с РА. Интересно, что DRB1*15 у казахов показывающий тенденцию к восприимчивости к РА, связан у РА-пациентов Швеции с очень высоким уровнем анти-цитруллинированных белковых антител (ACPAs), являющихся важным биомаркером для ревматоидного артрита [261]. Анализируя частоту аллеля DRB1*14, можно предположить, что данный аллель, возможно, негативно связан с РА, что также наблюдается в азиатских популяциях [251,252]. Рисунок 7. Мета-анализ аллеля DRB1*04 86 Во обзоре литературы, посвященном генетике ревматоидного артрита [262], авторы делают вывод, что, вероятно, HLA-DR-гены действуют косвенно, через регулирование производства аутоантител, участвующих в развитии и исходе РА. В действительности, эпитоп (SE), возможно, является основным фактором риска для повышенной продукции ACPA при РА [263,264,265]. Среди HLA-DRB1-аллелей, ACPA производство было связано в основном с HLA-DRB1*04, чем с HLADRB1*01. Среди аллелей, относящихся к группе HLA-DRB1*04, аллели *04:01, *04:04, *04:05 и *04:08, демонстрируют наиболее тесную связь между эпитопом и продукцией ACPA [266]. Среди HLA-DRB1-аллелей, не несущих эпитоп (SE), варианты HLA-DRB1*13 и DRB1*15 также связаны с синтезом ACPA [267]. Недавние исследования, однако показали, что HLA-DRB1*13 и HLA-DRB1*03 могут быть отрицательно связаны с ACPA [268]. Кроме того, HLA-DRB1*13, возможно, является защитным фактором по отношению к РА [269]. Рисунок 8. Мета-анализ аллеля DRB1*13 87 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Межпопуляционный аспект HLA-полиморфизма. Целью настоящего исследования являлось определение аллельного разнообразия II класса HLA-генов (HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1), а также поиск высокоспецифичных для казахского этноса аллелей и гаплотипов, которые имеют низкую частоту в других популяциях мира. Частоты HLA аллелей были использованы для компьютерных расчетов двумерных генетических расстояний, метода объединения ближайших соседей, многомерного шкалирования (MDS), и расчета трех-локусных гаплотипов HLA (см. Tаблицу 7). Высокие частоты DRB1*07:01 (13,1%) и DRB1*03:01 (10,0%) наблюдаются в казахской популяции, аналогичные частоты этих двух аллелей, наблюдались также в других популяциях казахов [216]. Аллель DRB1*03:01 присутствует почти во всех европейских и азиатских популяциях [182], в частности, у 13,1% казахов Китая [216] и 14% уйгурского населения [217]. Аллель DRB1*07:01 представлен почти во всех популяциях мира, например, у немцев 12,6% [182], у русских (13,5% на Урале [188], 12% на Северо-Западе России [193]), у 10,7% казахов (Китай) [216], у 16,7% уйгуров [217] и у 26% бурят [204]. В отношении других аллелей, у казахов часто обнаруживается аллель DRB1*13:01 (8,6%), который широко распространен среди ряда азиатских и сибирских популяций, в частности, у кетов (23,5%) [211], ханты-манси (12,5%) [204] и тоджа (9,1%) [204]. Таким образом, DRB1*13:01 присутствует в большей мере в сибирских и азиатских популяциях, чем в европейских [182, 270]. Типичные азиатские аллели, такие как DRB1*09:01 представлены относительно часто и среди казахов (4.5%). Согласно данным литературы, этот аллель встречается в Азии примерно от 11,9% в китайской популяции [213] до 32% у малайцев [271]. Интересно, что у казахов, проживающих в Актюбинской области (Казахстан), этот аллель имеет частоту 3,9% [11], а у казахов, проживающих в регионе Тарбагатая, который ближе к Китаю, частота этого аллеля составляет 4,8%, казахи, которые 88 живут в Китае, имеют частоту этого аллеля уже 7,1% [216]. У китайцев частота аллеля DRB1*09:01 составляет 11,9% [213] и у монголов - 6,5% [182]. Таким образом, существует тенденция повышения частоты аллеля DRB1*09:01 среди групп казахов с запада на восток. У казахского населения четко представлены как азиатские, так и неазиатские аллели. У казахов из Астаны определялся аллель DRB1*04:05, который встречается в азиатских популяциях с частотой 6-14% [182]. Этот аллель также характерен для популяций монгольского происхождения. В то же время аллели DRB1*11:01 и DRB1*11:04, характерные для арабских этнических групп [182], были найдены у казахов с частотами 3,5% и 3,8% соответственно. Что касается гена HLA-DQB1, среди казахов были обнаружены 19 аллелей (Таблица 7). Среди казахского населения два аллеля суммарно превышали пропорцию в 30%: DQB1*02:01 (13,6%) и DQB1* 03:01 (17,6%). Аллель DQB1*02:01 был выявлен также и в других азиатских популяциях: у казахов из Китая (23,8%) [187], монголов (11,5%) [153], тоджа (4,5%) [153] и тувинцев из России (10,2%) [204,217]. Аллель DQB1*03:01 встречался немного реже у исследуемой группе казахов (17,6%), чем у казахов из Китая (21,4%) [216], монголов (25,5%) [182], тоджа (36,4%) [175] и тувинцев (28,4%) [204,217]. У казахов были найдены несколько гаплотипов, которые могут быть уникальными, потому что пока не найдены в других популяциях мира (Таблица 10): DRB1*07:01-DQA1*03:02-DQB1*02:02; DRB1*14:01-DQA1*01:04- DQB1*05:01; DRB1*13:01-DQA1*01:03-DQB1*05:01; DRB1*11:01-DQA1*05:01DQB1*03:04 и DRB1*03:01-DQA1*03:01-DQB1*03:02. Березина Г. и др. в 2011 году, при исследовании полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК) показали, что у казахского населения присутствуют 55% гаплогрупп мтДНК из Западной Евразии и 41% гаплогрупп мтДНК из Восточной Евразии. Авторы выяснили, что линии мтДНК Восточной Евразии занимают 55% в современном генофонде казахов: 36,2% представлены гаплогруппами D, C, G и Z; 6,9% относится к гаплогруппам A и F; 11,9% к другими гаплогруппами Азии. 41% от казахского генофонда представлены линиями 89 Западной Евразии, в частности гаплогруппа H - 14,1%, Т - 5,5%, J - 3,6%, U5 - 3%, K - 2,6%, и на долю других приходится 12,2%. Было высказано предположение, что между населением России и казахским населением приграничных северных областей Казахстана произошел интенсивный обмен генами [169]. Однако результаты анализа нерекомбинирующего региона Y-хромосомы (NRY) не показали связь между казахами и русскими. Наиболее частые гаплогруппы, присутствущие в южной России, принадлежат R1a, N1с и I1b [272]. Хотя гаплогруппа R1a и представлена у алтайских казахов, гаплогуппы N1c и I1b не были найдены ни в одной из казахских популяций. Таким образом, в то время как данные по мтДНК показывают обмен генов с русскими, данные по NRY позволяют сделать вывод, что взаимодействие данных групп было ограниченно. В то время как предположение о взаимодействии коренного населения Азии и Сибири подтверждается данными о том, что казахстанские маркеры Y-хромосомы принадлежат в основном к С3+, C3C и O3 гаплогруппам, которые были получены ими от населения юга Сибири или по происхождению являются монгольскими [273]. Самые высокие частоты C3*-кластера, который приписывается потомкам Чингисхана наблюдались у алтайских казахов [274]. Частоты гаплогруппы С очень распространены в Монголии (15%) и в популяциях Центральной Азии (7-18%) [275]. В 1991 году, было проведено изучение разнообразия HLA-аллелей среди некоторых европейских, монгольских и смешанных этнических групп, проживающих на территории бывшего СССР. Авторы исследования пришли к выводу, что данные по HLA-полиморфизму в целом согласуются с антропологической информацией [276]. Казахи характеризуются наличием HLAаллелей, которые присутствуют и у европейцев, и у азиатов, хотя каждая из этих популяций имеет свой особый профиль HLA-генов. Распределение HLA-аллелей у казахов согласуется с аналогичными данными по популяциям из Монголии. Эти данные подтверждают гипотезу о существовании потока генов между европейскими, азиатскими и сибирскими народами, что может быть связано с миграцией народов из Азии и/или Сибири в Европу. Культурные особенности 90 населения Евразии подтверждают генетические контакты между Азией и Сибирью. Исходя из этих результатов можно предположить, что популяция казахов генетически близка с народами Европы, Сибири и Азии. Казахи, уйгуры, буряты, монголы и жители Северного Китая представляют определенную промежуточную группу, которая постепенно теряя HLA-специфичности, характерные для европейских популяционных групп, накапливает HLA-аллели, характерные для населения Юго-Восточной Азии [277, 278]. Дендограмма, построенная на основании метода объединения ближайших соседей по аллельному полиморфизму локуса HLA-DRB1, показывает генетическое родство казахского населения с мировыми популяциями (Рисунок 5). Популяции сгруппированы в две основные ветви, которые связаны между собой. С одной стороны группируются казахи исследуемой группы, казахи (Тарбагатай), монголы, казахи Китая, тувинцы, тоджа и другие народы Азии и Сибири. С другой стороны - европейские, средиземноморские и скандинавские этнические группы. Казахское население показывает генетическую связь с сибиряками и азиатами. Исследование HLA-полиморфизма, подтверждает исторические и другие генетические данные, что для населения Казахстана характерны черты азиатского антропологического типа, хотя формировалось оно под влиянием различных этнических групп: азиатских, сибирских и европейских. Миграции и смешение различных этносов являются основным фактором, определяющим генетическоое разнообразие казахского населения. Наконец, казахи генетически отличаются от других азиатов (Рисунок 5 и 6), так как их HLA-генофонд включает аллели из Европы, Азии и населения Сибири. Казахи генетически связаны с казахами Тарбагатая, казахами Китая и уйгурами (Рисунок 6). Генетическая кластеризация соответствует географическому месту проживания популяций. Следует отметить, что относительно высокая степень неоднородности в азиатских и сибирских популяциях по сравнению с европейскими может быть связана с их более широким ареалом проживания. Азиатские, и, особенно, сибирские народы в значительно большей мере изолированы друг от друга, в то 91 время как европейские популяции живут более компактно на ограниченной территории, что обеспечивает им возможность более интенсивных контактов. Полученные результаты о значительном генетическом разнообразии HLAлокусов и гаплотипов в казахской популяции могут служить в качестве контроля для любого исследования по направлению «HLA и болезни», например, при исследовании туберкулёза в казахской популяции [174]. Данные о распределении HLA-аллелей у казахов позволит также в будущем использовать полученные результаты для поиска HLA-совместимых доноров, например, для трансплантации ГСК, что предопределяет клиническую значимость настоящего исследования. 