РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИИ

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИИ XRCC1 ИXRCC3 В
ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ЛЕГКОГО
Кусаинова А.А., Атаева Н., Булгакова О.В.
Евразийский национальный университет им. Л. Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан
[email protected]
В связи с ухудшением экологического состояния окружающей среды, ежегодно
возрастает процент диагностики онкологических заболеваний, среди которых, рак легкого
(РЛ) занимает доминирующие позиции. РЛ привлекает пристальное внимание онкологов в
виду широкой распространенности, несвоевременной диагностики, разнообразием
клинических форм проявления, процесса раннего образования метастаз и недостаточной
эффективности методов лечения.
РЛ по своей природе является мультифакториальным заболевание, так как в
патогенез вовлекается многообразие функционально взаимосвязанных генов (генные
сети), включающих наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры),
второстепенные гены, так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом
определяется средовыми факторами [1].
В клетках организма регулярно происходит повреждение ДНК под действием
эндогенных и экзогенных мутагенных факторов. Нерепарируемые повреждения обычно
служат сигналом к запуску процесса апоптоза, в результате чего клетка с такими
повреждениями элиминируется из организма. Если же клетке, по каким-либо причинам,
удается избежать действия проапоптотиеских сигналов, то возникает риск
нерегулируемой клеточной пролиферации и возникновения рака. Исправление подобных
генетических изменений и повреждений структуры ДНК осуществляется разнообразными
путями и с участием сложных комплексов ферментов и белковых факторов. В связи с
чрезвычайной важностью поддержания целостности генома и предотвращения
канцерогенеза, гены, кодирующие белки и ферменты репарации ДНК, рассматриваются
как гены-кандидаты развития рака [2].
Ключевую роль в процессах репарации ДНК играют гены группы XRCC,
сокращенно от X-raycross-complementinggroup (перекрестно-комплементарная группа
репарации радиационных повреждений), которые были идентифицированы при изучении
мутаций вызванных рентгеновским излучением.
На данный момент описан ряд полиморфизмов генов группы XRCC, способных
приводить к различным патологиям, в частности к развитию рака. По литературным
данным наиболее вероятными генами-кандидатами предрасположенности к раку легкого
можно считать XRCC1 и XRCC3 [3].
XRCC1является мультидоменным белком, участвующим в ЭРО и репарации
однонитевых разрывов ДНК. Он может играть важную роль в устойчивости организма к
действию разнообразных мутагенных факторов (окисляющие и алкилирующие агенты,
ионизирующая радиация). Сам по себе белок XRCC1 не проявляет ферментной активности
и скорее выступает в роли каркасного белка, на основе которого собирается комплекс
репарации [3]. Было показано, что белок XRCC1 взаимодействует с ДНК-полимеразой β,
поли (АДФ-рибоза) полимеразами (PARP) 1 и 2, апуриновой/апиримидиновой (АП)
эндонуклеазой (APE1/APEX1), 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой (OGG1) и ядерным
антигеном пролиферирующих клеток(PCNA). XRCC1 является важным стабилизирующим
фактором для ДНК лигазы III и его отсутствие приводит к существенному снижению
уровня этого фермента. На данный момент известно более 60 однонуклеотидных
полиморфизмов (ОНП) гена XRCC1, среди которых около 30 располагаются в области
экзонов или промотора [3].
Белок XRCC3 участвует в репарации двунитевых разрывов и поперечных сшивок
ДНК, а также взаимодействует с белками Rad51 (RecA у бактерий), ключевыми
компонентами рекомбинационной репарации, обеспечивая их объединение в
мультимерный комплекс на поврежденном сайте ДНК. Кроме того, XRCC3 обеспечивает
стабильность [3] и нормальную сегрегацию хромосом. Ген XRCC3 располагается в
хромосоме 14q32.3 и состоит из 9 экзонов. Он кодирует полипептид длиной 346
аминокислот.Для гена XRCC3описаны 4 ОНП в кодирующих областях.
Описано три кодирующих полиморфизма в гене XRCC1 в кодонах 194 (ArgtoTrp),
280 (ArgtoHis), и 399 (ArgtoGln). Полиморфизм Arg399Gln 10 экзона затрагивает его
центральный домен, необходимый для активации BER (baseexcisionrepair). Есть сведения
что данный полиморфизм связан c риском развития рака легких, однако анализ
литературных данных показал достаточно противоречивые результаты ассоциации
Arg399Gln полиморфизма с раком легких.
Что же касается полиморфизмов Arg194Trp и Arg280His, не было обнаружено
связи с риском рака легких для европейской популяции. Ван и др. провели 30
исследований методом случай-контроль на XRCC1 полиморфизм Arg399Gln и 16
исследований Arg194Trp. Их результаты показали, что конкретные кодоны XRCC1 399 и
194 могут негативно влиять на предрасположенность к раку легких.
Значительное снижение риска рака легких наблюдался у европейцев для XRCC3
T241M, но не в азиатских популяциях.
Можно предположить что, несогласованность этих результатов может лежать в
основе различий в этнической принадлежности, образе жизни и распространении болезни.
В связи с вышеизложенным, нами была поставлена цель – изучить популяционные
особенности полиморфизма генов репарации ДНК (XRCC1 и XRCC3) в казахстанской
популяции.
В исследование были включены 70 больных с диагнозом злокачественные
новообразования легких. Обследованные пациенты находились на стационарном лечении
и диспансерном учете в клиниках Национального научного медицинского центра г.
