Хроматография Теория - Российский государственный
advertisement
Министерство образования Российской Федерации РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НЕФТИ И ГАЗА им. И.М. ГУБКИНА ЗАВОРОТНЫЙ В.Л., КАЛАЧЕВА Н.А., ЗАЙЦЕВ Н.К. УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ по курсу «АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ» (Хроматография) (для студентов факультета химической технологии и экологии) МОСКВА 2005 2 Введение Хроматография — наиболее часто используемый аналитический метод. Новейшими хроматографическими методами можно определять газообразные, жидкие и твердые вещества с молекулярной массой от единиц до 10 6. Это могут быть изотопы водорода, ионы металлов, синтетические полимеры, белки и др. С помощью хроматографии получена обширная информация о строении и свойствах органических соединений многих классов. Применение хроматографических методов для разделения белков оказало огромное влияние на развитие современной биохимии. Хроматографию с успехом применяют в исследовательских и клинических целях в самых разных областях биологии и медицины, в фармацевтике и криминалистике: дня терапевтического мониторинга в связи с ростом нелегального употребления наркотиков, идентификации антибиотиков и отнесения их к той или иной группе антибактериальных препаратов, для определения наиболее важных классов пестицидов и для мониторинга окружающей среды. Такие достоинства как универсальность, экспрессность и чувствительность делают хроматографию важнейшим аналитическим методом. Более десяти работ (1957—1980), выполненных с применением хроматографических методов, были удостоены Нобелевских премий; среди авторов методических работ, удостоенных премий, А. Тизелиус (1948), А. Мартин и Р. Синдж (1956). В 1904-1906 гг русский ученый ботаник М.С. Цвет после множества экспериментов разделил сложную смесь растительных пигментов из листьев растений при пропускании ее петролейно-эфирного раствора через вертикальную стеклянную колонку, заполненную порошкообразным наполнителем (углекислым кальцием). При этом возник ряд окрашенных зон, по числу которых можно было судить о сложности состава анализируемой смеси. Полученная разноцветная полоса была названа М.С. Цветом хроматограммой (хромо - по гречески цвет). Пропуская через колонку различные растворители (полярные, неполярные), оказалось возможным регулировать степень распределения зон по длине колонки: сдвигать или раздвигать их, тем самым, способствуя повышению точности последующего качественного или количественного определения. Стремление расширить возможности хроматографического метода, добиться большей эффективности разделения привело английских биохимиков Мартина и Синжа в 1941 году к созданию распределительного варианта хроматографии, получившего название жидкость-жидкостной хроматографии. В отличие от применявшихся ранее адсорбционных хроматографических колонок, разделение на которых обусловливалось различием адсорбции компонентов жидкой фазы на твердом адсорбенте, Мартин и Синж описали новый тип хроматографических колонок, заполняемых силикагелем, смоченным водой. Силикагель здесь играет роль лишь носителя, а разделение связано с различным распределением анализируемых соединений между двумя жидкими фазами: водой, неподвижно закрепленной на силикагеле, и растворителем, не смешивающимся с водой. 3 Создателям нового варианта хроматографического разделения уже тогда было ясно, что в качестве подвижной фазы можно использовать не только жидкость, но также пар или газ. Выполненная Джеймсом и Мартином 10 лет спустя обстоятельная проверка этой идеи дала блестящие результаты. Начиная с 1955 г промышленность нашей страны приступает к выпуску специальных приборов - газовых хроматографов, предназначенных для разделения сложных многокомпонентных смесей в газожидкостном и газоадсорбционном вариантах. Хроматографическая техника все более дифференциируется в зависимости от специальных требований, вытекающих из характера поставленных задач. Причина успеха хроматографического метода обусловлена возможностью разделения с его помощью сложных смесей, анализ которых обычными методами затруднителен, например, смесей углеводородов, аминокислот, ионов редкоземельных элементов. 4 Сущность метода Газовая хроматография (ГХ) — процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов между двумя фазами —подвижной и неподвижной. Неподвижной фазой обычно служит твердое вещество (его часто называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Неподвижную фазу обычно помещают в стеклянную (или металлическую) трубку, называемую колонкой. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу. Сущность метода ГХ состоит в следующем. Анализируемая смесь (обычно — раствор) летучих компонентов переводится в парообразное состояние и смешивается с потоком инертного газа-носителя, образуя с ним подвижную фазу — ПФ. Эта смесь проталкивается далее новой порцией непрерывно подаваемого газа-носителя и попадает в хроматографическую колонку, заполненную неподвижной (стационарной) твердой или жидкой фазой — НФ. Разделяемые компоненты распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их коэффициентами распределения К, определяемыми формулой: с( НФ ) К с( ПФ ) где с(НФ)и с(ПФ) — соответственно содержание (в г/мл) данного компонента в неподвижной и подвижной фазах, находящихся в динамическом равновесии. Равновесный обмен хроматографируемого вещества между НФ и ПФ осуществляется в результате многократного повторения актов сорбция-десорбция по мере движения ПФ вдоль НФ внутри хроматографической колонки. Поток газа-носителя увлекает с собой разделяемую парообразную смесь вдоль хроматографической колонки, так что процессы сорбция-десорбция разделяемых компонентов повторяется многократно, причем каждый раз в системе устанавливается динамическое равновесие разделяемых веществ между ПФ и НФ. Эти многократные переходы разделяемых веществ из ПФ в НФ и обратно совершаются по всей длине хроматографической колонки до тех пор, пока пары разделяемых веществ не покинут колонку вместе с газом-носителем. Поскольку сродство различных разделяемых веществ к НФ различно, то в процессе сорбционных—десорбционных переходов компоненты перемещаются вдоль колонки с разной скоростью Чем больше коэффициент распределения вещества, тем дольше оно находится в НФ, тем позже покидает хроматографическую колонку. В конце концов из хроматографической колонки вместе с газом-носителем выходят зоны (объемы) парообразных хроматографируемых веществ, разделенных полностью или частично. Если для двух компонентов смеси коэффициенты распределения одинаковы, то они не разделяются. Если же их коэффициенты распределения 5 различны, то разделение происходит, причем первым покидает колонку тот компонент, у которого коэффициент распределения наименьший. Пары разделенных компонентов вместе с газом-носителем поступают в детектор хроматографа, генерирующий электрический сигнал — тем больший, чем выше концентрация компонента в парогазовой смеси. Электрический сигнал усиливается и фиксируется регистратором хроматографа в виде хроматогратмы, записываемой на диаграммной ленте или на мониторе компьютера (если таковым снабжен хроматограф). Эти хроматограммы и используются для качественной и количественной обработки результатов анализа разделяемой смеси компонентов. Хроматография — гибридный аналитический метод, сочетающей разделение и определение. Метод позволяет разделять многокомпонентную смесь, идентифицировать компоненты и определять ее количественный состав. Поэтому детектирование сигнала (а также запись и обработка его) занимает важное место. В отличие от ряда других методов, основанных на распределении компонентов между фазами, хроматография — это динамический метод, обеспечивающий многократность актов сорбции—десорбции разделяемых компонентов, так как разделение происходит в потоке подвижной фазы. Этим обусловлена большая эффективность хроматографического метода по сравнению с методами сорбции и экстракции в статических условиях, поэтому хроматографическими методами возможно быстрое разделение сложных смесей, например аминокислот или редкоземельных элементов. Классификация методов хроматографии В основу общепринятых классификаций многочисленных хроматографических методов положены следующие признаки: агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз, механизм взаимодействия сорбент—сорбат, способ получения хроматограмм, техника выполнения (форма слоя сорбента), цель хроматографирования. По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую и жидкостную. Газовая хроматография включает газожидкостную и газотвердофазную, жидкостная — жидкостно-жидкостную, жидкостнотвердофазвую и жидкостно-гелевую. Первое слово в названии метода характеризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе — неподвижной. По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматографии: распределительная хроматография основана на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газожидкостная хроматография) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах; ионообменная хроматография — на разной способности веществ к ионному обмену; 6 адсорбционная хроматография — на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом; эксклюзионная хроматография — на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ, аффинная хроматография — на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов. Существуют пары веществ, реагирующих в растворах с высокой избирательностью, например антитело и антиген, фермент и его субстрат или ингибитор, гормон и соответствующий рецептор, и т. п. Если одно из соединений пары удерживается ковалентной связью на носителе, то последний можно использовать для избирательного извлечения второго соединения пары. Этим видами не исчерпываются все механизмы разделения, например, существует осадочная хроматография, основанная на образовании отличающихся на растворимости осадков разделяемых веществ с сорбентом, адсорбционно-комплексообразовательная, основанная на образовании координационных соединений разной устойчивости в фазе или на поверхности сорбента, и др. Следует помнить, что классификация по механизму весьма условна: ее используют в том случае, если известен доминирующий механизм; часто процесс разделения протекает сразу по нескольким механизмам. По способу получения хроматоргамм элюентный и вытеснительный способ (рис.1). различают фронтальный, Рис. 1. Внутренние и внешние хроматограммы, полученные методом элюентной (а), вытеснительной (б) и фронтальной (в) хроматографии (сорбируемость веществ увеличивается в ряду А <В< С) Фронтальный способ наиболее прост по выполнению. Через хроматографическую колонку с сорбентом непрерывным потоком пропускают раствор исследуемого вещества или газовую смесь. Если компоненты различаются по сорбируемости, то соответственно этому они располагаются в колонке. Однако 7 они разделяются не полностью. В чистом виде может быть выделен лишь первый, наиболее слабо сорбирующийся компонент, который движется вдоль слоя сорбента впереди остальных. За зоной первого компонента следует в непосредственном контакте зона, содержащая первый и второй компоненты. Третья зона содержит смесь первого, второго, третьего и т.д. компонентов. В некоторый момент времени сорбент насытится и наступит «проскок», т. е. из колонки начнет выходить первый, наиболее слабо сорбирующийся компонент. Если пропускать жидкость или газ, выходящие из колонки, через детектор концентраций и наносить показания его в течение всего опыта на график, то полученная выходная кривая будет иметь форму ступенчатой кривой. Число ступеней равно числу разделяемых компонентов смеси. Несмотря на простоту способ не нашел широкого применения в анализе, так как не дает полного разделения. Однако он становится весьма эффективным для препаративного выделения чистого вещества из технического продукта при условии, конечно, когда это вещество удерживается в колонке слабее всех других компонентов продукта. Типичные примеры фронтального способа: очистка воды пермутитами и другими ионообменными адсорбентами; очистка воздуха активированными углями от отравляющих веществ в противогазах и вентиляционных фильтрах химических предприятий. С точки зрения химикааналитика метод пригоден для предварительного качественного анализа неизвестной смеси и, особенно для определения числа входящих в ее состав компонентов, что, например, делал Цвет при предварительном исследовании состава хлорофилловых пигментов. Возможность применения фронтального способа для определения количественного состава, как уже говорилось, ограничивается из-за неполноты разделения. Правда, шведский ученый Классон, разработавший теорию способа, предложил ряд формул для расчета количественного состава сложной смеси; однако практическое применение этих формул затрудняется необходимостью точного предварительного определения объемов удерживания и изотермы адсорбции отдельных компонентов. Необходимо также отметить, что этот способ может быть эффективен лишь в случае выпуклой формы изотермы адсорбции компонентов исследуемой смеси, так как лишь тогда получаются четкие крутые ступени на выходной кривой. Из этого следует, что для осуществления фронтального способа наиболее подходящими должны быть высокоактивные адсорбенты, например, березовый уголь, силикагель. Элюентный (проявитнльный) способ выгодно отличается от фронтального тем, что он позволяет полностью разделить многокомпонентную смесь. В отличие от фронтального способа исследуемую смесь вводят в колонку в виде порции раствора или газа, а не непрерывно, как при фронтальном способе. После введения такой порции колонку промывают растворителем или газом-носителем (проявляют). На выходе из колонки детектор фиксирует непрерывно концентрацию, а связанный с ним регистрирующий прибор записывает выходную кривую в виде ряда пиков, число которых соответствует числу разделенных компонентов. 8 Элюентный способ получил наиболее широкое применение не только с аналитической, но и с препаративной целью. Это объясняется тем, что при правильном выборе условий разделения (сорбента, температуры колонки, скорости потока проявителя, количества исследуемой смеси, вводимой в колонку, и др.) из колонки компоненты смеси выходят практически в чистом виде, и их можно уловить для исследования другими методами, а качественный и количественный состав можно определить простым измерением объемов удеживания и площадей пиков. Вытеснительный способ отличается от фронтального и элюентного тем, что после введения пробы исследуемой смеси колонку промывают растворителем или газом-носителем, к которым добавлены растворимое вещество или вещество в газообразном (парообразном) состоянии. Это вещество должно адсорбироваться сильнее любого из компонентов разделяемой смеси и называется вытеснителем, так как оно, обладая наибольшей адсорбируемостью, вытесняет более слабо адсорбирующиеся компоненты. Благодаря эффекту адсорбционного вытеснения, открытому Цветом, происходит вытеснение компонентов из адсорбента в последовательности, соответствующей их адсорбируемости, и компоненты полностью разделяются: при этом зоны компонентов движутся по слою адсорбента с одинаковой скоростью, соприкасаясь между собой, по направлению к выходу из колонки. К моменту полного насыщения адсорбента вытеснителем детектор запишет ступенчатую выходную кривую, отличающуюся от фронтальной кривой тем, что каждая ступень соответствует чистому компоненту. Высота ступени характеризует данный компонент с качественной стороны, а длина ступени пропорциональна количественному содержанию данного компонента в исследуемой смеси. Обязательным условием для хорошего разделения в противоположность элюентному способу является резко выраженная выпуклая форма изотерм адсорбции разделяемых компонентов и вытеснителя. А это условие выполнимо лишь в случае применения высокоактивных адсорбентов: активированных углей березового БАУ, каменноугольного антрацита АГ-2. норита и др. Трудность выбора концентрации вытеснителя в проявителе, взаимная диффузия на границе зон, препятствующая получению на выходе из колонки достаточно чистых компонентов разделяемой смеси, а также длительность процесса разделения затрудняют пользование этим способом в аналитических целях. Поэтому он не получил применения в анализе. Однако для препаративных целей способ не потерял значения, так как возможность использования таких высокоактивных и доступных адсорбентов, как активированные угли, позволяет достигать высокой производительности. Достоинством способа является также то, что зоны не размываются, как это наблюдается при элюентном способе. По технике выполнения выделяют колоночную хроматографию, когда разделение проводится в специальных колонках, и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится на специальной бумаге (бумажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография). 