4.2 HLA-полиморфизм и восприимчивость к легочному туберкулёзу. Ранее, в HLA-исследовниях, проведенных в Азии, была показана ассоциация HLA-DR2 и -DQ1 антигенов с туберкулёзом [104,105,279]. В Cеверной Индии, у пациентов с ЛТБ, частота встречаемости аллеля DRB1*15:01 и DRB1*15:02 была достоверно выше у ЛТБ-пациентов, чем в группе контроля [104,105]. Кроме того, исследования, проведенные в Южной Индии, показали, что гаплотип HLADRB1*15:02-DQB1*06:01-DPB1*02:01 положительно связан с восприимчивостью к легочному туберкулёзу [106,280]. В разных популяциях были определены конкретные аллели и гаплотипы HLA класса I и II, которые связаны с туберкулёзом, например, Yuliwulandari и др. [281], установили их роль в восприимчивости и устойчивости к ЛТБ у населения Индонезии. Их результаты показали, ассоциацию HLA-B*40:06 с новыми случаями ЛТБ, в то время как HLA-B*18:02, HLA-B*40:01 и HLA-DRB1*11:01 были связаны с рецидивирующим ЛТБ. Гаплотип HLA-B*18:02-DRB1*12:02 также был связан с восприимчивостью к рецидивирующим ЛТБ [240]. Ассоциация с туберкулёзом зарегистрированы для аллелей HLA-DQB1*05:03 и DQB1*05:02 у вьетнамских и тайских пациентов, соответственно [282], DRB1*16:01 и DQB1*05:02 у поляков [107,283] и DRB1*07 и DQA1*01:01 у иранцев [104]. В мексиканской популяции, частота аллелей HLA-DQA1*01:01, DQB1*05:01, и DRB1*15:01 достоверно выше 92 у не-иммуносупрессированных пациентов с ЛТБ, в то время как частота HLADQB1*04:02 и DRB1*08 была достоверно ниже [284]. В нашей работе было найдено, что аллели DQA1*03:02, DQA1*03:03, DQB1*06:01, DRB1*08:01 и DRB1*08:03, встречаются достоверно (P<0.05) чаще среди пациентов с ЛТБ, чем у здоровых добровольцев. Кроме того, частота встречаемости гаплотипов DRB1*08:03-DQA1*01:03-DQB1*06:01 среди пациентов с туберкулёзом была достоверно выше, чем среди здоровых людей. Однако, часть выявленных HLA аллелей у пациентов с ЛТБ встречается и при других заболеваниях. Например, DQA1*03:02 и DQA1*03:03 значительно чаще обнаруживали у лиц с ревматоидным артритом, чем в контрольной группе на Тайване [285]. HLA-DQB1*06:01 связан с восприимчивостью к кардиосаркоидозу [286]. Носители HLA-DRB1*08:01 могут быть более склонны к развитию рассеянного склероза у населения Западной Австралии [287]. Частота встречаемости HLA DRB1*08 значительно увеличена у женщин с первичным билиарным циррозом печени по сравнению со здоровыми женщинами в европейской популяции. HLA-DRB1*08:03 также связан с первичным билиарным циррозом печени [288]. Учитывая, что в разных популяциях выявлены ассоциации между разными аллелями и ЛТБ, что в разных этнических группах один и тот же HLA-аллель может как увеличивать риск развития заболевания, так и защищать от болезней, следует заключить, что выявленные нами ассоциации между определенными HLAаллелями и ЛТБ являются специфичными для казахов. Следует отметить, что ассоциацияи между гаплотипом DRB1*08-DQB1*06 и ЛТБ среди казахов совпадают с данным Kim и др. [289], который показал, что этот гаплотип достоверно чаще встречается среди корейцев, страдающих ЛТБ. Авторы предполагают, что DRB1*08:03 и DQB1*06:01 аллели связаны с прогрессированием туберкулёза у корейцев, оказывая влияние на развитие лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам, тяжесть болезни, и развитие рецидивов заболевания. 93 4.3 HLA-полиморфизм и восприимчивость к ревматоидному артриту. Целью нашего исследования было определение влияния HLA-аллелей класса II при ревматоидном артрите у пациентов в казахской популяции. Проведенное исследование было построено по принципу случай-контроль, в котором пациентов с РА сравнивали с контрольной группой. Все участники исследования были охарактеризованы с точки зрения их этнической принадлежности к казахской национальности. Случайный выбор пациентов показал преобладание женщин в группе лиц страдающих ревматоидным артритом. Высокая доля женщин, вероятно, связана с гормональными факторами, что наблюдается при некоторых аутоиммунных заболеваниях. Проведенное исследование показало наличие HLAаллелей и гаплотипов, ассоциированных с ревматоидным артритом. Казахская популяция, по результатам проведенного исследования, демонстрирует тесную связь с европейскими популяциями. На основании полученных результатов можно предположить значительное влияние на формирование генофонда казахов как аллелей предрасположенности к болезни, так и аллелей, имеющих защитный эффект против болезни. Нами было установлено, что аллели DRB1*04 и DRB1*15 имеют ассоциативную связь с заболеванием, наличие данных аллелей наблюдалось у 59 (45,0%) и 31 (23,7%) пациентов соответственно (Таблица 18). Среди аллелей локуса DQА1 значительной взаимосвязи с заболеванием у пациентов, несущих эту определенные аллели выявить не удалось. Мы проанализировали субаллели DRB1*04 в группах пациентов и здоровых людей, а также их влияние на развитие заболевания. Было показано, что частота аллеля DRB1*04:01 была повышена (P=1Е-05; OR=4.80; 95% CI – 2.64-9.86). Подобные ассоциации заболевания с DRB*04:01 были опубликованы в ряде исследований других популяций [244,290,291,292,293]. В 1978 году было отмечено, что 78% РА-пациентов, принадлежащих к европейским популяциям, были HLA-DRw4 положительны по сравнению с 28% здоровых людей [294]. Менее, чем через десять лет спустя, было обнаружено, что 94 есть несколько аллелей риска для РА в пределах консервативной аминокислотной последовательности гена HLA-DRB1. Позиции 70-74 в третьей гипервариабельной области DRβ1 цепи РA-ассоциированных HLA-DRB1 молекул все содержат сходные аминокислотные последовательности QKRAA, QRRAA или RRRAA. Эта последовательность аминокислот называется называется общим эпитопом (“shared epitope” (SE)), и аллели риска, кодирующие эту последовательность, широко известны как SE-аллели. Эти специфические аминокислотные последовательности кодировали не только HLA-DRB1*04-аллели, но также и РА-ассоциированные HLA-DRB1*01-аллели (Грегерсен и соавт. 1987) [257,258]. Отношение шансов (OR) для одного SE-аллеля равен 4.37, в то время как наличие в генотипе двух SEаллелей HLA-DRB1-гена равен 11,79 [295]. Частота аллеля DRB1*04:01 существенно различалась у пациентов и представителей контрольной группы, частота данного аллеля была выше в группе пациентов (Таблица 21). Среди остальных вариантов из группы аллелей DRB1*04 между пациентами и контролем существенных различий не выявлено, вероятно, в связи с тем, что частоты этих аллелей были довольно низкими. Если рассматривать частоты данных аллелей в сравнении с DRB1*04:01 можно предположить только тенденцию к нейтральности, но не к ассоциации с заболеванием. Стоит также отметить, что частота группы аллелей DRB1*15 является относительно высокой у здоровых участников исследования, но частота этой группы аллелей почти в два раза выше у пациентов с РА (P = 0.023). Однако после коррекции поправкой Бонферрони ассоциация РА с DRB1*15 подтверждена не была. В то же время высокая ассоциация РА с аллелем DRB*04:01 у казахов совпадает с высокой степенью ассоциации данного аллеля с развитием РА, полученная на других мировых популяциях. Протективный эффект определенных HLA-DRB1-аллелей относительно ревматоидного артрита был описан в ряде работ, проведенных на пациентах в различных популяциях. Так, группа аллелей HLA-DRB1*03 имела протективный эффект против РА у иранцев [255], DRB1*07 - у словаков [296] и финнов [297]; DRB1*08 - у мексиканцев [298]; DRB1*11- у перуанцев [299], DRB1*13 - у турков 95 [244]. В настоящем исследовании HLA-DRB1*13 был негативно ассоциирован с РА, и возможно, свидетельствует о его протективным эффекте в популяции казахов. DRB1*13, возможно, являясь протективным аллелем был выявлен у 47 участников из контрольной группы (29,9%), тогда как группа аллелей DQB1*02 была выявлена у 71 представителя из контрольной группы (45,2%). Защитное действие группы аллелей DQB1*02 ранее было описано для пакистанского населения [248]. Однако, в том же исследовании эффект DQB1*02 (P = 0.02) был менее выраженным, чем эффект от DRB1*13 (P = 0.001). В проведенном нами исследовании протективный эффект DRB1*13, возможно, можно связать с отсутствием аминокислотного мотива Q/R(K/R) RAA в положении 70-74, и наличием мотива DERRA [269]. Ранее описанные другие протективные аллели DRB1-гена, например, HLA-DRB1*01:03, DRB1*04:02, DRB1*12, DRB1*13:01, DRB1*13:02 и DRB1*13:04 имеют последовательность аминокислот (D/Q)ERAA в третьей гипервариабельной области, которая считается защитной [243,300]. На основании перечисленных данных была выдвинута гипотеза о защитном мотиве (DERAA) для HLA-DRB1- аллелей [301]. Наши результаты показали, что защитным эффектом среди вышеперечисленных аллелей в казахской популяции, возможно, обладает DRB1*13:01, что коррелирует с данными полученными в европейских популяциях [269]. Гаплотип DRB1*13DQA1*05-DQB1*03 также обладал значительным защитным эффектом: он был выявлен у 15 субъектов из группы контроля по сравнению с 1 - в группе пациентов. Для HLA-DQB1; группа DQB1*03, участвующая в формировании гаплотипа, это вариант, который встречается в обеих исследуемых группах. Если сравнить протективный эффект аллеля и гаплотипа, в который входит DRB1*13, данные, представленные в таблицах 18, 21 и 23, свидетельствуют о том, что между ними нет никакого существенного различия. Совместное действие DRB1*13-DQB1*03 аллелей не обладает протективностью, как ожидалось, в связи с незначимостью DQB1*03. Обнаружение данного аллеля совместно с DRB1*13 может быть связано с неравновесным сцеплением с DRB1*13, что было подтверждено с помощью теста LD (D´=0.072). Защитный эффект группы аллелей DQB1*02 в аллельном и 96 гаплотипном формате статистически не различался (таблицы 20 и 22), из чего можно сделать вывод о том, что наблюдамый защитный эффект данного аллеля достигается только благодаря неравновесному сцеплению с DRB1*07, который имееет относительно высокую частоту (24,2%) среди здоровых представителей контрольной группы. Среди аллелей DQA1-локуса достоверной ассоциативной связи с ревматоидным артритом обнаружено не было. В нашей работе мы также оценили риск развития РА у индивидумов с одновременном наличии в генотипе HLA-DRB1*04 и HLA-DRB1*13. Анализ показал эпистатическое взаимодействие между указанными HLA-вариантами, один из которых ассоциирован с чувствительность к развитию РА, а другой – с резистентностью. Аллель DRB1*04 является генетический фактором риска для РА. DRB1*13 в настоящем исследовании, обладает протективным фактором для РА. Наше наблюдение показало что сочетание обоих вариантов гена DRB1 - *04 и *13 (DRB1*04/*13) встречается очень редко в