опыт использования метода rt-пцр для обнаружения вируса

УДК 616.36-002:616-036.22
ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА RT-ПЦР ДЛЯ
ОБНАРУЖ ЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А В ОБРАЗЦАХ ВОДЫ
Т.Н. Быстрова, К.В. Блохин, В.Н. Мазепа, Т.Г. Макарова
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии
им. академика И.Н. Блохиной
Приведены экспериментальные данные сравнительного изучения возможности использования методов RT-ПЦР и ИФА для обнаружения вируса гепатита А (ВГА). Первый по чувствительности оказался более чем в
1000 раз выше второго. В связи с этим для детекции ВГА методом RTПЦР может отпасть необходимость на предварительном этапе достижения высокой степени концентрирования вирионов в пробах воды, как
это требуется при использоваии ИФА.
Роль водного фактора при гепатите А (ГА) общепризнана. Однако, его значение окончательно не изучено и не получило должной оценки, что обусловлено
трудностью аргументации инфицирования воды в конкретной эпидситуации. В
связи с небольшой концентрацией вируса гепатита А (ВГА) в водных объектах
выявление возбудителя в этих условиях определяется двумя обстоятельствами:
применением адекватных методов предварительного концентрирования вируса и
последующей его индикации.
Разработанная в лаборатории вирусных гепатитов ННИИЭМ методика концентрирования ВГА из больших объёмов воды в сочетании с применением сконструированной нами ИФА тест-системы позволила охарактеризовать роль водного фактора в распространении ГА на территории крупного города европейской
зоны России, в том числе в условиях вспышечной заболеваемости. Двадцатипятилетний опыт использования ИФА для индикации антигена ВГА в концентратах
воды показал невысокую результативность обнаружения вируса при плановых
обследованиях водных объектов, что определяется недостаточной концентрирующей способностью разработанной методики при малом содержании вируса и
разрешающей возможностью ИФА.
В связи с вышеизложенным поиски альтернативных ИФА методов обнаружения ВГА в водных объектах являются весьма актуальными.
На первом этапе этой работы в эксперименте проведено сравнение чувствительности ИФА и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения
ВГА в воде.
Для эксперимента использовали ВГА (штамм HAS-15), полученный авторами
в культуре клеток почки эмбриона макаки-резус (FRhK-4). Клетки выращивали на
500 мл роллерах с использованием среды Игла-МЭМ с удвоенным содержанием
аминокислот и витаминов в присутствии 10%-ной сыворотки эмбриона коровы.
После формирования монослоя клетки инфицировали адаптированными к ним
ВГА. Еженедельно проводили смену среды Игла-МЭМ с 1%-ной сыворотки эмбриона коровы. Накопление вируса происходило без видимого цитопатогенного
эффекта с максимумом на 17–21 день. Определение ВГА в клеточном лизате про74
водили методом ИФА с экспериментальными сериями тест-систем собственного
производства.
В дальнейшем полученный вирус использовали в модельных опытах на определение ВГА в водных объектах. Детекцию его проводили параллельно двумя
методами: ИФА и RT-ПЦР. Исходный вирус определялся в ИФА в титре 1:8.
Для проведения RT-ПЦР применена двухкомпонентная диагностическая система производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ. Первый компонент
«Reverta-R» использовался при получении кДНК с HAV-РНК; второй компонент
«Амплисенс-200» — для амплификации методом ПЦР участка генома HAV размером 430 нуклеотидов.
На всех этапах работы во избежание контаминации применялась только одноразовая пластиковая посуда. Материал отбирался в 1.5 мл микропробирки типа
Эппендорф.
После завершения ПЦР продукт амплификации выявлялся методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Гели просматривались в УФ-трансиллюминаторе (длина волны 265 нм) и снимались с помощью видеосистемы Biotest.
В положительных (содержащих HAV) пробах на геле обнаруживалась специфическая полоса, соответствующая амплифицированному фрагменту ДНК размером 430 пар нуклеотидов. В отрицательных пробах специфические полосы не выявлялись. Случаев обнаружения специфических полос в отрицательных контролях и отсутствия их в положительных контролях не было. Вирус выявлялся в разведениях исходного культурального вируса 1⋅103–5⋅103.
Таким образом, чувствительность метода RT-ПЦР оказалась более чем в 1000
раз выше по сравнению с ИФА. В использованной модельной системе возможно
снижение чувствительности RT-ПЦР за счёт РНК-аз, присутствующих в препарате не очищенного от клеточного субстрата культурального вируса. При работе с
водными образцами или очищенным препаратом вируса может быть достигнута
большая чувствительность. В связи с этим, для детекции ВГА методом RT-ПЦР
отпадает необходимость на предварительном этапе достижения высокой степени
концентрирования вирусных частиц в пробах воды, как это требуется при использовании ИФА. Полученные результаты являются основой для изучения возможности использования метода RT-ПЦР в эпиднадзоре за гепатитом А.
75