Количественный анализ ногтей человека

Лаборатория оптической атомной спектрометрии
Ресурсный образовательный центр по направлению Химия
Практические курсы:
«Методы атомного спектрального анализа»,
«Оптические методы анализа»,
«Цифровой спектральный анализ»
Составители:
асс. Савинов С.С.
проф., д.ф.-м.н. Дробышев А.И.
Лабораторная работа
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НОГТЕЙ ЧЕЛОВЕКА
Краткая характеристика объекта анализа
К твердым биопробам относятся ткани различных органов, костный мозг, кости,
жировые ткани, волосы, ногти, экскременты. Из твердых неинвазивных биообразцов
наибольший интерес среди исследователей вызывают волосы и ногти человека.Ногти (как и
волосы) служат информативным материалом из-за особого механизма поступления в них
микроэлементов: в период роста они подпитываются циркулирующей кровью, лимфой,
внеклеточной жидкостью, к моменту выхода из ростковой зоны затвердевают и жестко
фиксируют состав и соотношение накопленных веществ и микроэлементов.Вследствие
такого поступления ногти открывают новые возможности, а именно, позволяют проследить
динамику прошедшей экспозиции, чего не могут дать жидкие биологические пробы.
Ногти (как и волосы) имеют ряд преимуществ для микроэлементного анализа:
• Неинвазивность пробоотбора (по сравнению с отбором образцов крови и тканей).
Выбор образца с неинвазивным пробоотбором немаловажен при обследовании больших
групп населения, в случае анализа проб детей и новорожденных. Большое значение выбору
неивазивного биообразца уделяется в связи с необходимостью биомониторинга большой
группы лицс высокой частотой ВИЧ- инфицированных.
• Простота транспортировки. Для образцов крови необходимо использовать
специальные емкости с реагентами, разрушающими форменные элементы крови,
антикоагулянты (гепарин, ЭДТА, цитрат натрия); для образцов мочи используют стерильные
одноразовые емкости с азотной кислотой для предотвращения бактериального разложения.
• Возможность длительного хранения образцов ногтей без специальных условий, в
отличие от жидких образцов, таких как кровь, моча, слюна (которые специально хранят в
темноте при температуре ниже 4 °C и транспортируют в термоконтейнерах, а при
необходимости более длительного хранения пробы охлаждают до -20 °C).
• Возможность оценки долгосрочного воздействия, выявление динамики накопления
токсикантов. Из-за малой скорости роста (0,05-1,2 мм в неделю), ногти способны выявить
историю экспозиции (в отличие от образцов крови, мочи, слюны).
Ногти имеют преимущества перед волосами, поскольку элементный состав последних
зависит от цвета (что ограничивает использование данного биообразца). Кроме этого, ногти
1
отличаются высоким уровнем бионакопления: содержание ряда металлов (Pb, Cd, Cr, Al, Sn)
в ногтях превышает аналогичный параметр в волосах.
К достоинствам использования образцов ногтей в медицинской диагностике также
относятся выявленные корреляции между уровнями содержаний ряда металлов в ногтях и
наличием некоторых заболеваний. Например, выявлена корреляция между содержанием в
ногтях Cd, Mn, Cu и наличием гипертонии; психические расстройства коррелируют с
повышенными уровнями таких металлов, как Cd, Pb, Mn, Ni, Zn; кожные заболевания – с Cr,
Mn, Fe, Ni; диабет – с Cr, Mn, Ni.
К недостаткам ногтей как биоматрицы для микроэлементного анализа можно отнести
возможность загрязнений вследствие постоянного контакта с окружающей средой и
необходимостью пробоподготовки (т.к. большинство аналитических методов ориентировано
на анализ жидких проб). Тем не менее, в настоящее время определение микроэлементного
состава производных эпидермиса (волосы, ногти) является одним из основных методов
оценки элементного статуса популяции.
Схема анализа
Образцы ногтей отбираются путем среза ножницами из специально подобранного
материала (предварительно обработанными этиловым спиртом) со всех пальцев обеих рук. В
случае хранения образцов они помещаются в чистый полиэтиленовый пакет, каждому
образцу присваивается персональный номер (шифр).
Для удаления поверхностного загрязнения ногти промываются порцией
деионизированной воды и порцией ацетона ОСЧ, после чего высушиваются в сушильном
шкафу. Высушенные образцы взвешиваются (средняя масса навески при срезе ногтей со всех
пальцев обеих рук составляет 0,09 г).
Наиболее широко используемым способом растворения проб ногтей является
микроволновая минерализация с помощью азотной кислоты и пероксида водорода.