контрольной группе (1,9% случаев), и значительно чаще (6,1%) - у пациентов с РА. Действительно, сильного взаимодействия между DRB1*04 и HLA-DRB1*13 продемонстрировано не было. Однако, при наличии двух аллелей DRB1*04 наблюдается тенденция к более высокому риску развития РА, или наоборот наименьшая вероятность развития РА наблюдается при наличии в генотипе двух DRB1*13. Таким образом, результаты, полученные в настоящем исследовании, демонстрируют существенную связь ревматоидного артрита с аллелями HLADRB1*04. Возможный протективный эффект DRB1*13 по отношению к данному заболеванию, обнаруженный в настощем исследовании, согласуется с данными, полученными ранее в различных популяциях. Найденная отрицательная связь РА с аллелем DRB1*13:01 должна быть подтверждена в будущих независимых исследованиях. Поскольку распределение HLA-аллелей в других этнических группах отличается от такового у казахов, защитная и ассоциативная роль DRB1вариантов при РА в других популяциях также могут отличаться. Гаплотип DRB1*04-DQA1*03-DQB1*03 имеет достоверную ассоциативную связь с ревматоидным артритом. Полученные в настоящем исследовании результаты 97 указывают на их важность и необходимость продолжения подобных исследований в различных этнических группах и популяциях, в которых предполагается генетическое разнообразие ассоциативных связей этого заболевания. Полученные данные смогут обеспечить помощь в диагностике, следовательно, в прогнозе и лечении пациентов соответствующей этнической группы, страдающих от ревматоидного артрита. Изучение влияния не-HLA генетических факторов также будут способствовать этому. 98 4.4 Заключение Данные о частотах HLA-аллелей и гаплотипов на уровне высокого разрешения в репрезентативной выборке казахской популяции, полученные в ходе настоящего исследования, являются первыми для казахского этноса. Анализ частот аллелей и гаплотипов, позволил определить генетические расстояния между исследуемой группой населения и некоторыми мировыми популяциями. Казахская популяция занимает промежуточное положение между популяциями Востока и Запада Евразии. В генетическом фонде казахов представлены аллели, характерные для популяций Европы, Азии и Сибири, но наиболее близкими по распределению аллельных частот гена DRB1 казахи оказались к популяциям Азии и Сибири, что соответствует географическому ареалу казахского этноса и истории его формирования. В глобальном масштабе, структура полиморфизма HLA-генов, наблюдаемая у казахов в данном исследовании, указывает на связь классических HLA-генов, играющих важную роль в реализации адаптивного иммунного ответа, с географическими расстояниями между популяциями и отражает историю возникновения этносов. Настоящая работа – это первое исследование из опубликованных на сегодняшний день, в которой было проведено изучение HLA-полиморфизма и анализ ассоциаций HLA-генов класса II с туберкулёзом и ревматоидным артритом в казахской популяции. Результатом работы стало установление аллелей и гаплотипов, имеющих связь с предрасположенностью к туберкулёзу и ревматоидному артриту у казахского населения. Полученные результаты могут быть использованы в практической медицине - оказать помощь в диагностике, и, следовательно, в прогнозе и лечении пациентов казахской этнической группы, страдающих от туберкулёза и ревматоидного артрита. 99 ВЫВОДЫ 1. Идентифицированы и внесены в международный реестр 7 новых аллелей гена HLA-DRB1, которым Номенклатурный Комитет Всемирной организации здравоохранения присвоил следующие обозначения: DRB1*03:56, DRB1*03:57, DRB1*13:102, DRB1*13:02:04, DRB1*13:103, DRB1*11:04:06 и DRB1*14:12:02 2. Установлены 7 новых наиболее частых HLA-DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов, которые не зарегистрированы в международной базе данных: DRB1*13:01DQA1*03:01-DQB1*03:01, DRB1*07:01-DQA1*03:01-DQB1*02:02, DRB1*07:01-DQA1*03:02-DQB1*02:02, DQB1*03:02, DRB1*03:01-DQA1*03:01- DRB1*09:01-DQA1*03:03-DQB1*02:02, DRB1*04:01- DQA1*03:02-DQB1*03:01, DRB1*13:01-DQA1*01:03-DQB1*05:01 и, таким образом, могут являться специфичными для казахской популяции 3. На основании анализа аллельного полиморфизма гена HLA-DRB1 установлены генетические расстояния между казахской популяцией и 74 другими мировыми популяциями. Наиболее близкими к казахским популяциям являются популяции Азии и Сибири, установлен также вклад генов европейского происхождения в генофонд казахского этноса. 4. Установлены ассоциации аллелей HLA-DRB1*08:01, -DRB1*08:03 и DQA1*03:02 и гаплотипа DRB1*08:03-DQА1*01:03-DQВ1*06:01 с восприимчивостью к легочному туберкулёзу у представителей казахской популяции; 5. Установлены ассоциации аллеля HLA-DRB1*04:01 и гаплотипа DRB1*04DQA1*03-DQB1*03 с предрасположенностью к ревматоидному артриту, а аллеля HLA-DRB1*13:01 – с устойчивостью к данному заболеванию у представителей казахской популяции. 100 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ACPAs – Anti–citrullinated protein antibodies ACR – Американский колледж ревматологии CI – доверительный интервал HLA - Human Leukocyte Antygen GWAS - геномное ассоциативное исследование KIR – иммуноглобулинподобные рецепторы киллерных клеток MHC - Major Histocompatibility Complex – главный комплекс гистосовместимости NK – естественные киллеры OR (odds ratio) – отношение шансов, PCR-SSOP – полимеразная цепная реакция с использованием сиквенсспецифичных олигонуклеотидных проб SNP - однонуклеотидный полиморфизм SBT – типирование методом секвенирования ТCR – Т-клеточный рецептор Гаплотип — генетическая комбинация генов на одной хромосоме ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота мтДНК – митохондриальная ДНК ПЦР - полимеразная цепна реакция п.н. – пара оснований РНК – рибонуклеиновая кислота 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Система генов HLA и регуляция иммунного ответа. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2000. – № 8 – С.7–16. 2. Ярилин А.А. Иммунология. Учебник. М.: ГЭОТАР- Медиа, 2010, 752 3. Пальцев М.А., Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Иммуногенетика человека с. и биобезопасность. – М., «Медицина». – 2007. – 143 С. 4. Holoshitz J. The Quest for Better Understanding of HLA-Disease Association: Scenes from a Road Less Travelled By // Discovery medicine. 2013. – Vol. 16 (87). – P. 93-101. 5. Trowsdale J, Knight JC. Major histocompatibility complex genomics and human disease // Annual Review of Genomics and Human Genetics. 2013. – Vol. 14. – P. 301–323. 6. Trowsdale J. Molecular genetics of the MHC // Immunol Suppl. 1988. – Vol. – P. 21-23. 7. Klein J. and Sato A. The HLA System // N Engl J Med. 2000. – Vol. 343. – P. 782–786. 8. de Bakker PI, McVean G, Sabeti PC. et al. A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC // Nature genetics. 2006. – Vol. 38: – P. 1166-1172. 9. Singh N., Agrawal S., Rastogi A.K. Infectious diseases and immunity: special reference to major histocompatibility complex // Emerg Infect Dis. 1997. – Vol. 3 (1). – P. 41-49. 10. Hill A.V. The immunogenetics of human infectious diseases // Ann Rev Immunol. 1998. – Vol. 16. – P. 593-617. 11. Болдырева "Функциональный" М.Н. генотип, HLA (класс гипотеза II) и естественный преимущества отбор. "функциональной" 102 гетерозиготности: дис. ...д-ра. мед. наук: 14.00.36/ Болдырева, Маргарита Николаевна. – М.: 2007, 225 с. 12. Lenz TL, Deutsch AJ, Han B. et al. Widespread non-additive and interaction effects within HLA loci modulate the risk of autoimmune diseases // Nat Genet. 2015 – Vol. 47 (9). – P. 1085-1090. 13. Single RM, Martin MP, Gao X. et al. Global diversity and evidence for coevolution of KIR and HLA // Nature Genetics. 2007. – Vol. 39 (9). – P. 1114–1119. 14. Hirayasu K, Arase H. Functional and genetic diversity of leukocyte immunoglobulin-like receptor and implication for disease associations // J Hum Genet. – 2015. – doi: 10.1038/jhg.2015.64. 15. Sanchez-Mazas A, Meyer D. The Relevance of HLA Sequencing in Population Genetics Studies // Journal of Immunology Research. 2014. – 2014:971818. – doi:10.1155/2014/971818. 16. Degos L, Dausset J. Human migrations and linkage disequilibrium of HLA system // Immunogenetics. 1974. – Vol. 1(1). – P. 195–210. 17. Menozzi P, Piazza A, Cavalli-Sforza L. Synthetic maps of human gene frequencies in Europeans // Science. 1978. – Vol. 201 (4358). – P. 786–792. 18. Tshabalala M, Mellet J, Pepper MS. Human Leukocyte Antigen Diversity: A Southern African Perspective // Journal of Immunology Research. 2015; 2015 doi:10.1155/2015/746151. 19. Cavalli-Sforza L, Menozzi P, Piazza A. The History and Geography of Human Genes / Princeton, NJ, USA. Princeton University Press. 1994. 20. Klein J. Natural History of the Major Histocompatibility Complex. / New York: Wiley & Sons. 1986. 21. Consortium. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium // Nature. 1999. – Vol. 401. – P. 921-923. 22. Horton R, Gibson R, Coggill P. et al. Variation analysis and gene annotation of eight MHC haplotypes: the MHC Haplotype Project // Immunogenetics. 2008. – Vol. 60. – P. 1-18. 103 23. Carrington M, O'Brien SJ: The influence of HLA genotype on AIDS // Annu Rev Med. 2003. – Vol. 54. – P. 535-551. 24. Horton R, Wilming L, Rand V. et al. (2004) Gene map of the extended human MHC // Nat Rev Genet. 2004. – Vol. 5. – P. 889–899. 25. Knight JC, Keating BJ, Kwiatkowski DP. Allele-specific repression of lymphotoxin-alpha by activated B cell factor-1 // Nat Genet. 2004. – Vol. 36. – P. 394– 399. 26. Nguyen T, Liu XK, Zhang Y, Dong C. BTNL2, a butyrophilin-like molecule that functions to inhibit T cell activation // J Immunol. 2006. – Vol. 176. – P. 7354–7360. 27. Хаитов Р. М. Иммунология : структура и функции иммунной системы : учебное пособие / Р. М. Хаитов – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 280 c. 28. Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B. et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2 // Nature. 1987. Vol. 329 (6139). P. 506-512. 29. Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B. et al. The foreign antigen binding site and T cell recognition regions of class I histocompatibility antigens // Nature. 1987. – Vol. 329 (6139). – P. 512–518 30. Thorsby E. Structure and function of HLA molecules // Transplant Proc. 1987. – Vol. 19. – P. 29–35 31. Dyer P., McGilvray R., Robertson V., Turner D. Status report from 'double agent HLA': health and disease // Mol Immunol. 2013. – Vol. 55 (1). – P. 2-7. 32. Li X.C. Raghavan M. Structure and function of major histocompatibility complex class I antigens // Current Opinion in Organ Transplantation. 