9 По цели хроматографирования выделяют аналитическую хроматографию (качественный и количественный анализ); препаративную хроматографию (для получения веществ в чистом виде, для концентрирования и выделения микропримесей); промышленную (производственную) хроматографию для автоматического управления процессом (при этом целевой продукт из колонки поступает в датчик). Хроматографию широко используют для исследования растворов, каталитических процессов, кинетики химических процессов и т. п. Понятие о теории метода Параметры хроматографического пика. Хроматограмма — это зарегистрированная во времени последовательность показаний регистратора. Каждому разделенному компоненту смеси соответствует свой пик на хроматограмме. По оси абсцисс откладывается время (или расстояние), по оси ординат — величина аналитического сигнала, которая тем больше, чем выше содержание данного компонента в разделяемой смеси. На рис. 2 схематически показан общий вид хроматограммы в случае разделения трехкомпонентной смеси, состоящей из компонента 1 и компонента 2, сорбируемых в колонке, и компонента, не сорбируемого в колонке. Каждому из трех компонентов на хроматограмме отвечает свой пик. В данном случае по оси абсцисс отложено время. Вертикальной стрелкой отмечен момент ввода пробы, от которого отсчитывается время . Величина 1 — время удерживания компонента 1, величина 2 — время удерживания компонента 2, величина о — время выхода несорбируемого компонента. В данном случае оба компонента 1 и 2 разделяются полностью, поэтому их пики на хроматограмме не накладываются друг на друга. Время удерживания — качественная характеристика каждого компонента; измеряется от момента ввода пробы до момента выхода максимума (вершины) пика. Оно зависит от природы хроматографируемого вещества и газа-носителя, скорости прохождения ПФ через хроматографическую колонку, от природы и массы НФ, температуры, длины колонки. Чем выше коэффициент распределения хроматографируемого вещества, тем больше и его время удерживания. Время выхода о несорбируемого компонента (например, растворителя) определяется соотношением =L/, где L — длина хроматографической колонки, v — линейная скорость движения потока газа-носителя. Исправленное время удерживания 1, 2 соответственно компонентов 1 и 2, равное 1= 1 - 0, 2 = 2 - 0, — это время, в течение которого данный компонент находится в НФ. Исправленное время удерживания пропорционально коэффициенту распределения данного компонента разделяемой смеси. аналитический сигнал 10 2 а0,882 а0,607 1 а(2)0,5 h2 Ввод пробы h1 о 1 а2 Время 2 Рис. 2. Схематическое изображение хроматограммы в случае разделения трехкомпонентной смеси: о — время выхода несорбируемого компонента; 1 — время удерживания компонента 1; 2 — время удерживания компонента 2; а(1) и a(2) — ширина пиков компонентов 1 и 2; а(1)½ и a(2)½ — полуширина пиков компонентов 1 и 2: — разделение пиков Относительное время удерживания r и относительное исправленное время удерживания r определяется формулами 0 , r , s s 0 где — время удерживания данного вещества, s, — время удерживания стандартного вещества (стандарта), 0 — время выхода несорбируемого компонента при хроматографировании веществ в одних и тех же условиях. Относительное время удерживания меньше зависит от внешних условий, чем время удерживания. r На рис. 2 указаны также ширина пиков а(1) и а(2) у их основания и полуширина пиков a(1)½ и a(2)½, т.е. ширина пиков на середине их высоты. На практике часто измеряют не время удерживания, а расстояние удерживания l, пропорциональное времени удерживания, т.е. расстояние (например, в мм) на хроматограмме от точки, соответствующей моменту ввода пробы, до абсциссы, отвечающей положению максимума (вершины) пика. Кроме времени удерживания иногда используют такой параметр, как 11 объем удерживания (удерживаемый объем), равный объему ПФ, который выносит из колонки все данное вещество. Объем удерживания V зависит от скорости движения ПФ и равен произведению времени удерживания на эту скорость: V = При постоянных условиях хроматографирования (скорость потока, давление, температура, состав фаз) значения времени удерживания и удерживаемого объема V строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации веществ. Коэффициент удерживания (замедления) R — это отношение скорости перемещения w данного компонента вдоль хроматографической колонки к скорости движения потока газа-носителя: R = w/v Поскольку w =L / и = L/ 0, где L,—длина колонки, — время удерживания данного компонента, 0 — время выхода несорбируемого компонента, то R = 0 / Коэффициент емкости k равен отношению исправленного времени удерживания ' = -0 данного компонента к 0: k = ( - 0) /0 Чем выше А, тем большее время находится в НФ данный компонент. Влияние регулируемых факторов на показатели хроматографического анализа. К числу регулируемых факторов можно отнести: 1. размер и однородность частиц сорбента; 2. длину колонки; 3. скорость газа-носителя; 4. температуру колонки; 5. объем вводимой пробы. 1. Увеличение диаметра зерен приводит к увеличению размывания пика. Поэтому следует работать с сорбентом, имеющим минимальную крупность и максимальную однородность по крупности. Чаще всего используют фракции носителя с диаметром зерен 0,15-0,20 и 0,20-0,30 мм. 2. С увеличением длины колонок улучшается разделение. Так, увеличивая длину колонки с 1 м до 4м. можно увеличить критерий разделения в два раза, увеличение же длины от 3 до 4м дает весьма малый выигрыш в разделении. Предел удлинения колонки достигается очень быстро. При использовании носителя с зернением 0,15-0,20 мм колонки длиной выше 5 м при оптимальной скорости газа-носителя имеют на выходе давление 2,5-3,5105 Па, что препятствует вводу пробы шприцем. 3. Значительное уменьшение скорости газа-носителя может привести к снижению критерия разделения, а увеличение скорости лишь немного 12 уменьшает его значение. 4. Температуру анализа следует подбирать экспериментально; увеличение ее приводит к уменьшению допустимого объема пробы и, соответственно, ширины пика на хроматограмме. 5. Размер введенной пробы должен отвечать двум требованиям, противоречащим друг другу: - проба должна быть настолько малой, чтобы не ухудшалось разделение компонентов; - проба должна быть настолько большой, чтобы при заданных условиях хроматографирования и детектирования количество определяемого вещества можно было измерить. В условиях, обеспечивающих линейную изотерму сорбции (распределения), размывание хроматографической зоны вещества в колонке подчиняется нормальному (гауссову) распределению независимых величин. При этом на хроматоргамме регистрируются симметричные (относительно точки с максимальной концентрацией) пики колоколообразной формы, называемые часто гауссовыми. Кривая Гаусса описывается уравнением, связывающим площадь пика и ширину его на различных сечениях высоты: 2 S y e 1 / 2( x / ) 2 где y - высота точки на кривой (ордината), измеренная на расстоянии х; S - площадь пика; стандартное отклонение или дисперсия гауссова хроматографического пика. Стандартное отклонение отвечает ширине пика в точке, расположенной на расстоянии 0,882h основания а0,882, и может быть определено также из соотношений, справедливых для гауссовых пиков: 2 = а0,607; 3 = а0,324; 4 = а0,134 В количественном хроматографическом анализе следует стремиться к получению хроматограмм с гауссовыми пиками. Измерение асимметричных пиков, как правило, проводится с меньшей точностью. Рис. 3. К определению фактора асимметричности хроматографического пика 13 Для определения принадлежности формы хроматографического пика к гауссовой удобно использовать отнесение ширины пика при основании к полуширине пика. Для истинно гауссовых пиков должно соблюдаться равенство: а = 1,698 а0,5 В условиях реальной газовой хроматоргафии в первом приближении можно считать пик симметричным (гауссовым), если величина а / а0,5 находится в пределах 1,67-1,73. Параметры разделения. Эффективность колонки. К параметрам разделения двух веществ относятся степень и коэффициент разделения. Эффективность хроматографической колонки характеризуется числом теоретических тарелок и величиной, эквивалентной теоретической тарелке. Степень разделения Rs (разрешение пиков) количественно характеризует разделение двух пиков на хроматограмме и рассчитывается по формуле: Rs 2Δ Δτ a(1) a(2) a(1)1/2 a(2)1/2 где = 2 - 1 — разность времен удерживания разделяемых компонентов 1 и 2; a(1) и a(2) — ширина пиков; a(1)½ и a(2)½ — полуширина пиков. Если Rs < 1, то разделение двух веществ неполное. При Rs > 1 наблюдается полное разделение двух компонентов смеси (рис. 4). Разделение пиков прямо пропорционально длине L хроматографической колонки, тогда как сумма полуширин пиков прямо пропорциональна корню квадратному из длины L колонки: [a(1)1 2 a(2)1 2 ] L , Рис. 4. Разделение Δτ пиков на хроматограмме при различных значениях Rs (схема) поэтому с ростом длины колонки L степень разделения R увеличивается; однако одновременно возрастает и продолжительность анализа. Степень разделения в ГХ зависит от таких хроматографических параметров, как коэффициент разделения и число теоретических тарелок п. Коэффициент разделения рассчитывается по формуле τ τ0 K 2 2 τ1 τ 0 K1 14 где 1 и 2— соответственно время удерживания компонентов 1 и 2; 0 — время выхода несорбируемого компонента; К1 и К2— коэффициенты распределения компонентов-1 и 2 соответственно. Коэффициент разделения характеризует селективность НФ по отношению к двум данным компонентам и относительное расположение разделяемых пиков на хроматограмме. Коэффициент разделения и степень разделения Rs связаны соотношением: 1 n1 2 Rs 4 где п — так называемое число теоретических тарелок. Если = 1, то Rs = 0, т.