В работе используются угольные электроды марки «Искра»: «конусообразный»
верхний электрод и «усеченная лунка» - нижний. Электроды предварительно обжигаются в
дуге переменного тока для удаления находящихся в них микропримесей. Затем на нижний
электрод наносилась капля раствора полистирола в толуоле, которая после высыхания
образует на поверхности электрода защитную пленку, предотвращающую проникновение
пробы вглубь электрода.
Подготовленная проба ногтей наносится на заранее подготовленные электроды
(обожженные и с нанесенной полистирольной пленкой; 9 параллельных определений на одну
пробу) в виде 10 капель (каждая объемом 10 мкл) минерализата (капли последовательно
наносятся на электроды и выпариваются под инфракрасной лампой для уменьшения
затрачиваемого времени). Использование большого числа капель позволяет осуществлять
концентрирование аналитов на электроде, тем самым уменьшая пределы обнаружения
метода.
После нанесения пробы на электрод наносится капля водного раствора NaCl–
спектрального буфера, нивелирующего (вместе с большой силой тока) матричное влияние
различных проб и позволяющего использовать в качестве стандартов водные растворы солей
элементов.
После этих процедур электроды устанавливаются в камеру дугового разряда, между
ними с помощью генератора дуги переменного тока создается плазма, благодаря которой
происходит испарение пробы, ее атомизация и возбуждение. Разложение излучаемого света в
2
спектр осуществляется спектральным прибором МФС-8, а регистрация – линейным
фотодиодным детектором МАЭС.
Программное обеспечение «Атом», которым комплектуется детектор, нацелено на
определение элементов при непрерывном поступлении пробы в плазму источника
(например, при анализе металлов в искровом разряде, анализе порошковых проб методом
просыпки, анализе водных растворов в пламени).
При импульсном поступлении элементов в плазму источника (как в случае анализа
сухих остатков жидких проб с торца электрода) в качестве аналитического сигнала
предпочтительнее использовать логарифм суммарной (по времени экспозиции)
интенсивности спектральной линии с учетом сигнала холостого опыта. Для расчета данного
аналитического сигнала первичные спектральные данные из программного обеспечения
«Атом» экспортируются в MSExcel, в котором также производится дальнейшая
статистическая обработка данных (включая построение градуировочных графиков).
Среднеквадратичное отклонение при определении микроэлементного состава ногтей по
предлагаемой методике не превышает 0,2.
3
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Ход работы
На аналитические весы поместить лист чистой кальки, обнулить весы.
Взвесить навеску ≈ 0,080 г пробы ногтей, выданной преподавателем. Записать точную
массу навески.
Количественно перенести навеску в подготовленный тефлоновый сосуд для
микроволнового разложения.
В тот же сосуд с пробой последовательно поместить 0,7 мл концентрированной азотной
кислоты ОСЧ и 1 мл концентрированного пероксида водорода ОСЧ.
Подготовить второй сосуд с холостой пробой, для чего поместить в него 0,7 мл
концентрированной азотной кислоты ОСЧ и 1 мл концентрированного пероксида
водорода ОСЧ.
Запомнить номера сосудов с пробой ногтей и холостой пробой.
Автоклавы установить в микроволновую печьMDS-6 Digestion/Extraction.
На микроволновой печи выставить 8 режим работы (давление 1,2 Мпа, время 10 минут).
После проведения разложения дать сосудам остыть в течение 20 минут. Одновременно с
этим выполнять следующие пункты работы.
Методом последовательного разбавления в два раза приготовить рабочий
многоэлементный раствор с концентрацией элементов 2,5∙10-2 г/л; в качестве головного
раствора использовать многоэлементный стандартный раствор CertiPUR IV (Merck) с
концентрацией элементов 0,1 г/л. Колбу с рабочим раствором подписать маркером.
Методом последовательного разбавления в пять раз приготовить еще три рабочих
раствора (концентрация последнего раствора должна составлять 2∙10-4 г/л). Все колбы с
рабочими растворами подписать.
Налить в пластиковую пробирку 4 мл рабочего раствора с минимальной концентрацией
(≈2/3 пробирки). Пробирку подписать маркером.
Пункт 11 повторить для всех рабочих растворов.
Налить в пластиковую 4 мл деионизированной воды, которую использовать для
промывания микрошприца.
Вынуть микрошприц МШ-10 из футляра, сполоснуть внутреннюю часть микрошприца
деионизированной водой из пробирки пять раз.
Проверить ограничитель на микрошприце (при полном вынимании поршня набираемый
объем должен составить 10 мкл).