2010. – Vol. 15. – P. 499–504. 33. D.E. Geraghty, B.H. Koller, J.A. Hansen, et. al. The HLA class I gene family includes at least six genes and twelve pseudogenes and gene fragments // J. Immunol. 1992. – Vol.149. – 1934–1946 34. J.F. Kaufman, C. Auffray, A.J. Korman, et al. The class II molecules of the human and murine major histocompatibility complex //Cell 1984. – Vol. 36 (1). – P. 1– 13 104 35. de Verteuil D, Granados DP, Thibault P, Perreault C. Origin and plasticity of MHC I-associated self peptides // Autoimmun Rev. 2012. – Vol. 11. – P. 627–635. 36. Thorsby E. Review The human major histocompatibility system // Transplant Rev. 1974. – Vol. 18. – P. 51-129. 37. Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, et al. An update to HLA nomenclature // Bone Marrow Transplant. 2010. – Vol. 45 (5). – P. 846–848. 38. Marsh S.G., Albert E.D., Bodmer W.F.et al. Nomenclature for factors of the HLA system. 2002 // Tissue Antigens.2002. – Vol. 60 (5). – P. 407-464. 39. Robinson J., Waller M.J., Parham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex // Nucleic Acids Res. 2003. – Vol. 31 (1). – P. 311-314. 40. D. Charron. // Curr Opin. Immunol. 2005. – Vol. 17. – P. 493–497. 41. Bontadini A. HLA techniques: typing and antibody detection in the laboratory of immunogenetics // Methods. 2012. – Vol. 56 (4). – P. 471-476. 42. Балановская Е. В., Балановский О. П. Русский генофонд на Русской равнине. – Москва: Луч, 2007. 416 с. – С. 329-332. 43. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. Москва. Изд-во ИКЦ «Академкнига» 2003. 431 с. С 17-18 44. Slatkin, M. Linkage disequilibrium? understanding the evolutionary past and mapping the medical future // Nature Reviews Genetics. 2008. Vol. 9 (6). P. 477– 485. 45. Zapata C. The D’ measure of overall gametic disequilibrium between pairs of multi-allelic loci // Evolution. 2000. – Vol. 54. – P.1809–1812. 46. Tremmel M. Typisierung von HLA-Klasse-II-Merkmalen mittels des TaqMan-Verfahrens. Kaiserslautern, Univ., Diss., 2001 (на немецком языке) 47. Brown MA, Kenna T, Wordsworth BP. Genetics of ankylosing spondylitis- insights into pathogenesis // Nat Rev Rheumatol. 2015. doi: 10.1038/nrrheum.2015.133. 48. Stavropoulos, P.G., Soura, E., Kanelleas, A., et al. Reactive Arthritis // Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 2015 – Vol. 29. – P. 415–424. 105 49. Balint GP, Balint PV. Felty's syndrome // Best Pract Res Clin Rheumatol. 2004. – Vol. 18(5). – P. 631-45. 50. Ohno S, Ohguchi M, Hirose S. et al. Close association of HLA-Bw51 with Behcet’s disease // Archives of Ophthalmology. 1982. – Vol. 100. – P. 1455–1458. 51. Arnett FC, Gourh P, Shete S. et al. Major histocompatibility complex (MHC) class II alleles, haplotypes and epitopes which confer susceptibility or protection in systemic sclerosis: analyses in 1300 Caucasian, African-American and Hispanic cases and 1000 controls //Ann Rheum Dis. 2010. – Vol. 69 (5). – P. 822–827 52. Tsuchiya N, Kawasaki A, Tsao BP, Komata T. et al. Analysis of the association of HLA-DRB1, TNF alpha promoter and TNFR2 (TNFRSF1B) polymorphisms with SLE using transmission disequilibrium test // Genes Immun. 2001. – Vol. 2. – P. 317–322. 53. Nikolic, A. V., Andric, Z. P., Simonovic. et al. High frequency of DQB1*05 and absolute absence of DRB1*13 in muscle-specific tyrosine kinase positive myasthenia gravis // European Journal of Neurology. 2015. – Vol. 22. – P. 59–63. 54. Kaushansky N, Ben-Nun A. DQB1*06:02-Associated Pathogenic Anti- Myelin Autoimmunity in Multiple Sclerosis-Like Disease: Potential Function of DQB1*06:02 as a Disease-Predisposing Allele // Front Oncol. 2014. – Vol. 4(280). – doi: 10.3389/fonc.2014.00280. 55. human Hasan ZN, Zalzala HH, Mohammedsalih HR, et al. Association between leukocyte antigen-DR and demylinating Guillain-Barre syndrome. //Neurosciences (Riyadh). 2014. – Vol. 19(4). – P. 301-5. 56. Tendon, N., Zhang, L. and Weetman, A. P. HLA Associations with Hashimoto's thyroiditis // Clinical Endocrinology. 1991. – Vol. 34. – P. 383–386. 57. Erichsen MM, Løvås K, Skinningsrud B, et al. Clinical, immunological, and genetic features of autoimmune primary adrenal insufficiency: observations from a Norwegian registry. // J Clin Endocrinol Metab. 2009. – Vol. 94(12). – P. 4882-90. 58. Ueda S, Oryoji D, Yamamoto K, et al. Identification of independent susceptible and protective HLA alleles in Japanese autoimmune thyroid disease and their epistasis // J Clin Endocrinol Metab. 2014 – Vol. 99(2). – P.379-83. 106 59. Dib SA, Gomes MB. Etiopathogenesis of type 1 diabetes mellitus: prognostic factors for the evolution of residual beta cell function // Diabetol Metab Syndr. 2009. – Vol. 4;1 (1). – P. 25. 60. Jin, Y., Hayashi, M., Fain, P. R., et al. Major association of vitiligo with HLA-A*02:01 in Japanese // Pigment Cell & Melanoma Research. 2015. – Vol. 28. – P. 360–362. 61. Eming R, Hennerici T, Bäcklund J et al. Pathogenic IgG antibodies against desmoglein 3 in pemphigus vulgaris are regulated by HLA-DRB1*04:02-restricted T cells. // J Immunol. 2014. – Vol. 193(9). – P. 4391-9. 62. Chmurova N, Parnicka Z, Svecova D, et al. Dermatitis herpetiformis in siblings // Bratisl Lek Listy. 2007. – Vol. 108(12). – P. 519-21. 63. Oh JH, Han JW, Lee SJ, et al. Polymorphisms of Human Leukocyte Antigen Genes in Korean Children with Kawasaki Disease // Pediatric Cardiology. 2008. – Vol. 29(2). – P. 402-408. 64. Vaglio A, Martorana D, Maggiore U, et al. HLA-DRB4 as a genetic risk factor for Churg-Strauss syndrome // Arthritis Rheum. 2007. – Vol. 56(9). – P. 3159-66. 65. López-Mejías R, Genre F, Pérez BS et al. HLA-DRB1 association with Henoch-Schonlein purpura // Arthritis & Rheumatology. 2015. – Vol. 67. – P. 823–827. 66. Doganay L, Katrinli S, Colak Y, et al. HLA DQB1 alleles are related with nonalcoholic fatty liver disease. // Mol Biol Rep. 2014. – Vol. 41(12). – P. 7937-43. 67. Megiorni F, Pizzuti A. HLA-DQA1 and HLA-DQB1 in Celiac disease predisposition: practical implications of the HLA molecular typing // Journal of Biomedical Science. 2012. – Vol. 19 (1). – P. 88. 68. Mahdi BM. Role of HLA typing on Crohn’s disease pathogenesis // Annals of Medicine and Surgery. 2015. – Vol. 4(3). – P. 248-253. 69. Raghavan S, Selvaraj P, Swaminathan S, Narendran G. Short communication: association of HLA-A*1101 with resistance and B*4006 with susceptibility to HIV and HIV-TB: an in silico analysis of promiscuous T cell epitopes // AIDS Res Hum Retroviruses. 2009. – Vol. 10. – P. 1023-8. 107 70. Chen D, Gaborieau V, Zhao Y et al. A systematic investigation of the contribution of genetic variation within the MHC region to HPV seropositivity // Hum Mol Genet. 2015. – Vol. 24(9). – P. 2681-8. 71. Kovalchuka L, Eglite J, Lucenko I, et al. Associations of HLA DR and DQ molecules with Lyme borreliosis in Latvian patients // BMC Research Notes. 2012. – Vol. 5. – P. 438. 72. Aureli, A., Canossi, A., Del Beato, T, et al. HLA-DRB1*13:01 allele in the genetic susceptibility to colorectal carcinoma // Int. J. Cancer. 2015. – Vol. 136. –P. 2464–2468. 73. Machulla HK, Steinborn F, Schaaf A, et al. Brain glioma and human leukocyte antigens (HLA)--is there an association // J Neurooncol. 2001. –Vol. 52(3). – P. 253-61. 74. Sayad A, Akbari MT, Mehdizadeh M, et al. HLA-A*26 and susceptility of iranian patients with non-Hodgkin lymphoma // Iran J Immunol. 2014. – Vol. 11(4). – P. 269-74. 75. Hellmark T, Segelmark M. Diagnosis and classification of Goodpasture's disease (anti-GBM) // J Autoimmun. 2014. – Vol. 48-49. – P. 108-12. 76. Zhao J-J, Wang X-B, Luan Y, Liu J-L, Liu L, Jia H-Y. Association of human leukocyte antigen gene polymorphism and mesangial proliferative glomerulonephritis in a large population-based study // Biomedical Reports. 2013. – Vol. 1(5). – P. 751-756. 77. Marcos E.V.C., Souza F.C., Ura S., Opromolla D.V.A. Estudo de associação entre antígenos HLA e reação hansênica tipo 1 ulcerada //An Bras Dermatol. 2000. – Vol. 75 (3). – P. 283-290. 78. Kawashima Y, Pfafferott K, Frater J, et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I // Nature. 2009. – Vol. 458 (7238). – P.641-645. 79. Mack D.G., Johnson J.J., Roberts F. et al. HLA-class II genes modify outcome of Toxoplasma gondii infection // Int J Parasitol. 1999. – Vol. 29. – P. 1351– 1358. 108 80. Carrington M., Nelson G.W., Martin M.P., et al. HLA and HIV-1: Heterozygote advantage and B*35-Cw*04 disadvantage // Science. 1999. – Vol. 283. – P. 1748-1752. 81. Mc Michael A., Klenerman P. HIV/AIDS. HLA leaves its footprints on HIV // Science. 2002. – Vol. 296 (5572). – P. 1410-1411. 82. Erdmann N, Du VY, Carlson J et al. HLA Class-II Associated HIV Polymorphisms Predict Escape from CD4+ T Cell Responses // PLoS Pathog. 2015. – Vol. 11(8) – P. e1005111. 83. Paranjape R.S. Immunopathogenesis of HIV infection // Indian J Med Res. 2005. – Vol. 121 (4). – P. 240-255. 84. Gao X., Nelson G.W., Karacki P. et al. Effect of a single amino acid change in MHC class I molecules on the rate of progression to AIDS // N Engl J Med. 2001. – Vol. 344 (22). – P. 1668–1675. 85. Turner D. The human leucocyte antigen (HLA) system. / Turner D. Vox Sanguinis. 2004. (Suppl 1). –P. 87-90. 86. Farquhar C., Rowland-Jones S., Mbori-Ngacha D. et al. Human leukocyte antigen (HLA) B*18 and protection against mother-to-child HIV type 1 transmission. AIDS. // Res Hum Retroviruses. 2004. – Vol. 20 (7). – P. 692-697. 87. Winchester R., Chen Y., Rose S., et al. Major histocompatibility complex class II DR alleles DRB1*1501 and those encoding HLA-DR13 are preferentially associated with a diminution in maternally transmitted human immunodeficiency virus 1 infection in different ethnic groups: determination by an automated sequence-based typing method // Proc Natl Acad Sci. 1995. – Vol. 92. – P. 12374-12378. 88. Louie L.G., Hartogensis W.E., Jackman R.P. et al. Mycobacterium tuberculosis/HIV-1 coinfection and disease: role of human leukocyte antigen variation // J Infect Dis. 2004. – Vol. 189 (6). – P. 1084-1090. 89. Price P., Keane N.M., Stone S.F. et al. MHC haplotypes affect the expression of opportunistic infections in HIV patients // Hum Immunol. 2001. – Vol. 62 (2). – P.157-164. 109 90. Diouf K., Sarr A.D., Eisen G., et al. Associations between MHC class I and susceptibility to HIV-2 disease progression // J Hum Virol. 2002. Vol. 5 (1). P. 1-7. 