е. два хроматографируемые вещества не разделяются. Чем больше величина , тем лучше разделение пиков на хроматограмме, тем НФ более селективна по отношению к двум данным разделяемым веществам. Число теоретических тарелок п. При хроматографическом разделении компонентов смеси осуществляется перенос вещества через границу раздела двух фаз — ПФ и НФ. Чем больше число таких переходов, тем более полно разделяются компоненты смеси. Количество подобных переходов характеризует эффективность хроматографической колонки. Участок зоны внутри колонки, на котором устанавливается равновесное распределение данного вещества между ПФ и НФ (сорбция - десорбция), называют теоретической тарелкой (по аналогии с терминологией, принятой в теории ректификации для ректификационных колонок, в которых осуществляются многократно повторяющиеся акты испарение — конденсация). Разделяемое вещество как бы распределяется по этим тарелкам. Число теоретических тарелок п рассчитывается по формуле: 2 τ n 5,545 a1 2 где — время (или расстояние) удерживания данного компонента смеси, а½ — полуширина пика, выраженная в тех же единицах, что и . Чем больше число теоретических тарелок п, тем эффективнее работа хроматографической колонки. Число теоретических тарелок может составлять от нескольких сотен до нескольких тысяч. Если длина хроматографической колонки составляет L, а число теоретических тарелок равно п, то величина H, рассчитываемая по формуле H=L /n называется высота, эквивалентная теоретической тарелке — ВЭТТ. Чем меньше величина ВЭТТ, тем менее размыта зона (полоса) отделяемого компонента при его выходе из колонки. Как уже отмечалось ранее, параметры Н и п характеризуют эффективность хроматографической колонки при разделении компонентов 15 смеси. Чем больше п и меньше Н, тем полнее отделение зоны (полосы) данного компонента от зон остальных компонентов при их разделении. Величина ВЭТТ в оптимальном случае часто не превышает ~1,5 мм, хотя может быть и несколько большей. Разработаны теоретические подходы, позволяющие в определенной мере наметить пути достижения максимальной эффективности ГХ-разделения — уменьшить степень размывания зоны разделяемого компонента. При этом учитывается роль вихревой и молекулярной диффузии, сопротивление системы массопереносу веществ и другие факторы. На основе разработанных подходов для определенных условий можно рассчитать величину ВЭТТ по уравнению Ван-Деемтера: ВЭТТ = Н =А + В/ + С где А, В, С—коэффициенты, учитывающие соответственно вклад вихревой диффузии, молекулярной диффузии и сопротивления массопереносу в размывание зоны хроматографируемого компонента; v — линейная скорость потока газа-носителя. Уравнение Ван-Деемтера характеризует зависимость эффективности хроматографического процесса от скорости потока газа-носителя. Влияние температуры на разделение компонентов смеси. Температура очень сильно влияет на процессы хроматографического разделения. С ростом температуры увеличивается средняя скорость движения молекул в парогазовой ПФ, в результате чего уменьшается разность скоростей между «убегающими» и «отстающими» частицами одного и того же компонента. Зоны разделяемых веществ (пики на хроматограммах) становятся более узкими, менее размытыми. В целом эффективность процесса разделения возрастает. Правда, с ростом температуры несколько снижается селективность хроматографической колонки. При сравнительно низких температурах (до ~200—250°С) разделяют и определяют относительно легколетучие вещества: некоторые углеводороды, спирты, эфирные масла. При более высоких температурах (~250—400°С) разделяют и определяют фенолы, высокомолекулярные спирты, жирные кислоты. Иногда процессы разделения проводят с программированием температуры, постепенно повышая температуру хроматографической колонки. При этом вначале отделяются более летучие, а затем — менее летучие компоненты смеси. Практика метода Метод ГХ используют для разделения и определения летучих (испаряющихся при сравнительно невысоких температурах) веществ либо таких соединений, которые в результате тех или иных превращений могут быть переведены в летучие продукты. Устройство хроматографа Хроматографирование проводят на газовых (газожидкостных) хроматографах различной конструкции. На рис. 5 показана принципиальная блок-схема газового хроматографа. 16 Газ-носитель (азот, гелий, аргон, водород) из баллона 1 через редуктор поступает под некоторым давлением в блок подготовки газов 2, с помощью которого измеряются давление и скорость потока газа-носителя. В испаритель 3, температура которого поддерживается достаточной для быстрого испарения смеси, с помощью микрошприца вводится анализируемая проба, которая испаряется и потоком газа-носителя увлекается в хроматографическую колонку 5, находящуюся в термостате 4, температура которого обычно несколько ниже, чем температура испарителя. После разделения смеси на зоны компонентов последние поступают в детектор 6, в котором генерируется электрический сигнал (тем больший, чем выше масса хроматографируемого компонента), усиливаемый усилителем 7 и преобразуемый регистратором 8 в виде записи хроматограммы на бумаге самописца. Рис. 5. Принципиальная блок-схема газового хроматографа: 1 — баллон с газом-носителем, 2 — блок подготовки газов, 3 — испаритель, 4 — термостат, 5 — хроматографическая колонка, 6 — детектор, 7 — усилитель, 8 — регистратор Анализируемая проба вводится в испаритель с помощью микрошприца, иглой которого прокалывается мембрана из термостойкой резины. В некоторых хроматографах предусмотрены дозаторы для ввода пробы. Объем вводимой пробы зависит от специфики используемой методики и для жидких проб составляет 0,1—1 мкл, для газообразных — 0,5—5 мл. При большем объеме пробы обычно понижается эффективность хроматографической колонки. Газохроматографические колонки представляют собой металлические или стеклянные трубки (прямые, изогнутые, спиральные) с внутренним диаметром 0,1—5 мм и длиной до нескольких метров. Они бывают двух типов — наполненные (насадочные) и капиллярные. Наполненные колонки — металлические (часто — из нержавеющей стали) или стеклянные трубки длиной 1—5 м, с внутренним диаметром 1,5—5 мм, обычно изогнутые в виде спирали. Эти трубки заполняются насадкой — частицами твердой основы с нанесенным на их поверхность тонким слоем жидкой НФ. Капиллярные колонки обычно представляют собой стеклянные (из кварцевого стекла) трубки, внутренняя поверхность которых покрыта тонким слоем жидкой НФ. Роль твердого носителя здесь играет внутренняя поверхность самой колонки. Длина капиллярных колонок может составлять от нескольких десятков до нескольких сотен метров, внутренний диаметр —от 0,1 до 0,6 мм. Капиллярные колонки обеспечивают более высокую эффективность разделения 17 многокомпонентных смесей. Твердый носитель должен обладать высокой механической прочностью, химической инертностью, малой адсорбционной активностью. Растворение хроматографируемого вещества в жидкой НФ, покрывающей поверхность твердого носителя, не должно осложняться его адсорбцией на носителе. Оптимальный размер зерен носителя чаще всего колеблется в пределах 0,1—0,5 мм, его удельная поверхность может составлять 100—1000 м2/г. В качестве материалов для твердого носителя используют оксид кремния (в форме диатомита, кизельгура — это сферохромы, хроматоны, хезосорбы, целиты), оксид алюминия, фторуглероды (тефлон, полихром), полистирол, сополимеры стирола и дивинилбензола (полисорбы), а также стеклянные шарики, плавленый кварц, песок, графитированную сажу (карбохром), кристаллы хлорида натрия и т.