http://www.enu.kz УДК 58.071 ВЛИЯНИЕ ВИРУСА КУСТИСТОЙ

http://www.enu.kz
УДК 58.071
ВЛИЯНИЕ ВИРУСА КУСТИСТОЙ КАРЛИКОВОСТИ ТОМАТОВ НА
ФОТОСИНТЕЗ РАСТЕНИЙ
Акбасова А.Ж., Мукиянова Г.С., Сутула М.Ю.
Евразийский национальный университет им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан
[email protected]
http://www.enu.kz
Вирус-инфицированные растения проявляют сильные морфологические и
физиологические изменения в виде симптомов, таких как хлороз и некроз
ассоциированные с изменением структуры и функции хлоропласта [1,2,3]. Развитие
технологии обработки различных изображений, таких как Chlorophyll Fluorescence
Imaging system (Chl-FI) , позволяющих изучать красную флюоресценцию, излучаемую
хлорофиллом a (Хл а), предоставляет возможность изучения изменения эффективности
фотосинтеза в листьях в ответ на воздействие биотических и абиотических факторов
[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17]. Это оборудование применяется специально при
воздействии биотического стресса, когда не проявляются видимые симптомы, не
фиксируются гетерогенность метаболизма и активность фотосинтеза.
С тех пор, как впервые Бѐрн и Форсберг [18] использовали детекцию
люминесценции хлорофилла для изучения неравномерного фотосинтеза в листьях в ответ
на воздействие патогенов, появилось множество современных прототипов той машины,
позволяющей изучать распространение инфекции и определить их влияние на
фотосинтетическую систему. Таким образом, на сегодняшний день по данным Chl-FI
установлено, что при взаимосвязи растение – патоген, в случае грибков, фотосинтез в
симтоматических листьях ингибируется [19,20,21,22,23,24]. А так же при грибковых
заболеваниях
зарегистрированы
изменения
в
параметрах
флюоресценции
предшествующих развитию симптомов [25,26,27]. В дополнении к этому анализы,
проведенные при помощи Chl-FI, могут показать изменения метаболизма в
инфицированных растениях. Таким образом, локальные изменения в цикле Кальвина и
метаболизме углеводов [28,29,30,31].
В настоящей работе Chl-FI был использован для изучения влияния Вируса
Кустистой Карликовости томатов (ВККТ) на Nicotiana benthamiana и Solanum licopersicum
L. (cv. Money Maker). Вирус кустистой карликовости томатов (TBSV) – сферический
вирус (34 нанометров в диаметре), типичный представитель семейства Tombusviridae,
содержит одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности длинной в 4800
нуклеотидов, окруженную оболочкой из 180 идентичных белковых субъединиц массой 41
кДа [32] (Рис. 1). Вирус кодирует пять белков, репликазы P33 и P92 транслируются с
гРНК (геномной РНК), капсидный белок CP41 c сгРНК1 (субгеномной РНК1), белок
супрессор нуклеазной активности P19 и белок отвечающий за движение вируса в
организме хозяина P22 с сгРНК2 (субгеномной РНК2).
http://www.enu.kz
Рисунок 1- Молекулярная структура Вируса кустистой карликовости томатов
(ВККТ)
Материалы и методы. Растительный и вирусный материал. Nicotiana
benthamiana однолетнее травянистое растение, относящееся к семейству Solanaceae
(паслѐновые), роду Nicotiana которое является чувствительным к инфицированию TBSV.
Nicotiana benthamiana выращивалась на черноземе, а томаты выращивались в 250 мл
горшках со смесью песка и почвы (1:4) и поливались 2 раза в неделю 25% питательным
раствором Хьюит (Hewitt), в теплице с бело-флюоресцентными лампами, с 16-и часовым
фотопериодом, и температурным режимом 25/20°C (день и ночь) с относительной
влажностью 80%. Средние листья растений были инокулированы при помощи втирания
на всю его поверхность вирусного материала с карборандумом (20µl вирусного материала
на каждое растение) (Рис. 2).