91. Thio C.L., Thomas D.L., Karacki P. et al. Comprehensive analysis of class I and class II HLA antigens and chronic hepatitis B virus infection // J Virol. 2003. – Vol. 77 (22). – P. 12083-12087. 92. Jiang Y.G., Wang Y.M., Liu T.H., Liu J. Association between HLA class II gene and susceptibility or resistance to chronic hepatitis B // World J Gastroenterol. 2003. – Vol. 9 (10). – P. 2221-2225. 93. Thursz M.R., Kwiatkowski D., Allsopp C.E. et al. Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis B virus in Gambia // N Engl J Med. 1995. – Vol. 332 (16). – P. 1065-1069. 94. Karan M.A., Tascioglu N.E., Ozturk A.O. et al. The role of HLA antigens in chronic hepatitis B virus infection // J Pak Med Assoc. 2002. – Vol. 52 (6). – P. 253256. 95. Ahn S.H., Han K.H., Park J.Y. et al. Association between hepatitis B virus infection and HLA-DR type in Korea // Hepatology. 2000. – Vol. 31 (6). – P. 1371-1373. 96. Hananantachai H., Patarapotikul J., Ohashi J. et al. Polymorphisms of the HLA-B and HLA-DRB1 Genes in Thai Malaria Patients // Jpn J Infect Dis. 2005. – Vol. 58 (1). – P. 25-28. 97. Meddeb-Garnaoui A., Gritli S., Garbouj S., et al. Association analysis of HLA-class II and class I gene polymorphisms in the susceptibility to Mediterranean visceral leishmaniasis // Hum Immunol 2001. – Vol. 62(5). – P. 509-17. 98. Хаитов Р.М., Решетников А.В., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Гудима Г.О. Клинические испытания первой отечественной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины. 2009, Москва, «ГЭОТАР-Медиа», 680с. 99. Zhao L, Zhang M, Cong H. Advances in the study of HLA-restricted epitope vaccines // Hum Vaccin Immunother. 2013. Vol. 9 (12). P. 2566-2577. 100. Olivo-Díaz A., Debaz H., Alaez C. et al. Role of HLA class II alleles in susceptibility to and protection from localized cutaneous leishmaniasis // Hum Immunol. 2004. – Vol. 65. – P. 255-261. 110 101. Shankarkumar U., Devaraj J.P., Ghosh K. et al. HLA associations in P. falciparum malaria patients from Mumbai, western India // Indian J Malariol. 2002. – Vol. 39 (3-4). – P. 76-82. 102. Johnson A., Leker R., Harun L. et al. Interaction of HLA and age on levels of antibody to Plasmodium falciparum rhoptryassociated proteins 1 and 2 // Infect Immun. 2000. – Vol. 68 (4). – P. 2231-2236. 103. Rajalingam R., Mehra N.K., Jain R.C. et al. Polymerase chain reactionbased sequence-specific oligonucleotide hybridization analysis of HLA class II antigens in pulmonary tuberculosis: relevance to chemotherapy and disease severity // J Infect Dis. 1996. – Vol. 173 (3) – P. 669-676. 104. Amirzargar A.A., Yalda A., Hajabolbaghi M., et al. The association of HLADRB1, DQA1, DQB1 alleles and haplotype frequency in Iranian patients with pulmonary tuberculosis // Int J Tuberc Lung Dis. 2004. – Vol. 8 (8). – P. 1017-1021. 105. Selvaraj P., Reetha A.M., Uma H. et al. Influence of HLA-DR and -DO phenotypes on tuberculin reactive status in pulmonary tuberculosis patients // Tuber Lung Dis. 1996. – Vol. 77 (4). – P. 369-373. 106. Ravikumar M., Dheenadhayalan V., Rajaram K. et al. Associations of HLADRB1, DQB1 and DPB1 alleles with pulmonary tuberculosis in south India //Tuber Lung Dis. 1999. – Vol. 79 (5). – P. 309-317. 107. Mehra N.K., Rajalingam R., Mitra D.K. et al. Variants of HLA-DR2/DR51 group haplotypes and susceptibility to tuberculoid leprosy and pulmonary tuberculosis in Asian Indians // Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1995. – Vol. 63 (2). – P. 241-248. 108. Dubaniewicz A. HLA-DR antigens in patients with pulmonary tuberculosis in northern Poland: Preliminary report // Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000. – Vol. 48 (1). – P. 47-50. 109. Brahmajothi V., Pitchappan R.M., Kakkanaiah V.N. et al. Association of pulmonary tuberculosis and HLA in South India // Tubercle. 1991. – Vol. 72 (2). – P. 123-132. 111 110. Sanjeevi C.B., Narayanan P.R., Prabakar R. et al. No association or linkage with HLA-DR or -DQ genes in south Indians with pulmonary tuberculosis // Tuber Lung Dis. 1992. – Vol. 73 (5). – P. 280-284. 111. Сароянц Л.В., Болдырева М.Н., Гуськова И.А. и др. Иммуногенетический профиль больных туберкулёзом и лепрой в казахской популяции // Иммунология. 2006. – № 5. – С. 285–288. 112. Schurr E. Is susceptibility to tuberculosis acquired or inherited? // J Intern Med. 2007. – Vol. 261. – P. 106-111. 113. Итоги переписи населения Республики Казахстан 2009 года, www.stat.kz 114. Wakefield D., Montanaro A., McCluskey P. Acute anterior uveitis and HLA-B27 // Surv Ophtalmol. 1991. – Vol. 36. – P. 223-232. 115. Kerkhoff F.T., Rothova A. Bartonella henselae associated uveitis and HLAB27 // J Ophthalmol. 2000. – Vol. 84 (10). – P.1125-1129. 116. Heiligenhaus A., Rebmann V., Neubert A., et al.. Soluble HLA class I and HLA-DR plasma levels in patients with anterior uveitis // Tissue Antigens 2004. – Vol. 63 (4). – P. 369-375. 117. Алексеев Л.П., Дедов И.И., Болдырева М.Н. и др. HLA-гены – маркеры инсулин-зависимого сахарного диабета, этнические аспекты // Иммунология. 2003. – №5 (24). – C.308-311. 118. Шарипова М.Н. Клинико-эпидемиологические и генетические особенности целиакии у детей Казахстана. Педиатрия. Журнал имени Г. Н. Сперанского. 2009. – Т. 87, № 1. – С. 106–108. 119. Eming R, Hennerici T, Bäcklund J et al. Pathogenic IgG antibodies against desmoglein 3 in pemphigus vulgaris are regulated by HLA-DRB1*04:02-restricted T cells // J Immunol. 2014. – Vol. 193 (9). – P. 4391-4399. 120. Cruz-Tapias P, Rojas-Villarraga A, Maier-Moore S and Anaya JM. HLA and Sjögren's syndrome susceptibility. A meta-analysis of worldwide studies // Autoimmun Rev. 2012. – Vol. 11 (4). – P. 281-287. 112 121. Parish J.M. Genetic and immunologic aspects of sleep and sleep disorders. // Chest. 2013. – Vol.143 (5). – P. 1489-1499. 122. Tagawa Y., Sugiura S., Yakura H. et al. Letter: HLA and Vogt-KoyanaghHarada syndrome // N Engl J Med. 1976. – Vol. 295. – P. 173. 123. Shi T, Lv W, Zhang L. et al. Association of HLA-DR4/HLA-DRB1*04 with Vogt-Koyanagi-Harada disease: A Systematic Review and Meta-analysis // Scientific Reports. 2014. – Vol. 4. – P. 6887. 124. Porto G, Sousa MD (2000) Variation of hemochromatosis prevalence and genotype in national groups. In: Barton J E, CQ, editor, editor. Hemochromatosis Genetics, Pathophysiology, Diagnosis, and Treatment: Cambridge University Press. pp. 51–62. 125. Costa M, Cruz E, Barton JC, et al. Effects of Highly Conserved Major Histocompatibility Complex (MHC) Extended Haplotypes on Iron and Low CD8+ T Lymphocyte Phenotypes in HFE C282Y Homozygous Hemochromatosis Patients from Three Geographically Distant Areas // PLoS ONE. 2013. – Vol. 8 (11). – e79990. 126. Braun J, Bollow M, Remlinger G. et al. Prevalence of spondylarthropathies in HLAB27 positive and negative blood donors // Arthritis Rheum. 1998. – Vol. 41. – P. 58–67. 127. Brown MA, Kennedy LG, MacGregor AJ, et al. Susceptibility to ankylosing spondylitis in twins: the role of genes, HLA, and the environment // Arthritis Rheum. 1997. – Vol. 40. – P. 1823–1828. 128. Brewerton D.A., Hart F.D. Nicholls A. et al. Ankylosing spondylitis and HLA 27 // Lancet. 1973. – Vol. 1. – P. 904. 129. Castro-Santos P, Gutiérrez MA, Díaz-Peña R. Genetics of ankylosing spondylitis // Rev Med Chil. 2014. – Vol. 142 (9). – P. 1165-1173. 130. Yang T, Duan Z, Wu S, et al. Association of HLA-B27 genetic polymorphisms with ankylosing spondylitis susceptibility worldwide: a meta-analysis // Mod Rheumatol. 2014. – Vol. 24 (1). – P. 150-161. 113 131. Taniguchi Y., Yorioka N., Kyuden Y., Asakimori Y. Reiter’s syndrome associated with HLA-B51: a case report // J Int Med Res. 2003. – Vol. 31 (1). – P. 5557. 132. Verity DH, Marr JE, Ohno S. et al. Behcet’s disease, the Silk Road and HLA-B51: historical and geographical perspectives // Tissue Antigens. 1999. – Vol. 54. – P. 213–220. 133. Mizuki N, Ohno S, Ando H et al. A strong association between HLAB*5101 and Behcet’s disease in Greek patients // Tissue Antigens. 1997. – Vol. 50. – P. 57–60. 134. Meguro A, Inoko H, Ota M et al. Genetics of Behcet disease inside and outside the MHC // Ann Rheum Dis. 2010. – Vol. 69. – P. 747–754. 135. Gupta R, Debbaneh MG, Liao W. Genetic Epidemiology of Psoriasis // Current dermatology reports. 2014, – Vol. 3(1). – P. 61-78. 136. Black CM, Welsh KI, Fielder A. et al. HLA antigens and Bf allotypes in SLE: evidence for the association being with specific haplotypes // Tissue Antigens. 1982. – Vol. 19. – P. 115–120. 137. Suggs MJ, Majithia V, Lewis RE and Cruse JM. HLA DRB1*1503 allelic haplotype predominance and associated immunodysregulation in systemic lupus erythematosus // Exp Mol Pathol. 2011. – Vol. 91. – P. 548–562. 138. Reveille JD, Moulds JM, Ahn C. et al. Systemic lupus erythematosus in three ethnic groups: I. The effects of HLA class II, C4, and CR1 alleles, socioeconomic factors, and ethnicity at disease onset. LUMINA Study Group. Lupus in minority populations, nature versus nurture //Arthritis Rheum. 1998. – Vol. 41. – P. 1161–1172. 139. Furukawa H, Kawasaki A, Oka S, Ito I. et al. Human Leukocyte Antigens and Systemic Lupus Erythematosus: A Protective Role for the HLA-DR6 Alleles DRB1*13:02 and *14:03 // PLoS ONE. 2014. – Vol. 9(2). – e87792. 140. S. Kary, J. Fritz, H.U. Scherer, and G.R. Burmester. Do we still miss the chance of effectively treating early rheumatoid arthritis? New answers from a new study // Rheumatology. 2004. – Vol. 43(7). – P. 819–820. 114 141. F.C. Arnett, S.M. Edworthy, D.A. Bloch, et al. The american rheumatism association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. 1988. – Vol. 31(3). – P. 315–324. 142. Sugiyama D, Nishimura K, Tamaki K et al. Impact of smoking as a risk factor for developing rheumatoid arthritis: a meta-analysis of observational studies // Ann Rheum Dis. 2010. – Vol. 69. – P. 70–81. 143. Wegner N, Wait R, Sroka A. et al. Peptidylarginine deiminase from Porphyromonas gingivalis citrullinates human fibrinogen and alpha-enolase: implications for autoimmunity in rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. 2010. – Vol. 62. – P. 2662–2672. 144. MacGregor AJ., Snieder H., Rigby AS. et al. Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins // Arthritis Rheum. 2000. – Vol. 43 (1). – P. 30–37. 145. Silman AJ, MacGregor AJ, Thomson W et al. Twin concordance rates for rheumatoid arthritis: results from a nationwide study // Br J Rheumatol. 1993. – Vol. 32. – P. 903–907. 146. Abecasis G. R., Auton A., Brooks L. D., et al. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes // Nature. 2012. – Vol. 491(7422). – P. 56–65. 147. The International HapMap Consortium. The international HapMap project // Nature. 2003. – Vol. 426 (6968). – P. 789–796. 148. Sanchez-Mazas A, Fernandez-Viña M, Middleton D. et al. Immunogenetics as a tool in anthropological studies // Immunology. 2011. – Vol. 133 (2). – P. 143-164. 149. Mack SJ, Erlich HA. Population relationships as inferred from classical HLA genes. In: Hansen JA, ed. Immunobiology of the MHC: Proceedings of the 13th International Histocompatibility Workshop and Conference. Seattle: IHWG Press, 2007, 747–757. 150. Nunes, J. M., Buhler, S., Roessli, D. et al. The HLA-net GENE [RATE] pipeline for effective HLA data analysis and its application to 145 population samples from Europe and neighbouring areas // Tissue Antigens. 2014. – Vol. 83. – P. 307–323. 115 151. Gonzalez-Galarza F.F., Christmas S., Middleton D. and Jones A. R. Allele frequency net: a database and online repository for immune gene frequencies in worldwide populations // Nucleic Acids Research. 2011. – Vol. 39 (1). – P. 913–919. 152. Prugnolle F., Manica A., Charpentier M. et al. Pathogen-driven selection and worldwide HLA class I diversity // Current Biology. 2005. – Vol. 15 (11). – P. 1022– 1027. 153. Handley L.J.L., Manica A., Goudet J., Balloux F. Going the distance: human population genetics in a clinal world // Trends in Genetics. 2007. – Vol. 23(9). – P. 432– 439. 154. Gonzàlez-Galarza F.F., Takeshita L.Y.C., Santos E.J.M. et al. Allele frequency net 2015 update: new features for HLA epitopes, KIR and disease and HLA adverse drug reaction associations // Nucleic Acids Research. 2015. – Vol. 43 (1). – P. 784–788. 155. Buhler S., Sanchez-Mazas A. HLA DNA sequence variation among human populations: molecular signatures of demographic and selective events // PLoS ONE. 2011. – Vol. 6 (2). – e14643 156. Fernandez-Vina MA, Falco M, Gao X. et al. DQA1*03 subtypes have different associations with DRB1 and DQB1 alleles // Hum Immunol. 1994. – Vol. 39. – P. 290–298. 157. Fernandez-Vina MA, Gao XJ, Moraes ME. et al. Alleles at four HLA class II loci determined by oligonucleotide hybridization and their associations in five ethnic groups // Immunogenetics. 1991. – Vol. 34. – P. 299–312. 158. Solberg OD, Mack SJ, Lancaster AK et al. Balancing selection and heterogeneity across the classical human leukocyte antigen loci: a meta-analytic review of 497 population studies // Hum Immunol. 2008. – Vol. 69. – P. 443–464. 159. Hurley CK, Maiers M, Marsh SG, Oudshoorn M. Overview of registries, HLA typing and diversity, and search algorithms // Tissue Antigens. 2007. – Vol. 69 (1). – P. 3–5. 116 160. Mack SJ, Tu B, Lazaro A et al. HLA-A, -B, -C, and -DRB1 allele and haplotype frequencies distinguish Eastern European Americans from the general European American population // Tissue Antigens. 2009. – Vol. 73. – P. 17–32. 161. Cronstein BN. Pharmacogenetics in the rheumatic diseases, from pret-aporter to haute couture // Nat Clin Pract Rheumatol. 2006. Vol. 2(1). P. 2–3. 162. Davila L, Ranganathan P. Pharmacogenetics: implications for therapy in rheumatic diseases // Nat Rev Rheumatol. 2011. – Vol. 7 (9). – P. 537–550. 163. Zeng M, Zhang M, Liu F. et al. Drug Eruptions Induced by Allopurinol Associated with HLA-B*5801 // Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2015. – Vol. 81. – P. 43-45 164. Cargnin S, Jommi C, Canonico PL. et al. Diagnostic accuracy of HLAB*57:01 screening for the prediction of abacavir hypersensitivity and clinical utility of the test: a meta-analytic review // Pharmacogenomics. 2014. – Vol. 15 (7). – P. 963-976. 165. Oyarzun P, Ellis JJ, Gonzalez-Galarza FF. et al. A bioinformatics tool for epitope-based vaccine design that accounts for human ethnic diversity: application to emerging infectious diseases // Vaccine. 2015. – Vol. 3;33 (10). – P. 1267-1273. 166. Тынышпаев М. История казахского народа. Составители и авторы предисловия проф. Такенов А. С. и Байгалиев Б. Алма.-Ата, 1993. – С. 115. 167. Пищулина К.А. Юго-Восточный Казахстан в середине ХIV – начале ХVI веков (вопросы политической и социально-экономической истории). АлмаАта, 1977. С. 262 168. Толстов С.П., Жданко Т.А., Абрамзон C.А., Кислякова Н.А. Народы Средней Азии и Казахстана акад. Наук, Институт этнографии. Н. МиклухоМаклая. - Москва: Изд-во Акад. Наук СССР. 1963. – Часть. 2. – С. 777. 169. Galina M. Berezina, Gulnara S. Svyatova, and Zhanar Makhmutova. The analysis of the genetic structure of the Kazakh population as estimated from mitochondrial DNA polymorphism // Medical and Health Science Journal (MHSJ). 2011. – Vol. 6 – P. 2–6. 117 170. Численность населения Республики Казахстан по отдельным этносам на начало 2015 года. Министерство национальной экономики Республики Казахстан Комитет по статистике. Астана, 2015 - Серия 14. 171. http://www.china.org.cn/english/features/EthnicGroups/136924.htm 172. https://www.cia.gov/library/publications/the-world-factbook/geos/uz.html 173. Всероссийская перепись населения 2010 года, Том 4. 1. Национальный состав населения. 13 с. 174. Kuranov AB, Kozhamkulov UA, Vavilov MN, et al. HLA-class II alleles in patients with drug-resistant pulmonary tuberculosis in Kazakhstan // Tissue Antigens. 2014. – Vol. 83 (2). – P. 106-112. 175. Hoppe B, Salama A. Sequencing-based typing of HLA // Methods Mol Med. 2007. – Vol. 134. – P. 71–80. 176. Kotsch K, Wehling J, Blasczyk R. Sequencing of HLA class II genes based on the conserved diversity of the non-coding regions: sequencing based typing of HLADRB genes // Tissue Antigens. 1999. – Vol. 53. – P. 486–497. 177. Sayer D, Whidborne R, Brestovac B. et al. HLA-DRB1 DNA sequencing based typing: an approach suitable for high throughput typing including unrelated bone marrow registry donors // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 57. – P. 46–54. 178. Dunn PP, Day S, Williams S, Bendukidze N. DNA sequencing as a tissuetyping tool // Methods Mol Med. 2004. – Vol. 91. – P. 233–246. 179. Voorter CE, van den Berg-Loonen EM. Sequence-based typing of the complete coding sequence of DQA1 and phenotype frequencies in the Dutch Caucasian population // Hum Immunol. 2006. – Vol. 67. – P. 756–763. 180. Rajalingam R, Ge P, Reed EF. A sequencing-based typing method for HLADQA1 alleles // Hum Immunol. 2004. Vol. 65. P. 373–379. 181. Dunn PP, Day S, Williams S, Bendukidze N. HLA-DQB1 sequencing-based typing using newly identified conserved nucleotide sequences in introns 1 and 2 // Tissue Antigens. 2005. – Vol. 66. – P. 99–106. 118 182. Gonzalez-Galarza FF, Christmas S, Middleton D and Jones AR. Allele frequency net: a database and online repository for immune gene frequencies in worldwide populations // Nucleic Acid Research. 2011. – Vol. 39. – P 913–919. 183. Doherty DG, Vaughan RW, Donaldson PT and Mowat AP. HLA DQA, DQB, and DRB genotyping by oligonucleotide analysis: distribution of alleles and haplotypes in British caucasoids // Hum Immunol. 1992. – Vol. 34 (1). – P. 53-63. 184. Bera O, Cesaire R, Quelvennec E. et al. HLA class I and class II allele and haplotype diversity in Martinicans // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 57 (3). – P. 200-207. 185. Mas A, Blanco E, Moñux G. et al. DRB1-TNF-alpha-TNF-beta haplotype is strongly associated with severe aortoiliac occlusive disease, a clinical form of atherosclerosis // Hum Immunol. 2005. – Vol. 66 (10). – P. 1062-1067. 186. Pascual M, Nieto A, López-Nevot MA. et al. Rheumatoid arthritis in southern Spain: toward elucidation of a unifying role of the HLA class II region in disease predisposition // Arthritis Rheum. 2001. – Vol. 44 (2). – P. 307-314. 187. Sulcebe G, Sanchez-Mazas A, Tiercy J-M. et al. HLA allele and haplotype frequencies in the Albanian population and their relationship with the other European populations // Int J Immunogenet. 2009. – Vol. 36. – P. 337-343. 188. Suslova TA, Burmistrova AL, Chernova MS. et al. HLA gene and haplotype frequencies in Russians, Bashkirs and Tatars, living in the Chelyabinsk Region (Russian South Urals) // Int J Immunogenet. 2012. – Vol. 39 (5). – P. 394-408. 189. Болдырева M. H., Гуськова И. А., Богатова О. В. и др. HLAгенетическое разнообразие населения России и СНГ. II. Народы Европейской части // Иммунология. – 2006. – № 4. – С. 198–202. 190. Ivanova M, Rozemuller E, Tyfekchiev N. et al. HLA polymorphism in Bulgarians defined by high-resolution typing methods in comparison with other populations // Tissue Antigens. 2002. – Vol. 60. – P. 496-504 191. Arnaiz-Villena A, Martinez-Laso J, Moscoso J. et al. HLA genes in the Chuvashian population from European Russia: admixture of Central European and Mediterranean populations // Hum Biol. 2003. – Vol. 75 (3). – P. 375-392. 119 192. Nowak J, Mika-Witkowska R, Polak M. et al. Allele and extended haplotype polymorphism of HLA-A, -C, -B, -DRB1 and -DQB1 loci in Polish population and genetic affinities to other populations // Tissue Antigens. 2008. – Vol. 71 (3). – P. 193205. 193. Kapustin S, Lyshchov A, Alexandrova J. et al. HLA class II molecular polymorphisms in healthy Slavic individuals from North-Western Russia // Tissue Antigens. 1999. – Vol. 54 (5). – P. 517-520. 194. Cechová E, Fazekasová H, Ferencík S. et al. HLA-DRB1, -DQB1 and DPB1 polymorphism in the Slovak population // Tissue Antigens. 1998. – Vol. 51 (5). – P. 574-576. 195. Matevosyan L, Chattopadhyay S, Madelian V. et al. HLA-A, HLA-B, and HLA-DRB1 allele distribution in a large Armenian population sample // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 78 (1). – P. 21-30. 196. Arnaiz-Villena A, Iliakis P, González-Hevilla M. et al. The origin of Cretan populations as determined by characterization of HLA alleles // Tissue Antigens. 1999. – Vol. 53 (3). – P. 213-226. 197. Sánchez-Velasco P, Leyva-Cobián F. The HLA class I and class II allele frequencies studied at the DNA level in the Svanetian population (Upper Caucasus) and their relationships to Western European populations // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 58. – P. 223-233. 198. Martinez-Laso J, Gazit E, Gomez-Casado E. et al. HLA DR and DQ polymorphism in Ashkenazi and non-Ashkenazi Jews: comparison with other Mediterraneans // Tissue Antigens. 1996. – Vol. 47 (1). – P. 63-71. 199. Amar A, Kwon OJ, Motro U. et al. Molecular analysis of HLA class II polymorphisms among different ethnic groups in Israel // Hum Immunol. 