д. Жидкая НФ представляет собой обычно нелетучую, высококипящую, с низкой вязкостью жидкость различной полярности и химической природы — углеводороды (индивидуальные или смеси) с числом углеродных атомов в цепи от 10 до 30, полисилоксаны (силиконы), полигликоли (например, полиэтиленгликольадипинат), полиэфиры, амиды, амины, жирные кислоты и др. Предложены многие десятки и даже сотни вариантов жидких ПФ. Масса жидкой НФ обычно составляет от 1 до 20% от массы твердого носителя (чаще всего —от 5 до 10%). НФ наносится на поверхность твердого носителя из раствора в соответствующем растворителе при упаривании растворителя. Так, например, для нанесения полиэтиленгликольадипината, применяемого в качестве жидкой НФ, на твердые носители хромосорб, целит, хроматон с размером частиц 0,15—0,25 мм растворяют полиэтиленгликольадипинат (в количестве ~15% от массы твердого носителя) в ацетоне и прибавляют в раствор частицы твердого носителя. Выпаривают смесь на водяной бане, массу полученного носителя с НФ сушат при ~80—100 °С для удаления следов растворителя (до исчезновения запаха ацетона), после чего она готова в качестве насадки для хроматографической колонки. После заполнения новой колонки приготовленным сорбентом колонки кондиционируют нагреванием в течение нескольких часов в потоке газаносителя при температуре, превышающей на -10—30 °С рабочую температуру колонки. Температура термостата колонки не должна превышать температурный предел использования данной НФ. Детекторы Хроматографический детектор представляет собой устройство, предназначенное для обнаружения и количественного определения выходящих из колонки в потоке газа-носителя компонентов анализируемой смеси. Регистрация вещества осуществляется за счет преобразования в электрический сигнал изменений химических, физических или физико-химических свойств газового потока, выходящего из хроматографической колонки. Основными характеристиками детекторов являются: 18 Сигнал детектора - чувствительность, которая связывает сигнал детектора с измеряемой концентрацией и в значительной мере определяет аналитические возможности хроматографа в целом (детекторы средней чувствительности по теплопроводности и по плотности). - предел детектирования - минимальный сигнал, доступный измерению. - линейность - под линейностью детектирующего устройства понимают пропорциональность между концентрацией анализируемого вещества в потоке газа-носителя на выходе из колонки и сигналом детектора (рис. 6). Диапазон линейности концентрация вещества Рис. 6. Зависимость сигнала детектора от концентрации анализируемого вещества - быстродействие (или инерционность) - характеризует способность детектора реагировать на быстрое изменение концентрации вещества в потоке газа-носителя, проходящего через детектор. Относительно большая инерционность катарометра определяется скоростью процесса теплопередачи, которая значительно меньше скорости образования и сбора зарядов в ионизационных детекторах. - селективность - избирательная регистрация определенного класса или группы веществ. В газовых хроматографах используют детекторы различных типов: неселективные — термокондуктометрические (детекторы по теплопроводности) — катарометры, пламенно-ионизационные, электрохимические (электрокондуктометрические); селективные — термоионные, электронозахватные, пламенно-фотометрические и некоторые другие. В неселективных детекторах генерируемый сигнал не зависит от химической природы разделяемых компонентов, в селективных — зависит. На практике часто используют неселективные детекторы — катарометры и пламенно-ионизационные. В катарометре имеются две отделенные друг от друга одинаковые вольфрамовые или платиновые нити, через которые пропускается электрический ток. Одна нить находится в потоке чистого газа-носителя, вторая — в потоке ПФ, выходящем из хроматографической колонки. Если состав обоих газовых потоков неодинаков (поток ПФ кроме газа-носителя содержит отделенный компонент разделяемой смеси), то нити охлаждаются газовыми потоками поразному, их электрическое сопротивление, зависящее от температуры, становится различным, причем это различие пропорционально содержанию компонента анализируемой смеси. Возникшая разность потенциалов усиливается и фиксируется на ленте самописца регистратора в виде 19 хроматограммы. Чувствительность детектора по теплопроводности (катарометра) зависит от природы газа-носителя: для азота, аргона, диоксида углерода она составляет около 10-5 г определяемого вещества, для водорода и гелия — около 10-6—10-7 г. Пламенно-ионизационные детекторы более чувствительны, чем детекторы по теплопроводности. Принцип их действия состоит в следующем. ПФ после разделения компонентов смеси поступает из хроматографической колонки в пламя водородной лампы, находящееся между электродами. Органические вещества ПФ сгорают в пламени с образованием ионизированных продуктов, вследствие чего возрастает электрический ток между электродами. Увеличение электрической проводимости усиливается и фиксируется в виде записи хроматограммы на самописце регистратора. Чувствительность пламенно-ионизационных детекторов составляет -9 10 —10-10 г. Такие детекторы, однако, нечувствительны к присутствию веществ, которые не подвергаются ионизации в водородном пламени. Принцип действия электрохимического (электрокондуктометрического) детектора состоит в том, что ПФ после выхода из хроматографической колонки попадает в зону печи, нагретой до ~700—800 °С, в которой находится оксид меди СuO. Органическое вещество ПФ сгорает. Продукты сгорания — CO2, SO2 поглощаются водой, электрическая проводимость которой вследствие этого возрастает. Изменение электрического тока усиливается и фиксируется самописцем регистратора в виде хроматограммы. Селективные детекторы могут быть более чувствительными. Так, чувствительность термойонного детектора, реагирующего на присутствие соединений с атомами азота и фосфора, составляет 10-12—10-14 г определяемого вещества. Чувствительность электронозахватного детектора, с помощью которого определяют галогенсодержащие, металлоорганические, полиядерные -12 -14 ароматические соединения, также равна 10 —10 г. Пламенно-фотометрические детекторы, принцип действия которых основан на измерении интенсивности излучения продуктов атомизации компонентов ПФ в водородном пламени, позволяют определять серусодержащие (светопоглощение при 394 ± 10 нм) или фосфорсодержащие (светопоглощение при 526 ± 10 нм) соединения с чувствительностью около 10-12—10-13 г. Как уже говорилось выше, усиленные сигналы от детекторов затем преобразуются и записываются самописцем регистратора в виде хроматограммы на бумаге. Современные хроматографы имеют компьютеры с базой данных, используемых при обработке хроматограмм, которые могут демонстрироваться на экране монитора. При представлении данных, полученных при проведении анализа методами ГХ, обычно указывают следующие характеристики: тип хроматографа и детектора; материал, из которого сделана хроматографическая колонка, ее длина и внутренний диаметр; природа ПФ и твердого носителя; газ-носитель и скорость его потока; температура испарителя и термостата, который поддерживает постоянной температуру колонки; продолжительность анализа; 20 способ обработки хроматограмм. Обязательным условием является предварительная проверка пригодности хроматографической системы для разделения данной смеси: достижение оптимальных параметров эффективности колонки и разделения компонентов. При представлении результатов количественного анализа необходима их статистическая обработка. Детектор по теплопроводности (катарометр) Работа детектора по теплопроводности основана на изменении температуры нагретых нитей (чувствительных элементов) в зависимости от теплопроводности окружающего газа, которая в свою очередь определяется его составом. Нагретые электрическим током нити отдают теплоту главным образом за счет принудительной конвекции и теплопроводности газа. Теплопередача принудительной конвекцией нежелательна, так как зависит в большой степени от скорости и теплоемкости газа, а не от его теплопроводности. Наиболее предпочтительна теплопередача за счет теплопроводности газа. Этот вид теплообмена можно увеличить за счет повышения теплопроводности газаносителя. Детектор по теплопроводности измеряет различие в теплопроводности чистого газа-носителя и смеси газа-носителя с веществом, выходящим из хроматографической колонки. Поэтому наибольшая чувствительность может быть получена в том случае, когда теплопроводность анализируемого вещества сильнее отличается от теплопроводности газа-носителя. Большинство органических веществ имеют низкую теплопроводность и для их анализа целесообразно использовать газы-носители с возможно более высокой теплопроводностью. Такими газами являются водород и гелий, но на практике водород ввиду его взрывоопасности применяется значительно реже гелия. Так как гелий является довольно дефицитным и дорогим газом, а работа с водородом небезопасна, в некоторых случаях в качестве газоносителей могут использоваться азот, аргон, углекислый газ или воздух. Однако характеристики детектора по теплопроводности (чувствительность, линейность) при работе с этими газами значительно ухудшаются. Кроме того, при анализе веществ с большей теплопроводностью, чем у газа-носителя, появляются отрицательные пики. Детектор по теплопроводности представляет собой массивный металлический блок, в цилиндрические отверстия (камеры) которого помещены чувствительные элементы — металлические спирали из тончайшей проволоки закрепленные в кронштейне (рис. 7). Камеры детектора через входной и выходной каналы продуваются газом-носителем. В полость металлического блока помещена спираль из металла с высоким термическим сопротивлением (Pt, W, их сплавы, Ni). Если спираль обмывает чистый газ-носитель, спираль теряет постоянное количество теплоты и ее температура постоянна. Если состав газа-носителя содержит вещество, выходящее из колонки, то меняется теплопроводность газа и соответственно температура спирали. Это приводит к изменению сопротивления нити. 21 Рис. 7. Схема камеры детектора по теплопроводности. 