Рисунок 2- Схематическое распределения ВККТ в Nicotiana benthamiana
Выделение и очистка
гидроксоаппатитной колонке.
вирионов
с
вирусного
материала
проводили
на
Визуализация
красной
флуоресценции
при
помощи
насыщенного,
пульсирующего режима. Система Chl-FI использованная в данной работе полностью
компьютеризирована [33]. Принцип работы направлен на активацию, визуализацию и
http://www.enu.kz
анализ хлорофильной флюоресценции. Большая область освещения предоставляется в 2-х
интенсивностях (k < 650 nm) при помощи восьми узловых волокон соединенных в
циркулярную систему. Актиновое освещение (220 lE m–2 s–1) подается при помощи синего
фильтра 150 W ксеноновой лампы, модели FOT 150 FiberOptic (P. + P. AG, Spreitenbach,
Switzerland) и насыщенный свет (1200 lE m–2 s–1) подается благодаря 4-м дополнительным
250 W ксеноновым лампам (Osram Xenophot HLX, Osram GmbH, MЬnchen, Germany),
установленным в LQ 2600 отделе (Fiberoptic-Heim AG, Uetikon am See, Switzerland) со
встроенным насыщенным CuSO4 раствором голубым фильтром пропускающим через
себя низкочастотные сигналы. Флюоресценция собирается при помощи XC-75 (Sony
Corporation, Tokyo, Japan) черно-белой CCD (charge-coupled device) камеры со встроенной
линзой и красным низкочастотным (k > 680 nm) фильтром (Schneider Optics Inc.,
Hauppage, NY, USA) [34]. Проходящий через фильтры сигнал автоматический
конвертируется в цифровые данные при помощи Osprey-100 карты. Растения 30 минут
предварительно адаптируются к темноте. Затем подается актиновый свет с последующим
пульсирующим, насыщенным светом в течение 200 секунд. Кинетика патогенеза ВККТ в
N. benthamiana и Tomato Money Maker прослеживалась путем получения фотографии при
помощи различных параметров Chl-FI по сравнению с контрольными и
инфицированными растениями. Измерение проводили в течение 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 24 и
28 дней после инокуляции (дпи). В первые 7 дней никаких изменений отличных от
контрольных растений не было. Первые изменения были зарегистрированы в период
между 14-17 дпи. в обоих растениях (N. benthamiana и Tomato Money Maker).
Результаты и обсуждение. В некоторых случаях при инфицировании растений
вирусом происходит локальные изменения в листьях в виде неоднородной ассимиляции
CO2, фотосинтеза, накоплении крахмала и нарушение флуоресценции. После проведения
Chl-FI исследований выяснилось, что в контрольных растениях листья флуоресцируют
интенсивным синим цветом, свидетельствующим о достаточном количестве хлорофиллов
в листьях. А так же слабо красный оттенок говорит о присутствии вторичных
метаболитов, что является нормой, но при биотическом стрессе уровень вторичных
метаболитов повышается из-за нарушения фотосистемы. Поэтому в инфицированных
образцах можно детектировать интенсивное красное свечение (Рис. 3).
Рисунок 3 - Chl-FI исследования проведенные на Nicotiana Benthamiana и Tomato
Money Maker
Еще в давних исследованиях для ранней диагностики инфекции Вируса табачной
мозаики (ТМВ) в вирус-инфицированных Nicotiana tabacum были использованы Chl-FI
[34]. В тех исследованиях было показано, что ранний признак инфекции это редукция
уровня флюоресценции и свето-зависимое развитие хлоротических-мозаичных
симптомов. В случае с инфицированием вирусом кустистой карликовости томатов
http://www.enu.kz
доказано такое же влияние на растения N.benthamiana и Tomato Money Maker, при
котором фотосинтез ингибируется и уровень вторичных метаболитов увеличивается.
Более того, в течение всего эксперимента измерялся уровень фотосинтеза в Nicotiana
Benthamiana при помощи портативного флуорометра FluorPen FP100 (Рис. 4), который
измеряет
уровень
флуоресценции
хлорофилла.