1999. – Vol. 60 (8). – P. 723-730. 200. Farjadian S, Ghaderi A. HLA class II similarities in Iranian Kurds and Azeris // Int J Immunogenet. 2007. – Vol. 34 (6). – P. 457-463. 201. Samaha H, Rahal EA, Abou-Jaoude M. et al. HLA class II allele frequencies in the Lebanese population // Mol Immunol. 2003. – Vol. 39 (17-18). – P. 1079-1081. 120 202. Arnaiz-Villena A, Dimitroski K, Pacho A, et al. HLA genes in Macedonians and the sub-Saharan origin of the Greeks // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 57(2). – P. 118127. 203. Arnaiz-Villena A, Elaiwa N, Silvera C. et al. The origin of Palestinians and their genetic relatedness with other Mediterranean populations // Hum Immunol. 2001. – Vol. 62 (9). – P. 889-900. 204. Uinuk-Ool TS, Takezaki N, Sukernik RI. et al. Origin and affinities of indigenous Siberian populations as revealed by HLA class II gene frequencies // Hum Genet. 2002. – Vol. 110 (3). – P. 209-226. 205. Хидиятова И.М., Ишмухаметова А.Т., Лукманова Г.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ полиморфизма гена HLA-DRB1 в популяциях Волго-Уральского региона // Генетика. 2004. – №2. – С. 267-271. 206. Rønningen KS, Spurkland A, Markussen G. et al. Distribution of HLA class II alleles among Norwegian Caucasians //Hum Immunol. 1990. – Vol. 29 (4). – P. 275281. 207. Evseeva I, Spurkland A, Thorsby E. et al. (2002). HLA profile of three ethnic groups living in the North-Western region of Russia // Tissue Antigens. 2002. – Vol. 59. – P. 38–43. 208. Brynedal B, Duvefelt K, Jonasdottir G. et al. HLA-A confers an HLA-DRB1 independent influence on the risk of multiple sclerosis // PLoS One. 2007. – Vol. 2 (7). – e664. 209. Moscoso J, Crawford MH, Vicario JL. et al. HLA genes of Aleutian Islanders living between Alaska (USA) and Kamchatka (Russia) suggest a possible southern Siberia origin. Mol Immunol. 2008. – 45 (4). – P. 1018-1026. 210. Grahovac B, Sukernik RI, O'hUigin C. et al. Polymorphism of the HLA class II loci in Siberian populations // Hum Genet. 1998. – Vol. 102 (1). – P. 27-43. 211. Uinuk-Ool TS, Takezaki N, Derbeneva OA et al. Variation of HLA class II genes in the Nganasan and Ket, two aboriginal Siberian populations // Eur J Immunogenet. 2004. – Vol. 31 (1). – P. 43-51. 121 212. Martinez-Laso J, Sartakova M, Allende L. et al. HLA molecular markers in Tuvinians: a population with both Oriental and Caucasoid characteristics // Ann Hum Genet. 2001. – Vol. 65 (3). – P. 245-261. 213. Shen CM, Zhu BF, Ye SH. et al. Allelic diversity and haplotype structure of HLA loci in the Chinese Han population living in the Guanzhong region of the Shaanxi province // Hum Immunol. 2010. – Vol. 71 (6). – P. 627-633 214. Matsumura Y, Kinouchi Y, Nomura E. et al. HLA-DRB1 alleles influence clinical phenotypes in Japanese patients with ulcerative colitis // Tissue Antigens. 2008. – Vol. 71 (5). – P. 447-452. 215. Song EY, Park MH, Kang SJ. et al. HLA class II allele and haplotype frequencies in Koreans based on 107 families // Tissue Antigens. 2002. – Vol. 59 (6). – P. 475-486. 216. Mizuki M, Ohno S, Ando H. et al. Major histocompatibility complex class II alleles in Kazak and Han populations in the Silk Route of northwestern China // Tissue Antigens. 1997. – Vol. 50 (5). – P. 527-534. 217. Mizuki N, Ohno S, Ando H. et al. Major histocompatibility complex class II alleles in an Uygur population in the Silk Route of Northwest China // Tissue Antigens. 1998. – Vol. 51 (3). – P. 287-292. 218. Mack SJ, Bugawan TL, Moonsamy PV. et al. Evolution of Pacific/Asian populations inferred from HLA class II allele frequency distributions // Tissue Antigens. 2000. Vol. 55 (5). P. 383-400. 219. Vu-Trieu A, Djoulah S, Tran-Thi C. et al. HLA-DR and -DQB1 DNA polymorphisms in a Vietnamese Kinh population from Hanoi // Eur J Immunogenet. 1997. – Vol. 24 (5). – P. 345-356. 220. Arnaiz-Villena A, Karin M, Bendikuze N. et al. HLA alleles and haplotypes in the Turkish population: relatedness to Kurds, Armenians and other Mediterraneans // Tissue Antigens. 2001. – Vol. 57 (4). – P. 308-317. 221. Arnaiz-Villena A, Vargas-Alarcón G, Granados J. et al. HLA genes in Mexican Mazatecans, the peopling of the Americas and the uniqueness of Amerindians // Tissue Antigens. 2000. – Vol. 56 (5). – P. 405-416. 122 222. Tsuneto LT, Probst CM, Hutz MH. et al. HLA class II diversity in seven Amerindian populations. Clues about the origins of the Aché // Tissue Antigens. 2003. – Vol. 62 (6). – P. 512-526. 223. Welinder L, Graugaard B, Madsen M. HLA antigen and gene frequencies in Eskimos of East Greenland // Eur J Immunogenet. 2000. – Vol. 27 (2). – P. 93-97. 224. Leffell MS, Fallin MD, Erlich HA, et al. HLA antigens, alleles and haplotypes among the Yup'ik Alaska natives: report of the ASHI Minority Workshops, Part II // Hum Immunol. 2002. – Vol. 63 (7). – P. 614-625. 225. World Health Organization: Laboratory services in tuberculosis control. Part III: culture. Global Tuberculosis Programme WHO/TB/98.258. Geneva, Switzerland, World Health Organization, 1998. 226. World Health Organization Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis: second edition World Health Organization. Global Tuberculosis Programme WHO/CDS/TB/2003.320. Geneva, Switzerland, World Health Organization, 2003 227. Kruskal JB. Nonmetric multidimensional scaling: a numerical method // Psychometrika. 1964. – Vol. 29 (2) – P. 115–129. 228. Johansson A, Ingman M, Mack SJ. et al. Genetic origin of the Swedish Sami inferred from HLA class I and class II allele frequencies // Eur J Hum Genet. 2008. – Vol. 16 (11). – P. 1341-1349. 229. Excoffier L, Laval G, Schneider S: Arlequin (version 3.0): An integrated software package for population genetics data analysis // Evol Bioinform Online. 2005. – Vol. – P. 47–50. 230. Marsh SGE, Albert ED, Bodmer WF et al. Nomenclature for factors of the HLA system // Tissue Antigens. 2010. – Vol. 75. – P. 291–455. 231. Kuranov AB, Mukhamedyarov DA, Momynaliev KT. Identification of new HLA-DRB1 alleles in Kazakh individuals // Tissue Antigens. 2011. – Vol. 77 (3). – P. 263-264. 123 232. Paul P.J. Dunn, Steven T. Cox and Ann-Margaret Little. Sequencing Protocols for Detection of HLA Class I Polymorphis // Methods in Molecular Biology. 2003. – Vol. 210. – P. 191-222. 233. Lazaro AM, Xiao Y, Masaberg C et al. Novel alleles at the HLA-DRB1 and -DQB1 loci // Tissue Antigens. 2008. – Vol. 72. – P. 72–74. 234. Девальд, И.В. Иммуногенетическая характеристика ревматоидного артрита и HLA-генетический профиль башкирской популяции Южного Урала: дис. ... канд. биол. наук: 14.00.36/ Девальд, Инесса Валерьевна. - Ч.: 2006, 130 с 235. Combe B, Eliaou JF, Daurès JP, Meyer O, Clot J, Sany J. Prognostic factors in rheumatoid arthritis. Comparative study of two subsets of patients according to severity of articular damage // Br J Rheumatol. 1995. – Vol. 34(6). – P. 529-534. 236. Morgan, A. W., Haroon-Rashid, L., Martin, S. G., et al., The shared epitope hypothesis in rheumatoid arthritis: Evaluation of alternative classification criteria in a large UK Caucasian cohort //Arthritis & Rheumatism. 2002. – Vol. 58. – P. 1275–1283. 237. de Vries N, Tijssen H, van Riel PL, van de Putte LB. Reshaping the shared epitope hypothesis: HLA-associated risk for rheumatoid arthritis is encoded by amino acid substitutions at positions 67-74 of the HLA-DRB1 molecule // Arthritis Rheum. 2002. – Vol. 46(4). – P. 921-928. 238. Lundström, E., Källberg, H., Smolnikova, et al. Opposing effects of HLA– DRB1*13 alleles on the risk of developing anti–citrullinated protein antibody–positive and anti–citrullinated protein antibody–negative rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. 2009. – Vol. 60. – P. 924–930. 239. Seidl, C., Käßer, U. R., Fischer, B., et al. HLA-DR/DQ interaction in patients with erosive rheumatoid arthritis presenting articular and extraarticular disease manifestations // European Journal of Immunogenetics. 1999.– Vol. 26: – P. 19–27. 240. Seitz M1, Perler M, Pichler W. Only weak association between disease severity and HLA-DRB 1 genes in a Swiss population of rheumatoid arthritis patients // Rheumatol Int. 1996. – Vol. 16(1). – P. 9-13. 124 241. Kapitány A, Zilahi E, Szántó S, et al Association of rheumatoid arthritis with HLA-DR1 and HLA-DR4 in Hungary // Annals of the New York Academy of Sciences. 2005. – Vol. 1051. – P. 263–270. 242. Prifti-Kurti M, Nunes JM, Shyti E, et al. HLA-DRB1 and HLA-DQB1 allele associations in an Albanian patient population with rheumatoid arthritis: correlations with the specific autoantibody markers and inter-population DRB1 allele frequency variability. // Rheumatol Int. 2014. – Vol. 34(8). – P. 1065-1071. 243. Stavropoulos C, Spyropoulou M, Koumantaki Y, et al. HLA-DRB1 alleles in Greek rheumatoid arthritis patients and their association with clinical characteristics // Eur J Immunogenet. 1997. – Vol. 24(4). – P. 265-274. 244. Uçar F, Karkucak M, Alemdaroğlu E, et al. HLA-DRB1 allele distribution and its relation to rheumatoid arthritis in eastern Black Sea Turkish population // Rheumatol Int. 2012. – Vol. 32(4). – P. 1003-1007. 245. Farouk, H.M., Mansour, H.E., Rahman, S.A., et al. (2009). Effect of the human leukocyte antigen HLA-DRB1 and anti-cyclic citrullinated peptide on the outcome of rheumatoid arthritis patients // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2009. Vol. 42 (9). – P. 831-838. 246. Alsaeid K, Alawadhi A, Al-Saeed O, Haider MZ. Human leukocyte antigen DRB1*04 is associated with rheumatoid arthritis in Kuwaiti patients // Joint Bone Spine. 2006. – Vol. 73(1). – P. 62-65. 247. Prasannavar DJ, Yeola A, Pradhan V, et al. Distribution of HLA-DRβ1 alleles among well-characterized rheumatoid arthritis patients from Western India // Rheumatol Int. 2014. . – Vol. 34 (5). – P. 701-705. 248. Muazzam AG, Mansoor A, Ali L, et al. Association of HLA-DRB1 and DQB1 alleles and haplotypes with rheumatoid arthritis in a Pakistani population // Arthritis Res Ther. 2013. – Vol. 15 (4). – R95. 249. Lee, H.-S., Lee, K. W., Song, G. G., et al. Increased susceptibility to rheumatoid arthritis in Koreans heterozygous for HLA–DRB1*0405 and *0901 // Arthritis & Rheumatism. 2004. – Vol. 50. – P. 3468–3475. 125 250. Oka S, Furukawa H, Kawasaki A, et al. (2014) Protective Effect of the HLADRB1*13:02 Allele in Japanese Rheumatoid Arthritis Patients // PLoS ONE. 2014. – Vol. 9(6). – P. e99453. 