1- ввод газа; 2 - изолятор; 3 -выход в атмосферу; 4 - металлический блок; 5 - нить сопротивления. Для получения дифференциального сигнала через одну камеру (рис. 7) детектора (измерительную) проходит газ, выходящий из хроматографической колонки, через другую (сравнительную) — чистый газ-носитель. Нагретые чувствительные элементы в сравнительной и измерительной камерах обдуваются потоком газа-носителя, и их сопротивление приобретает определенное значение. При прохождении через детектор бинарной смеси, состоящей из газа-носителя и определяемого компонента с отличающейся от чистого газа-носителя теплопроводностью, в измерительной ячейке нарушается теплообмен. При изменении условий теплообмена изменяется температура чувствительного элемента и, как следствие, его сопротивление. Различие сопротивлений чувствительных элементов является функцией мгновенной концентрации компонента в газовом потоке и измеряется с помощью моста Уитстона (рис. 8). Рис. 8. Схема включения двухплечевого катарометра в измерительный мост Когда температура и, следовательно, сопротивление чувствительных элементов R1 и R2 одинаково, мост сбалансирован и на регистрирующий прибор подается нулевой сигнал. При прохождении через измерительную ячейку определяемого компонента сопротивление чувствительного элемента R2 изменяется, а значение сопротивления R1 остается первоначальным. Схема моста при этом выходит из равновесия, и между точками А и В возникает 22 разность потенциалов, которая преобразуется регистрируемый автоматическим потенциометром. в сигнал, непрерывно Ионизационно-пламенный детектор Принципы ионизационного детектирования Ионизационные методы детектирования обеспечивают наибольшую чувствительность и широко применяются для определения малых количеств анализируемых веществ. В основе этих методов лежит зависимость электрической проводимости ионизированной газовой среды от ее состава. Сигналом ионизационных детекторов является изменение ионного тока (ионным током условно назван электрический ток, создаваемый между электродами детектора всеми заряженными частицами в газе (ионами и электронами), вызванное введением в детектор анализируемого вещества. Ионный ток возникает в детекторе под действием какого-либо источника ионизации (радиоактивного изотопа, пламени, разряда, фотоионизации, электронной и ионной эмиссии) и электрического поля (разности потенциалов) между электродами детектора. В любой момент времени в детекторе достигается равновесие, характеризующееся тем, что скорость образования заряженных частиц (ионов, электронов) равна сумме скоростей рекомбинации и сбора заряженных частиц на электродах детектора. Скорость сбора определяет ток детектора. В ионизационных детекторах создаются такие условия, при которых либо плотность (концентрация) заряженных частиц, либо скорость переноса их в электрическом поле зависит от состава газа. К преимуществам ионизационно-пламенного детектора (ДИП), по сравнению с другими ионизационными детекторами, относятся: высокая чувствительность к органическим соединениям, широкий линейный диапазон, сравнительно малая зависимость рабочих параметров от конструкции и внешних условий, безинерционность и отсутствие жестких требований к стабильности электрического питания. Детектор представляет собой камеру (рис. 9), в которой поддерживается водородное пламя, являющееся источником ионизации. В камеру вводятся необходимые для поддержания пламени водород и воздух: водород подается в детектор в смеси с газом-носителем через канал горелки, а воздух — через другой канал и распределяется равномерно диффузором. Горелка является одним из электродов, она изолирована от корпуса детектора и соединена с источником стабилизированного напряжения. Второй электрод, называемый часто коллектором, расположен над горелкой. Во внешнюю цепь электрода детектора включен электрометр, измеряющий ток между электродами детектора. Поскольку в пламени чистого водорода число ионов мало, сопротивление межэлектродного газового пространства очень велико (10 -12—10-11 Ом) и ток детектора весьма мал (10-12 —10-11 А). Этот ток, возникающий за счет ионизации примесей, содержащихся в газе-носителе, водороде и воздухе, является постоянным фоновым током детектора. При внесении с газом-носителем из колонки анализируемых органических веществ число ионов в пламени резко увеличивается, сопротивление пламени падает и во внешней цепи детектора 23 регистрируется соответствующее возрастание ионного тока. Рис. 9. Схема ионизационно-пламенного детектора 1 — электрод-коллектор: 2 — горелка, 3 — изолятор электрода-коллектора, 4 — изолятор горелки, 5 — диффузор, 6 — изолятор питания, 7 — электрометр Механизм ионообразования при введении органических веществ в пламя водорода в значительной степени изучен. В нижней части зоны пламени (у среза горелки) происходит термическая деструкция органических молекул. Окисление продуктов деструкции сопровождается хемиионизацией, при которой вся энергия химической реакции окисления не распределяется в окружающей среде, нагревая ее, а направлена только на ионизацию: СН + О СНО+ + е. Масс-спектрометрическими измерениями доказано, что основными носителями положительных зарядов в пламени являются ионы гидроксония, которые образуются при взаимодействии ионов СНО+ с водой: СНО+ + Н2О Н3О+ + СО. Именно ионы гидроксония обусловливают электрическую проводимость пламени. Детектор электронного захвата Детектор электронного захвата (ДЭЗ) по частоте использования занимает одно из ведущих мест. Универсальные газовые хроматографы, как правило, комплектуются этим детектором наравне со стандартными детекторами — ионизационно-пламенным и по теплопроводности. Столь быстрое и широкое распространение ДЭЗ получил в связи с необходимостью измерения весьма малых количеств хлорсодержащих пестицидов в продуктах растительного и животного происхождения. Он успешно применяется для определения малых концентраций галоген-, кислород- и азотсодержащих веществ, некоторых металлорганических соединений и других веществ, содержащих атомы с явно выраженным сродством к электрону. Система детектирования по захвату электронов (рис. 10) включает ионизационную камеру (ячейку детектора) и источник поляризующего 24 напряжения (блок питания). По характеру влияния на сигнал расхода газа-носителя детектор в зависимости от конструкции и условий газового питания может быть отнесен либо к концентрационному, либо к потоковому. Для устойчивой работы детектора необходимо прежде всего обеспечить постоянную скорость образования свободных электронов в ионизационной камере, что достигается помещением в нее радиоактивного источника (иногда в качестве источника электронов используется газовый разряд, так называемые нерадиоактивные ДЭЗ). В качестве газа-носителя используются азот, аргон, гелий и другие электронодонорные газы, способные ионизироваться под воздействием радиации с освобождением электрона: N2 N2+ + e. Образование электронов происходит в электрическом поле между электродами детектора. Напряженность поля недостаточна для сбора всех зарядов, и начальный (фоновый) ток детектора формируется в основном электронами, подвижность которых на три порядка выше, чем подвижность ионов. Вклад ионов в ток детектора невелик, так как значительно большая часть их успевает рекомбинировать, не доходя до соответствующего электрода. При появлении в детекторе молекул анализируемых веществ, обладающих сродством к электрону, происходит захват ими свободных электронов: М + е М Хотя в результате этого процесса общее число заряженных частиц в ионизационной камере не меняется, эффективная подвижность связанных электронов резко падает, и они не участвуют в процессе переноса тока между электродами. Это приводит к соответствующему снижению фонового тока детектора. Таким образом, полезным сигналом детектора является уменьшение начального тока, однозначно связанное (в рабочем диапазоне концентраций) с количеством анализируемого компонента. Образовавшиеся отрицательные ионы анализируемых молекул (или их частей, если захват сопровождается разрушением) легко рекомбинируют с ионами азота M + N2+ М +N2, что вносит дополнительный вклад в уменьшение тока детектора. Детектор электронного захвата обладает высокой ионизационной эффективностью, доходящей в лучших конструкциях при оптимальных условиях работы до 0,05 Кл/мг; обычно значение ионизационной эффективности на один-два порядка ниже. Основной трудностью в достижении малого предела детектирования при работе с ДЭЗ является большой уровень флуктуаций, связанный со значительным фоновым током детектора. Этот фоновый ток неизбежен, так как для получения высокой чувствительности и пропорциональных сигналов от сравнительно больших количеств пробы необходима высокая концентрация свободных электронов. По той же причине недопустимо присутствие в газе- 25 носителе примесей (например, кислорода), снижающих количество электронов или их подвижность. Обычно