Сполоснуть внутреннюю часть микрошприца рабочим раствором с минимальной
концентрацией пять раз. Удостовериться, что при наборе раствора в цилиндре
микрошприца не появляются воздушные пробки.
На первые пять подготовленных электродов нанести по одной капле рабочего раствора с
минимальной концентрацией (на каждый электрод).
Пункты 16-17 повторить для следующих рабочих растворов в порядке увеличения
концентрации элементов.
Подставку с электродами с нанесенными растворами помесить под инфра-красной
лампой. Включить лампу для уменьшения времени получения сухих остатков растворов.
После выпаривания всех капель пробы выключить инфра-красную лампу.
Вытащить сосуды из микроволновой печи, открыть их.
Полученный раствор от пробы ногтей количественно перенести в стеклянную пробирку
на 2 мл (объем которой предварительно проверялся путем определения веса чистой
воды).
4
23. Сполоснуть сосуд небольшим количеством деионизированной воды и количественно
перенести эту воду в ту же пробирку (объем не должен превышать 2 мл).
24. Довести объем раствора в пробирке до 2 мл деионизированной водой.
25. Пункты 22-24 повторить для холостой пробы.
26. Сполоснуть внутреннюю часть микрошприца деионизированной водой пять раз.
27. Сполоснуть внутреннюю часть микрошприца холостой пробой пять раз. Удостовериться,
что при наборе пробы в цилиндре микрошприца не появляются воздушные пробки.
28. На пять подготовленных электродов с другой подставки нанести по две капли холостой
пробы (на каждый электрод).
29. Сполоснуть внутреннюю часть микрошприца пробой минерализата ногтей пять раз.
Удостовериться, что при наборе пробы в цилиндре микрошприца не появляются
воздушные пробки.
30. На оставшиеся пять подготовленных электродов нанести по две капли пробы (на каждый
электрод).
31. Поместить подставку с электродами с пробами под инфра-красной лампой. Включить
лампу для уменьшения времени получения сухих остатков растворов.
32. После выпаривания всех капель пробы выключить инфра-красную лампу.
33. Пункты 26-32 повторить до нанесения на каждый электрод 10 капель пробы по 10 мкл
каждая (включительно). В случае, если внутренний цилиндр пробы засорился, промыть
его деионизированной водой, а затем снова промыть пробой.
34. На все электроды (с рабочими растворами и пробами) нанести 10 мкл (на каждый
электрод) раствора хлорида натрия с концентрацией 15 г/л.
35. Поместить подставки с электродами под инфра-красной лампой. Включить лампу для
уменьшения времени получения сухих остатков растворов.
36. После выпаривания всех капель пробы выключить инфра-красную лампу.
37. Запустить программу «Атом», выбрать пункт «Новый» (создать новый файл).
38. Установить в присутствии лаборанта в камеру дугового разряда пару угольных
электродов (верхний – заточенный на конус, нижний – на лунку с сухим остатком
рабочего раствора с наименьшей концентрацией).
39. Поворотом микрометрического винта свести электроды до визуального соприкосновения
острия конуса верхнего электрода с краем лунки нижнего электрода (не опускать конус
внутрь лунки), затем поворотом винта в обратную сторону выставить межэлектродное
расстояние 3 мм (один полный оборот соответствует 1 мм).
40. Вызвать окно «Режим измерения спектра» с помощью кнопки
.
41. В появившемся окне выставить время обжига 0 сек, время экспозиции 22 сек, количество
спектров 11.
42. Измерить сигнал темнового тока фотодиодного детектора, нажав на кнопку с
изображением синей стрелки
спектра проб.
, для его автоматического учета при регистрации
5
43. Проверить установку параметров съемки пробы:
сила тока 20 А (положение регулирующей ручки на ИВС 17)
ширина входной щели 50 мкм
межэлектродное расстояние 3 мм
время базовой экспозиции 2000 мс
количество спектров 1 1
время полной экспозиции 22 с
44. Произвести съемку спектра рабочего раствора, нажав на кнопку с изображением зеленой
45.
46.
47.
48.
49.
50.
стрелки
.
После окончания регистрации спектра в появившемся на экране диалоговом окне ввести
имя пробы с указанием ее номера (например, «раствор 1-1») и выбрать опцию
«записать дополнительные графики».
Вытащить из штатива с помощью пинцета угольные электроды и поместить их в
специальную металлическую подставку.
Повторить пункты 28-29, 34-35 для следующей пары электродов с сухим остатком
рабочего раствора той же концентрации (всего снять пять спектров), последовательной
изменяя цифру в номере пробы (2; 3; 4; 5) и сохраняя опцию «записать спектр
дополнительные графики».