Измерение
фотосинтеза
и
фотографирование проводились каждые 3 дня после инокуляции, для того чтобы
определить на какой день влияние инфекции будет отчетливым, при отсутствии
симптомов (Рис. 5).
Рисунок 4 - Флуорометр FluorPen FP100
Рисунок 5 – Диаграмма средних значений уровня фотосинтеза, соответствующих на
определенные дни после инокуляции
По результатам определено, что в течение 14 дней значительных различий между
контрольными и инфицированными растениями в уровне фотосинтеза нет, а после 14 дпи.
резко снижается в инфицированных растениях, в то время как в контрольных растениях не
меняется в течение всего экспериментального периода.
Выводы. При воздействии вирусом кустистой карликовости томатов на Nicotiana
Benthamiana и Tomato Money Maker уровень фотосинтеза снижается на 14 день после
инокуляции, в связи с нарушениями функции хлоропластов.
Список использованной литературы:
1. Alma si A, Ekeґs M, Gaґborjaґnyi R (1996) Comparison of ultrastructural changes of
Nicotiana benthamiana infected with three different tobamoviruses. Acta Phytopath et Entomol
Hung 31:181–190.
2. Almaґsi A, Harsaґnyi A, Gaґborjaґnyi R (2001) Photosynthetic alterations of virus-infected
plants. Acta Phytopath et Entomol Hung 36:15–29 Photosynth Res (2006) 90:111–123 121123.
http://www.enu.kz
3. Alonso E, Garcэґa-Luque I, Avila-Rincoґn MJ, Wicke B, Serra MT, Dэґaz-Ruiz JR (1989) A
tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J Phytopathol 125:67–76.
4. Baker NR, Rosenqvist E (2004) Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop
production strategies: an examination of future possibilities. J Exp Bot 55:1607–1621.
5. Balachandran S, Osmond CB, Daley PF (1994) Diagnosis of the earliest strain-specific
interactions between tobacco mosaic virus and chloroplasts of tobacco leaves in vivo by means
of chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiol 104:1059–1065.
6. Balachandran S, Osmond CB (1994) Susceptibility of tobacco leaves to photoinhibition
following infection with two strains of tobacco mosaic virus under different light and nitrogen
nutrition regimes. Plant Physiol 104:1051–1057.
7. Balachandran S, Hull RJ, Martins RA, Vaadia Y, Lucas WJ (1997) Influence of
environmental stress on biomass partitioning in transgenic tobacco plants expressing the
movement protein of tobacco mosaic virus. Plant Physiol 114:475–481.
8. Ball SG, Morell MK (2003) From bacterial glycogen to starch:understanding the biogenesis
of the plant starch granule. Annu Rev Plant Biol 54:207–233.
9. Baroґn M, Rahoutei J, Laґzaro JJ, Garcэґa-Luque I (1995) PSII response to biotic and abiotic
stress. In: Mathis P (ed) Photosynthesis: from light to biosphere IV. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, pp 897–900.
10. Beck E, Ziegler P (1989) Biosynthesis and degradation of starch in higher plants. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol 40:95–117.
11. Berger S, Papadopoulos M, Schreiber U, Kaiser W, Roits T (2004) Complex regulation of
gene expression, photosynthesis and sugar levels by pathogen infection in tomato. Physiol Plant
122:419–428.
12. Bjorn LO, Forsberg AS (1979) Imaging by delayed light emission (phytoluminography) as a
method for detecting damage to the photosynthetic system. Physiol Plant 47:215–222.
13. Chaerle L, Van Der Straeten D (2001) Seeing is believing: imaging techniques to monitor
plant health. Biochim Biophys Acta 1519:153–166.
14. Chaerle L, Hagenbeek D, De Bruyne E, Valcke R, Van Der Straeten D (2004) Thermal and
chlorophyll-fluorescence imaging distinguish plant–pathogen interactions at an early stage. Plant
Cell Physiol 45:887–896.