уровень фонового тока составляет (1-5) -10-9 А, при этом уровень шума трудно уменьшить ниже 10-13 А. Значение предела детектирования ДЭЗ находится в интервале 510-1010-11 мг/мл, что в среднем на два порядка ниже предела детектирования ионизационно-пламенного детектора и позволяет фиксировать нано- и даже пикограммовые количества веществ, обладающих большим сродством к электрону (например, CCI4, C6H6Cl6 и т. п.). Существуют разнообразные конструкции ДЭЗ. Первый детектор, описанный Ловелоком (рис. 10а), имел вид конденсатора с плоскопараллельными электродами, на одном из которых был размещен источник радиации. Примером другой типичной конструкции является коаксиальный детектор (рис. 10 б), в котором один электрод выполнен в виде цилиндра с источником на внутренней поверхности, а другой — в виде стержня, расположенного на оси цилиндра; характеристики обоих типов детекторов довольно близки. Рис. 10. Схема детектора электронного захвата Ловелока (а) и коаксиального (б) 1- электроды, 2 - радиоактивный источник. Расчет содержания определяемого вещества. На практике применяют преимущественно следующие методы расчета содержания определяемых компонентов в хроматографируемых смесях: абсолютной градуировки (калибровки), внутренней нормализации и внутреннего стандарта. Все методы основаны на измерении параметров пиков на хроматограмме: их площади или высоты. Чаше измеряют площади пиков. Использование площадей пиков при количественном определении содержания компонентов смеси основано на существовании прямой пропорциональной зависимости между площадью пика данного компонента смеси и его содержанием в хроматографируемой пробе: S=km, где S — площадь пика на хроматограмме, т — масса данного компонента в пробе, k — коэффициент пропорциональности. Площади пиков на хроматограмме измеряют интегратором хроматографа. Это —наиболее точный метод; ошибка измерения площади пика — меньше 1%. При отсутствии интегратора площадь пиков рассчитывают, измеряя их высоту и ширину или полуширину. В этом случае погрешности определения площади пиков достигают нескольких процентов. 26 Принимая приближенно пик на хроматограмме за равнобедренный треугольник, можно рассчитать его площадь S: S = 0,5ha = ha0,5, где h — высота пика, а — ширина пика у его основания, а0,5 — полуширина пика. Однако основание пика на хроматограмме обычно несколько размыто (рис. 11), поэтому на практике измеряют не ширину пика а, а его полуширину а0,5. При таком способе рассчитанная площадь пика меньше его действительной площади на несколько процентов. К тому же пики на хроматограмме в той или иной мере несимметричны. Симметричность пиков, оцениваемая, например, на высоте, равной 0,1 высоты пика, может учитываться при расчете их площади. Рис. 11. К определению площади пика на хроматограмме Иногда (сравнительно редко) относительные площади пиков определяют методом взвешивания, вырезая их из бумажных хроматограмм и взвешивая на аналитических весах. Метод абсолютной градуировки (калибровки). Метод заключается в построении графической зависимости одного из количественных параметров хроматографического пика (высота или площадь) от содержания вещества в пробе. Пусть требуется найти содержание определяемого вещества в анализируемом растворе с использованием площади пика этого вещества на хроматограмме. Готовят серию i-эталонных растворов с точно известной концентрацией ci определяемого вещества в каждом растворе. Записывают хроматограммы каждого раствора в одинаковых условиях и измеряют площадь Si пика определяемого вещества на каждой хроматограмме. По полученным данным строят градуировочный (калибровочный) график в координатах Si—сi (площадь массовое или объемное содержание вещества в пробе (%) или его абсолютное количество, мл, мкг) (рис. 12). Затем строго в тех же условиях хроматографируют пробу анализируемого раствора с неизвестной концентрацией Сx и измеряют площадь Sx пика определяемого вещества. 27 Si ci Рис. 12. Градуировочная зависимость между содержанием компонента в пробе и количественным параметром (площади или высоты) хроматографического пика для линейно (прямая линия) и не линейно (пунктирная линия) работающего детектора. По градуировочному графику (рис. 12) находят концентрацию с х определяемого вещества в анализируемом растворе. Метод предусматривает определение площади только одного пика определяемого вещества. Площади всех остальных пиков (а их на хроматограмме может быть много) не измеряются. Вместе с тем метод требует получения хроматограмм нескольких проб (эталонных и анализируемой) в строго одинаковых условиях. Важнейшими требованиями к эксперименту при выполнении количественного анализа по методу абсолютной градуировки являются: точность и воспроизводимость дозирования пробы, строгое соблюдение постоянства (тождественности) условий хроматографирования при градуировке прибора и при определения содержания интересующего вещества в пробе неизвестного состава. Методом абсолютной градуировки чаще всего пользуются в тех случаях, когда есть сомнения в линейной работе детектора, и тогда, когда нужно определять не все компоненты анализируемой смеси, а только несколько из них, например, при анализе примесей. В соответствии с этим условия хроматографического анализа должны обеспечивать, по возможности, полное отделение лишь пиков интересующих компонентов от соседних пиков на хроматограмме. В некоторых случаях при полной уверенности в линейной области показаний детектора и затруднительности приготовления искусственных смесей с варьированием в них количества определяемого компонента (анализ микропримесей), допускается градуировка хроматографа лишь по одной смеси. На градуировочном графике проводят прямую линию через единственную экспериментальную точку и начало координат. Метод внутренней нормализации. Метод предусматривает отнесение измеренного количественного параметра хроматографического пика (площади, высоты или произведения высоты на время удерживания) к суммарному сигналу детектора на все компоненты пробы, присутствующие в анализируемом образце. На одной и той же хроматограмме измеряют площади Si всех пиков и определяют их сумму Si считая, что элюируются (выходят из колонки) все 28 компоненты анализируемой пробы, так что ни один из компонентов не остается прочно связанным в хроматографической колонке. Поскольку площадь пика любого компонента прямо пропорциональна массе этого компонента в разделяемой смеси, то рассчитывают, массовую долю сx в процентах (хроматографический процент) данного компонента Х по формуле: fi S x 100% Σf i S i где Si - площадь хроматографического пика; fi - нормировочный (градуировочный) множитель. cx Метод является одним из самых распространенных. Пики всех разделяемых компонентов получаются на одной и той же хроматограмме, т.е. в идентичных условиях. Однако необходима полная уверенность в том, что с потоком газаносителя элюируются все без исключения компоненты пиков, так чтобы сумма площадей всех пиков соответствовала бы 100%-ному содержанию всех веществ смеси. Длительное время считалось, что значение множителя fi, учитывающего главным образом не одинаковую чувствительность детектора к анализируемым веществам, зависит только от принципа действия того или иного детектора и химической природы определяемых компонентов и (для линейно работающего детектора) не зависит от их относительной концентрации. В соответствии с этим, например, при анализе изомерных соединений нет необходимости учитывать различия в относительной чувствительности детектора, поскольку физико-химические свойства изомеров весьма близки и, следовательно, равным количествам компонентов в анализируемой смеси на хроматограмме отвечают пики равной площади. При работе с детектором по теплопроводности и использовании в качестве газа-носителя водорода или гелия необходимость учета fi отпадает, если анализируемая смесь состоит из соединений с большой молекулярной массой (например, с числом атомов углерода более 10) или при анализе изомеров. При работе с ионизационно-пламенным детектором часто пренебрегают градуировочными множителями, анализируя смеси, состоящие только из углеводородов. Наиболее распространенный способ экспериментального определения fi для какого-либо вещества относительно стандартного соединения заключается в хроматографировании искусственно составленных смесей необходимых компонентов с выбранным стандартным веществом и последующем расчете по формуле: c cст сi S ст fi i S i S ст cст S i При этом принимается, что нормировочный (градуировочный) множитель для стандартного соединения fст = 1,0. 29 Содержание компонентов сi и cст может быть выражено в % по массе, объему или молярности; соответственно в тех же единицах будет определен и состав анализируемого образца. Надежность получаемых при экспериментальном определении fi данных зависит от погрешностей не только на стадии хроматографирования, но и на стадии приготовления искусственных смесей (вследствие возможных потерь изза испарения при отборе пробы для взвешивания и т.