Протереть кисточкой держатели штатива.
Измерить сигнал темнового тока фотодиодного детектора.
Пункты 39-40, 41-49 последовательно повторить для всех рабочих растворов (начиная с
раствора с наименьшей концентрацией), холостой и анализируемой проб.
51. Сохранить файл, нажав на изображение дискеты в левом верхнем углу
, в
названии файла указать дату, номер группы, фамилию и номера пробы; скопировать
файл на флеш-накопитель.
52. Вымыть порошком всю используемую посуду (колбы, пипетки, пробирки, стаканчики,
сосуды для микроволнового разложения). Тщательно стереть с них все надписи,
сделанные маркером.
53. Дважды ополоснуть посуду дистиллированной водой.
54. На рабочем компьютере открыть сохраненный файл.
55. Нажать на кнопку
в нижней части экрана для вызова окна ввода спектральных
линий.
56. Найти в таблице элементов (слева в появившемся окне) первый элемент из табл. 1 и
нажать на нем левой кнопкой мыши.
57. В списке спектральных линий выбранного элемента (в правой части окна) найти
спектральную линию, указанную в табл. 1, и вывести ее в таблицу данных, дважды
нажав на ней левой кнопкой мыши.
58. Пункты 56-57 повторить для всех элементов из табл. 1. После этого закрыть окно ввода
спектральных линий.
6
59. Вызвать окно настройки расчета интенсивностей аналитических линий, нажав на кнопку
, выставить в окне настроек анализа:
в выпадающем меню графы «вычисление фона» выбрать «минимальное»;
поставить галочку «усреднение точек фона» и выставить слева и справа по 1 диоду;
в графе «зона поиска (диодов)» ввести «2»
в выпадающем меню графы «способ вычисления интенсивности линии» выбрать
«площадь»;
поставить галочку в опции «вычитать фон»;
снять галочку с опции «не использовать зашкаленные пики»;
в графе «порог интенсивности» ввести «0»;
нажать на кнопку «все общие» (в верхнем правом углу окна настроек расчета
интенсивностей) и нажать на кнопку «Да» в появляющемся окне на вопрос «Установить
эти параметры для всех общими?»
Нажать на кнопку «ОК» для выхода из окна настройки расчета интенсивностей.
60. Подготовить данные для экспорта в MS Excel, для чего следует последовательно нажать
в верхнем меню программы кнопку «Режим», далее «Отчет».
61. Вызвать окно настроек отчета, нажав на кнопку
.
62. Во вкладке «Формат» выставить формат отчета «по элементам», колонок в одной строке
не более «все», поставить галочки у пунктов «интенсивность», «выводить все
параллельные».
63. В окне «Пробы» оставить выделенными все спектры.
64. В окне «Столбцы» оставить выделенными все спектральные линии.
65. Закрыть окно настроек отчета.
66. Экспортировать данные в MS Excel, нажав на кнопку
. В появившемся окне выбрать
«Без шаблона».
67. В появившемся файле выделить все данные и скопировать их на первый лист (с
названием “origin”) файла «слюна» (находится на рабочем столе). При правильном
переносе данных на седьмом листе файла (с названием “graph”) появятся
градуировочные графики для Cd, Cu и Pb, построенные в координатах lgI – lgm, где:
lgI – среднее значение (по пяти параллельным определениям) логарифма интенсивности
спектральной линии в спектре рабочего раствора (с учетом холостого опыта), отн.ед.
m – масса элемента на электроде, который был нанесен на него в виде 10 мкл рабочего
раствора, г
68. В случае, если какая-либо точка на графике лежит на оси X (т.е. lgI =0), найти в таблице
на этом же листе ячейку со значением lgI, соответствующим этой точке. Если данное
значение равно «♯ЧИСЛО!», то следует открыть шестой лист (с названием “lgpure”) и
удалить в нем значения ячеек, равные «♯ЧИСЛО!». При правильном удалении таких
значений все точки на градуировочных графиках займут нужное положение.
69. Определить значения угла наклона, свободного члена и коэффициента корреляции
полученной градуировочной прямой (которые получены при использовании метода
наименьших квадратов). При правильном приготовлении рабочих растворов и
правильном нанесении капель на электроды коэффициенты корреляции R2не будут
меньше 0,98.
7
70. Параметры градуировочных графиков (свободный член и угловой коэффициент) для
спектральных линий Cd, Cu и Pbперенести на восьмой лист (с названием “calculations”).