15. Cheng NH, Su CL, Carter SA, Nelson RS (2000) Vascular invasion routes and systemic
accumulation patterns of tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Plant J 23:349–362.
16. Chou HM, Bundock N, Rolfe SA, Scholes JD (2000) Infection of A. thaliana leaves with
Albugo candida (white blister rust) causes a reprogramming of host metabolism. Mol Plant
Pathol 2:99–113.
17. Ciscato M (2000) Development of a fluorescence imaging system for the quality asessment
of fruit and vegetables. Limburg Universitair Centrum, Diepenbeek, Belgium Cohen J,
Loebenstein G (1974) An electron microscopy study of starch lesions in cucumber cotyledons
infected with tobacco mosaic virus. Phytopathology 65:32–39.
18. Critchley C, Russell AW (1994) Photoinhibition of photosynthesis in vivo: the role of
protein turnover in photosystem II. Physiol Plant 92:188–196.
19. Daley PF, Raschke K, Ball JT, Berry JA (1989) Topography of photosynthetic activity of
leaves obtained from video images of chlorophyll fluorescence. Plant Physiol 90:1233–1238.
20. del Rio LA, Pastori GM, Palma JM, Sandalio LM, Sevilla F, Corpas FJ, Jimenez A, LopezHuertas E, Hernandez JA (1998) The activated oxygen role of peroxisomes in senescence. Plant
Physiol 116:1195–1200.
21. Esau K, Cronshaw J (1967) Relation of tobacco mosaic virus to the host cells. J Cell Biol
33:665–678.
22. Esfeld P, Siebke K, Weis E (1995) Local defence-related shift in the carbon metabolism in
chickpea leaves induced by a fungal pathogen. In: Mathis P (ed) Photosynthesis: from light to
biosphere V. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 663–666.
http://www.enu.kz
23. Fenton MJ, Crofts RA (1990) Computer-aided fluorescеnce imaging of photosynthetic
systems: application of video imaging to the study of fluorescence induction in green plants and
photosynthetic bacteria. Photosynth Res 26:59–66.
24. Fryer MJ, Oxborough K, Mullineaux PM, Baker NR (2002) Imaging of photo-oxidative
stress responses in leaves. J Exp. Bot 53:1249–1254.
25. Genty B, Meyer S (1994) Quantitative mapping of leaf photosynthesis using chlorophyll
fluorescence imaging. Aust J Plant Physiol 22:277–289.
26. Goodman RN, Kiraґ ly Z, Woods RK (1986) Photosynthesis. In: Biochemistry and
physiology of plant disease. University of Missouri Press, Columbia, pp 46–74.
27. Havelda Z, Maule AJ (2000) Complex spatial responses to cucumber mosaic virus infection
in susceptible Cucurbita pepo cotyledons. Plant Cell 12:1975–1986.
28. Holmes FO (1931) Local lesions of mosaic in Nicotiana tabacum L. Contrib Boyce
Thompson Inst 3:163–172.
29. Horton P, Wentworth M, Ruban A (2005) Control of the light harvesting function of
chloroplast membranes: the LHCIIaggregation model for non-photochemical quenching. FEBS
Lett 579:4201–4206.
30. Hull R (2002) Matthew’s plant virology. Academic Press, San Diego Karpinski S, Gabrys
H, Mateo A, Karpinska B, Mullineaux PM (2003) Light perception in plant disease defence
signalling. Curr Opin Plant Biol 6:390–396.
31. Omarov, R., Sparks, K., Smith, L., Zindovic, J. & Scholthof, H. B. (2006) J. Virol. 80, 30003008.
32. Lawson T, Oxborough K, Morison JI, Baker NR (2002) Responses of photosynthetic
electron transport in stomatal guard cells and mesophyll cells in intact leaves to light, CO2, and
humidity. Plant Physiol 128:52–62.
33. Lehto K, Tikkanen M, Hiriart JB, Paakkarinen V, Aro EM (2003) Depletion of the
photosystem II core complex in mature tobacco leaves infected by the flavum strain of tobacco
mosaic virus. Mol Plant Microbe Interact 16:1135–1144