п., операции приготовления искусственных смесей должны проводиться с максимальной тщательностью и аккуратностью!). В периодической печати опубликованы обширные сводки экспериментально найденных значений fi для многочисленных представителей различных классов соединений относительно различных стандартов для катарометра, ДИП и др. детекторов. Эти данные частично включены в некоторые учебники. Известно также приближенные расчетные и графические способы оценки относительной чувствительности детекторов. Таким образом, можно сформулировать, что достижению высокой точности результатов количественных определений при расшифровке хроматограмм методом внутренней нормализации будет способствовать выполнение следующих двух условий: - использование не литературных или расчетных, а экспериментально найденных значений градуировочных множителей fi, определяемых на том же приборе и в том же режиме хроматографирования, в котором будет проводиться анализ смеси неизвестного состава: - при определении значений fi исходить из результатов хроматографирования смесей, имитирующих состав анализируемого образца или приближающихся к нему. Преимущество метода внутренней нормализации в сравнении с методом абсолютной градуировки заключаются в устранении необходимости точной дозировки образца и соблюдении тождественности условий анализа при повторных определениях. В то же время метод имеет ряд существенных ограничений и недостатков. Использование метода внутренней нормализации для определения содержания i-ого компонента в смеси c j-м числом других веществ правомерно лишь при условии; что природа всех интересующих соединений в смеси известна (иначе невозможно определить fi) и что все они проявляются на хроматограмме. Поэтому, приступая к анализу незнакомой смеси, следует, прежде всего, путем изменения в широких пределах условий хроматографирования (природа неподвижной фазы, колонки, температуры и скорости газа-носителя) убедиться в однозначном определении числа компонентов, составляющих анализируемую смесь. Метод внутреннего стандарта. Метод основан на прибавлении к известному количеству анализируемого образца известного количества, не содержащегося в нем эталонного соединения - «внутреннего стандарта»- и последующем хромптографировании приготовленной смеси. 30 Готовят несколько (часто—пять) эталонных смесей, каждая из которых включает точно известную массу m1 определяемого компонента и массу тст стандарта. В строго одинаковых условиях хроматографируют каждую смесь и на полученных хроматограммах измеряют ллощади Si пиков определяемого вещества и площадь Sст стандарта. Так как площадь пика на хроматограмме прямо пропорциональна массе данного вещества, то: Si = k1 mi, Sст = k2 mст. Поэтому Si m k m 1 1 k i S ст k 2 mст mст где коэффициент пропорциональности k = k1 / k2 или обратную ему величину 1/k называют поправочным коэффициентом. Затем к анализируемому раствору, содержащему неизвестную массу тх определяемого вещества, прибавляют точно известную массу стандарта тст и хроматографируют полученный раствор в тех же условиях, что и эталонные растворы, после чего измеряют площади Sх и Scт обоих пиков. Иногда, наоборот, к раствору стандарта прибавляют определенное количество определяемого вещества. По полученным данным вычисляют отношение Sх / Scт. Окончательную обработку результатов можно проводить либо методом градуировочного графика, либо расчетным путем. В первом случае строят градуировочный график в координатах Sх/Scт — тх/тст и затем, зная измеренную величину Sх/Scт, находят по графику отношение тх/тст и массу тx определяемого вещества. Во втором случае с использованием найденного поправочного коэффициента по формуле рассчитывают отношение тх /тст mх 1 S x mст k S ст и затем, зная mст, вычисляют массу mx, определяемого вещества. В качестве стандарта используют вещества, родственные определяемому. Чем меньше различаются площади Sх и Scт, тем меньше ошибка определения, поэтому анализ обычно проводят в таких условиях, когда площади Sх и Scт — соизмеримы. Пики стандарта и определяемого вещества не должны перекрываться. Достоинство метода внутреннего стандарта состоит в том, что при его использовании сводится к минимуму погрешности в результатах, вызванные случайными изменениями основных параметров хроматографического опыта (температуры и скорости газа-носителя и режима работы детектора), поскольку возможные отклонения от заданных условий должны равным образом влиять на количественные параметры хроматографических пиков, как стандартного, так и анализируемого соединений. Отпадает необходимость дотирования строго заданных количеств пробы и соблюдения постоянства всех переменных параметров хроматографирования. 31 Главные ограничения применимости метода внутреннего стандарта заключаются, во-первых, в необходимости специальной подготовки пробы для анализа (т.е. введение в известное по объему или массе количества аналнзируемого образца известного количества внутреннего стандарта - при этом трудно избежать погрешностей, связанных с возможным изменением состава пробы) и, во-вторых, в трудности выбора внутреннего стандарта. При выборе внутреннего стандарта обычно руководствуются следующими требованиями: 1. Стандартное (эталонное) вещество должно полностью смешиваться с компонентами анализируемой смеси (растворяться в ней) и в химическом отношении должно быть абсолютно инертным и к компонентам анализируемой смеси, и к используемой неподвижной фазе или твердому носителю. Желательно стандартное вещество выбирать из числа соединений, близких объектам анализа по структуре и летучести. Это исключает возможное неоднократное влияние условий опыта на параметры пиков стандарта и определяемых соединений. 2. Концентрацию эталонного вещества в анализируемой пробе следует подбирать таким образом, чтобы отношение площадей (или других количественных параметров) пиков стандарта и интересующего компонента было близким к 1. 3. В принятых условиях анализа пик стандартного вещества должен располагаться на хроматограмме в непосредственной близости от пиков соединений - объектов анализа, не накладываясь ни на них, ни на пики других веществ. Важно, чтобы стандарт не содержал примесей накладывающихся на пики определяемых соединений. Поэтому предварительно в тех же условиях контролируют содержание в стандарте нежелательных примесей. При этом 100% чистота стандарта необязательна, т.к. присутствие примесей, не нагадывающихся на пики определяемых соединений, учитывается градировкой (значением fi). 4. Если в задачу анализа входит определение содержания в пробе двух или более веществ, значительно различающихся по времени удерживания (или по концентрации), целесообразно использовать два или более внутренних стандарта. 32 Литература 1. Ю.Я. Харитонв. Аналитическая химия, ч. 2. 2. Ю.А. Золотов. Основы аналитической химии, ч.1. 3. В.Б. Алексеевский. Физико-химические методы анализа. 4. Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг. Руководство к практическим работам по газовой хроматографии. 33 Содержание стр. Сущность метода............................................................................................. 4 Классификация методов хроматоргафии ..................................................... 5 Понятие о теории метода................................................................................ 9 Параметры хроматографического пика.................................................... 9 Влияние регулируемых факторов на показания хроматографического анализа.......................................................................................................... 11 Параметры разделения. Эффективность колонки................................... 13 Практика метода.............................................................................................. 15 Устройство хроматографа.......................................................................... 15 Детекторы.................................................................................................... 17 Детектор по теплопроводности (катарометр)....................................... 20 Ионизационно-пламенный детектор (ДИП)......................................... 22 Детектор электронного захвата............................................................. 23 Расчет содержания определяемого вещества........................................... 25 Метод абсолютной градуировки........................................................... 26 Метод внутренней нормализации........................................ 27 Метод внутреннего стандарта............................................................. 29 Литература........................................................................................................ 32