251. Chun-Lai T, Padyukov L, Dhaliwal JS. et al. Shared Epitope Alleles Remain A Risk Factor for Anti-Citrullinated Proteins Antibody (ACPA) – Positive Rheumatoid Arthritis in Three Asian Ethnic Groups // PLoS ONE. 2011. – Vol. 6(6). – P. e21069. 252. Molkentin J, Gregersen PK, Lin X, et al. Molecular analysis of HLA-DR beta and DQ beta polymorphism in Chinese with rheumatoid arthritis // Ann Rheum Dis. 1993. – Vol. 52(8). – P. 610-612. 253. Djidjik, R., Allam, I., Douaoui, S., et al. Association study of human leukocyte antigen-DRB1 alleles with rheumatoid arthritis in Algerian patients // International Journal of Rheumatic Diseases. doi: 10.1111/1756-185X.12272 254. Mourad J, Monem F. HLA-DRB1 allele association with rheumatoid arthritis susceptibility and severity in Syria //Rev Bras Reumatol. 2013. – Vol. 53(1). – P. 47-56. 255. Sandoughi M, Fazaeli A, Bardestani G, Hashemi M. Frequency of HLADRB1 alleles in rheumatoid arthritis patients in Zahedan, southeast Iran. Annals of Saudi Medicine. 2011. – Vol. 31(2). – P. 171-173. 256 Таукумова Л. А., Гусева И. А. Аллели HLA-DRB1 у пациентов с ревматоидным артритом // Научно-практическая ревматология. 2004. – №4. – С. 29-34. 257. Gregersen PK, Shen M, Song QL. et al. Molecular diversity of HLA-DR4 haplotypes // Proc Natl Acad Sci U S A.1986. – Vol. 83 – P. 2642–2646 258. Gregersen PK, Silver J, Winchester RJ. The shared epitope hypothesis. An approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. 1987. – Vol. 30: – P. 1205–1213 259. Mourad J, Monem F. HLA-DRB1 allele association with rheumatoid arthritis susceptibility and severity in Syria // Rev Bras Reumatol. 2013. – Vol. 53 (1). – P.47-56. 126 260. Saghafi M, Nohesara N, Rafatpanah H. et al. HLA-DRB1 frequency in patients with familial and sporadic rheumatoid arthritis in north east of Iran // Clin Rheumatol. 2014. – Vol. 33 (10). – P. 1397-1402. 261. Laki J., Lundström E., Snir O. et al. Very high levels of anti–citrullinated protein antibodies are associated with HLA–DRB1*15 non–shared epitope allele in patients with rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. 2012. – Vol. 64. – P. 2078– 2084. 262. Kurkó J, Besenyei T, Laki J, et al. Genetics of Rheumatoid Arthritis — A Comprehensive Review // Clinical reviews in allergy & immunology. 2013. – Vol. 45 (2). – P. 170-179. 263. van der Woude D, Alemayehu WG, Verduijn W. et al. Gene–environment interaction influences the reactivity of autoantibodies to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis // Nat Genet. 2010. – Vol. 42 (10). – P. 814–816. 264. Szodoray P, Szabo Z, Kapitany A. et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis // Autoimmun Rev. 2010. Vol. 9 (3) P. 140–143. 265. Padyukov L, Silva C, Stolt P. et al. A gene–environment interaction between smoking and shared epitope genes in HLA-DR provides a high risk of seropositive rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. 2004. – Vol. 50 (10). – P. 3085–3092. 266. van der Helm-van Mil, A. H. M., Verpoort, K. N., le Cessie, S. et al. The HLA–DRB1 shared epitope alleles differ in the interaction with smoking and predisposition to antibodies to cyclic citrullinated peptide // Arthritis & Rheumatism. 2007. – Vol. 56. – P. 425–432. 267. Kapitány A, Szabó Z, Lakos G. et al. Associations between serum anti-CCP antibody, rheumatoid factor levels and HLA-DR4 expression in Hungarian patients with rheumatoid arthritis // Isr Med Assoc J. 2008. – Vol. 10 (1). – P. 32-36. 268. van der Woude, D., Houwing-Duistermaat, J.J., Toes R.E.M. et al. Quantitative heritability of anti–citrullinated protein antibody–positive and anti– citrullinated protein antibody–negative rheumatoid arthritis // Arthritis & Rheumatism. 2009. – Vol. 60. – P. 916–923. 127 269. van der Woude D., Lie B.A., Lundström E. et al. Protection against anti– citrullinated protein antibody–positive rheumatoid arthritis is predominantly associated with HLA–DRB1*1301: A meta-analysis of HLA–DRB1 associations with anti– citrullinated protein antibody–positive and anti–citrullinated protein antibody–negative rheumatoid arthritis in four European populations //Arthritis & Rheumatism. 2010. – Vol. 62. – P. 1236–1245. 270. Acland A, Agarwala R, Barrett T et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information // Nucleic Acids Res. 2014. – Vol. 42. – P. 7-17. 271. Jinam TA, Saitou N, Edo J. et al. Molecular analysis of HLA Class I and Class II genes in four indigenous Malaysian populations // Tissue Antigens. 2010. – Vol.75 (2): – P.151-158 272. Balanovsky O., Rootsi S., Pshenichnov A. et al. Two sources of the Russian patrilineal heritage in their Eurasian context // Am J Hum Genet. 2008. – Vol. 82. – P. 236–250. 273. Dulik MC, Osipova LP, Schurr TG. Y-chromosome variation in Altaian kazakhs reveals a common paternal gene pool for Kazakhs and the influence of mongolian expansions // PLoS ONE. 2011. – Vol. 6. – P. e17548. 274. Деренко М.В., Малярчук Б.А., Возняк М. и др. Распределение мужских линий потомков Чингисхана в северных евразийских популяций // Генетика. 2007. – Т.43, № 3. – C. 422-426. 275. Derenko M, Malyarchuk B, Grzybowski T. et al. Origin and post-glacial dispersal of mitochondrial DNA haplogroups C and D in northern Asia // PLoS One. 2010. – Vol. 5(12). – P. e15214. 276. Alexeev LP and Petranji G. HLA in eight ethnic groups from the former USSR // Proceedings of the 11th International Histocompability Workshop and Conference. 1991. – Vol. 1. – P. 666 – 673. 277. Chen RB, Ye GY, Geng ZC et al. HLA polymorphism of the principal minority nationalities in mainland China. In: Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T. et al. HLA 1991. Proceedings of the 11th International Histocompatibility Workshop Conference. Oxford: Oxford University Press. 1992. – Vol. 1. – P. 676 - 679. 128 278. Shen CM, Zhu BF, Deng YJ. et al. Allele polymorphism and haplotype diversity of HLA-A, -B and -DRB1 loci in sequence-based typing for Chinese Uyghur ethnic group // PLoS One. 2010. – Vol. 4;5 (11) – P. e13458. 279. Selvaraj P. Host genetics and tuberculosis susceptibility // Curr Sci. 2004. – Vol. 86. – P. 115-121. 280. Selvaraj P, Raghavan S, Swaminathan S. et al. HLA-DQB1 and -DPB1 allele profile in HIV infected patients with and without pulmonary tuberculosis of south India // Infect Genet Evol. 2008. – Vol.8 (5). – P. 664-671. 281. Yuliwulandari R, Sachrowardi Q, Nakajima H. et al. Association of HLAA, -B, and -DRB1 with pulmonary tuberculosis in western Javanese Indonesia // Hum Immunol. 2010. – Vol.71. – P. 697–701 282. Vejbaesya S, Chierakul N, Luangtrakool K et al. Associations of HLA class II alleles with pulmonary tuberculosis in Thais. Eur J Immunogenet 2002: 29: 431–434. 283. Dubaniewicz A, Moszkowskab G, Szczerkowskac Z. Frequency of DRB1DQB1 two-locus haplotypes in tuberculosis: preliminary report // Tuberculosis (Edinb). 2005. – Vol. 85. – P. 259–267. 284. Teran-Escandon D, Teran-Ortiz L, Camarena-Olvera A. et al. Human leukocyte antigen-associated susceptibility to pulmonary tuberculosis: molecular analysis of class II alleles by DNA amplification and oligonucleotide hybridization in Mexican patients // Chest. 1999. – Vol. 115. – P. 428-433. 285. Yen JH, Chen CJ, Tsai WC. et al. HLA-DQA1 genotyping in patients with rheumatoid arthritis in Taiwan // Kaohsiung J Med Sci. 2001. – Vol. 17 (4). – P. 183189. 286. Naruse TK, Matsuzawa Y, Ota M. et al. HLA-DQB1*0601 is primarily associated with the susceptibility to cardiac sarcoidosis // Tissue Antigens. 2000. – Vol. 56 (1). – P. 52-57 287. Qiu W, Wu JS, Castley A. et al. Clinical profile and HLA-DRB1 genotype of late onset multiple sclerosis in Western Australia // J Clin Neurosci. 2010. – Vol. 17 (8). – Vol. – P. 1009-1013. 129 288. Mullarkey ME, Stevens AM, McDonnell WM. et al. Human leukocyte antigen class II alleles in Caucasian women with primary biliary cirrhosis // Tissue Antigens. 2005. – Vol. 65 (2). – P.199-205. 289. Kim HS, Park MH, Song EY. et al. Association of HLA-DR and HLA-DQ genes with susceptibility to pulmonary tuberculosis in Koreans: preliminary evidence of associations with drug resistance, disease severity, and disease recurrence // Hum Immunol. 2005. – Vol. 66. – P. 1074-1081. 290. Atouf O, Benbouazza K, Brick C et al. HLA polymorphism and early rheumatoid arthritis in the Moroccan population // Joint Bone Spine. 2008. – Vol. 75 (5). – P. 554–558. 291. Dhaouadi T, Sfar I, Abdelmoula L et al. Association of specific amino acid sequence (QRRAA) of HLA-DRB1*0405 with rheumatoid arthritis in a Tunisian population //Arch Inst Pasteur Tunis. 2010. – Vol. 87 (1–2). – P. 53–59. 292. Reviron D, Foutrier C, Guis S. et al. DRB1 alleles in polymyalgia rheumatica and rheumatoid arthritis in southern France // Eur J Immunogenet. 2011. – Vol. 28. – P. 83–87. 293. Yelamos J, Garcia-Lozano JR, Moreno I et al. Association of HLA-DR4Dw15 (DRB1*0405) and DR10 with rheumatoid arthritis in a Spanish population // Arthritis Rheum. 1993. – Vol. 36. – P. 811–814. 294. Stastny P. Association of the B-cell alloantigen DRw4 with rheumatoid arthritis // N Engl J Med. 1978. – Vol. 298. – P. 869–871. 295. Huizinga TW, Amos CI, van der Helm-van Mil AH. et al. Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins // Arthritis Rheum. 2005. – Vol. 52. – P. 3433–3438. 296. Stark K, Rovensky J, Blazickova S. et al. Association of common polymorphisms in known susceptibility genes with rheumatoid arthritis in a Slovak population using osteoarthritis patients as controls // Arthritis Res Ther. 2009. – Vol. 11(3). – R70. 130 297. Laivoranta-Nyman S, Möttönen T, Hermann R. et al. HLA-DR-DQ haplotypes and genotypes in Finnish patients with rheumatoid arthritis // Ann Rheum Dis. 2004. – Vol. 63. – P. 1406–1412. 298. del Rincon I, Escalante A. HLA-DRB1 alleles associated with susceptibility or resistance to rheumatoid arthritis, articular deformities, and disability in Mexican Americans // Arthritis Rheum. 1999. – Vol. 42(7). – P. 1329–1338. 299. Castro F, Acevedo E, Ciusani E. et al. Tumour necrosis factor microsatellites and HLADRB1*, HLA-DQA1*, and HLA-DQB1* alleles in Peruvian patients with rheumatoid arthritis // Ann Rheum Dis. 2001. – Vol. 60(8). – P. 791–795. 300. Bax M, Van Heemst J, Huizinga TWJ. et al. Genetics of rheumatoid arthritis: what have we learned? // Immunogenetics. 2011. – Vol.63 – P. 459–466. 301. Boissier MC. Cell and cytokine imbalances in rheumatoid synovitis // Joint Bone Spine. 2011. –Vol. 78 (3). – P. 230–23.