Использовать только две значащие цифры.
71. На том же листе в ячейке справа от ячейки «масса навески =» (в первой строке) ввести
массу навески пробы ногтей.
72. При правильном переносе данных на девятом листе (с названием “results”)файла
появятся концентрации Cd, Cu, Pb, Mg, Ca, Zn в ногтях, мкг/г.
73. Поскольку в атомно-эмиссионном анализе значение концентрации подчиняется
логнормальному закону, то статистическая обработка для случая нормального
распределения производится с логарифмами содержаний. Для этого следует определить
десятичные логарифмы концентраций определяемых элементов и среднее значение по
формуле:
𝑛
1
�����
𝑙𝑙𝑙 = � 𝑙𝑙𝐶𝑖
𝑛
𝑖=1
74. Для десятичных логарифмов найти их среднеквадратичное отклонение Sотносительные
среднеквадратичные отклонения sr по формулам:
𝑆𝑙𝑙𝑙
������2
∑𝑛𝑖=1 𝑙𝑙2 𝐶𝑖 − 𝑛𝑙𝑙𝐶
�
=±
𝑛−1
𝑆𝑙𝑙𝑙
𝑠𝑟 =
������
𝑙𝑙𝑙 2
75. В случае, если sr превышает 0,2, удалить максимально выпадающую параллельную (она
может иметь как максимальное, так и минимальное значение логарифма концентрации).
Если после этого sr все равно превышает 0,2, удалить еще одну максимально
выпадающую параллельную (наличие выпадающих параллельных связано с
неправильным нанесением капель на электроды).
76. Для оставшихся значений логарифмов концентраций определить число параллельных
определений n, среднее значение концентрации элемента в пробе и ее доверительный
интервал (верхнюю и нижнюю границы) по формулам (отдельно для каждого элемента):
𝑛
𝑛
𝐶̅ = �� 𝐶𝑖
𝑖=1
𝐶нижн = 𝐶̅ /10𝑡(𝑃,𝑓)·𝑆𝑙𝑙𝑙 /√𝑛
𝐶верх = 𝐶̅ · 10𝑡(𝑃,𝑓)·𝑆𝑙𝑙𝑙 /√𝑛
77. На девятом листе файла будут приведены значения концентраций определяемых
элементов, их доверительные интервалы и число параллельных определений, по
которым данные были рассчитаны.
78. Сравнить полученные данные с табличными значениями.
8
79. По результатам работы написать отчет, который должен содержать:
• оптическую схему цифрового спектрографа (которую нужно найти самостоятельно) с
указанием выделяемого спектрального диапазона, всех узлов прибора и их предназначения
(спектральный прибор МФС-8, детектор МАЭС-10);
• перечень спектральных линий элементов, которые были использованы для
количественного анализа;
• градуировочные зависимости для Cd, Cu и Pbс указанием длин волн используемых
спектральных линий и параметров градуировочных прямых (оси на графике должны быть
подписаны, масштаб выверен; каждая зависимость на отдельном графике);
• таблицу, в которой приведены исходные результаты количественного анализа (с
указанием сильно выпадающих значений) значений;
• конечные результаты количественного анализа (среднее геометрическое, верхняя и
нижняя границы доверительного интервала, число параллельных определений) отдельно для
каждого элемента;
• заключение касательно сходимости полученных результатов с литературными
данными.
Таблица 1. Аналитические линии определяемых элементов
элемент
λ, нм
элемент
λ, нм
Cd
228,80
Mg
280,27
Cu
324,75
Ca
317,93
Zn
213,86
Pb
283,31
9
1. Будаляева Р.М. Атомно-эмиссионный цифровой спектрографический анализ ногтей.
Дипломная (выпускная квалификационная) работа специалиста. СПбГУ, 2014.
2. Wilhelm M., Hafner D. et al. Monitoring of cadmium, copper, lead and zinc status in young
children using toenails: comparison with scalp hair // The Science of the Total Environment. 1991,
v. 103, p. 199-.207.
3. Sukumar A., Subramanian R. Relative element levels in the paired samples of scalp hair and
fingernails of patients from New Delhi // Science of the Total Environment. 2007, v. 372, p. 474–
479.
4. Mehra R., Juneja M. et al. Fingernails as biological indices of metal exposure // Biological
sciences. 2005, v. 30, №2, p. 253-257.
5. Vincet M., Bassissi S. et al. Environmental exposure to trace elements and risk of cutaneous
melanoma // Journal of Exposure Analysis and Environmental Epidemiology. 2005, v. 15, p. 458–
462.
10