Астаны, Восточно-Казахстанского областного онкологического диспансера. Из всех
обследованных 94% (66) составили мужчины, 6% (4) –женщины, возрастной интервал
составил от 40 до 82 лет (62,1±6,9 лет). 36 пациентов со злокачественными
новообразованиями легкого, принимавшие участие в данном исследовании, проживали в
районах с повышенным уровнем радона и его ДПР.
Материалом для исследования явилась ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной
крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки.
Предварительно проводилась ПЦР амплификация необходимых фрагментов гена
XRCC1 размером 248 п.н. и гена XRCC3 размером 136 п.н. содержащих в себе
исследуемые полиморфные сайты. Верификация наличия необходимого ПЦР-продукта
проводилась путем электрофореза в 1% агарозном геле.
После
амплификации
ПЦР-продукты
подвергались
обработке
рестрикционнымиэндонуклеазами в течение ночи. Разделение продуктов рестрикции
осуществлялось методом электорофореза в 2% агарозном геле в присутствии
бромистогоэтидия и визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете.
Ген
Последовательность праймеров
XRCC1
Arg194Trp
XRCC1
Arg399Gln
XRCC3
Thr241Met
5´GCCCCGTCCCAGGTA3´,
5´AGCCCCAAGACCCTTT3´
5´CAAGTACAGCCAGGTCCTAG3´,
5´CCTTCCCTCACTGGAGTAC-3´
5´GCCTGGTGGTCATCGACTC3´
R 5´ACAGGGCTCTGGAAGGCACT
Температура
отжига (°C)
Ферменты
рестрикции
57
PvuII
55
NciI
60
NcoI
Согласно проведенным исследованиям, частоты генотипов гена XRCC1 Arg194Trp
в казахстанской популяции были следующими: гомозиготные носители нормальной
аллели Arg/Arg составили 73% от общего числа (51/70), гетерозиготыArg/Trp 16% (11/70)
и гомозиготы по мутантной аллели Trp/Trp 11% (8/70) соответственно. Таким образом,
полученные данные говорят о преобладании варианта нормальной аллели Arg/Arg в
контрольной группе, представленной здоровыми людьми без патологии легких.
На рисунке 1 представлены результаты ПЦР-ПДРФ-анализа на полиморфизм
XRCC1 Arg194Trp.Дорожки 3,5,8 представляют гетерозиготный вариант Arg/Trp (длина
фрагментов после рестрикции 490/294/196 b.p.).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
500 п.о.
Рисунок 1 - Электрофореграмма идентификации генотипов по гену XRCC1
Arg194Trp
В случае полиморфизма гена XRCC1 Arg399Gln гомозиготные носители
нормальной аллели Arg/Arg составили 37% от общего числа (26/70), гетерозиготыArg/Gln
26% (18/70) и гомозиготы по мутантной аллели Gln/Gln 37% (26/70) соответственно.
248 п.о
159 п.о
89 п.о
Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов рестрикции гена XRCC1Arg399Gln
Таким образом, в контрольной группе здоровых людей оказалось равное
количество носителей как нормальной аллели Arg/Arg, так и мутантной аллели Gln/Gln.
В казахстанской популяции гомозиготные носители нормальной аллели XRCC3
Trp/Trp составили 26% от общего числа (18/70), гетерозиготыTrp/Met 72% (50/70) и
гомозиготы по мутантной аллели Met /Met 2% (2/70).
Полученные данные говорят о преобладании варианта гетерозиготной аллели
Trp/Met в контрольной группе, представленной здоровыми людьми без патологии легких.
На рисунке 3 представлены результаты ПЦР-ПДРФ-анализа на полиморфизм
XRCC3 Thr241Met.
97 п.о
39 п.о.
Рисунок 3 - Электрофореграмма идентификации генотипов по гену
XRCC3Thr241Met
Как мы уже писали выше, что именно гены репарации участвуют в формировании
индивидуальной чувствительности к радиационному воздействию [4]. Так в ряде работ
было установлено, что полиморфизм генов XRCC1 и XRCC3 ассоциирован с увеличением
частоты хромосомных мутаций, обусловленных воздействием радона [5, 6].
На территории Республики находится около 50 урановых месторождений, их
разработка привела к образованию около 240 млн. т радиоактивных отходов. В
настоящее время более 10 предприятий в Казахстане ведут добычу урана методом
подземного выщелачивания. Заметное количество радиоактивных отходов образуется при
добыче нефти, угля и других полезных ископаемых, которые сопровождаются
различными проявлениями урановой минерализации. Все эти факторы способствуют
образованию повышенных концентраций радона на территории Казахстана. Считается,
что уровень эффективной дозы облучения населения Казахстана за счет радона в 1,5 раза
больше среднемирового [4].
Литература
1. Tobin M.D. et all. Genome-wide association study identifies five loci associated with
lung fuction.// Nature.-2010.-Vol.-42.-P.2010.-Vol.-42.-P.36-44.
2. Schneider J., Classen V., Helmig S.XRCC1 polymorphism and lung cancer
risk.//Expert Rev MolDiagn. -2008.- Vol.8 (6). -P.761-780.
3.
Guo S., Li X., Gao M., Li Y., Song B., Niu W. The relationship between XRCC1
and XRCC3 gene polymorphisms and lung cancer risk in northeastern Chinese.//PLoS One.2013.-Vol.8(2).- P.1-5.
4.
Barnett G.C., West C.M., Dunning A.M. et al. Normal tissue reactions to
radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype // Nat. Rev. Cancer. -2009.- Vol. 9.P. 134 -142.
5.
Kiuru A., Lindholm C., Heilimo I. et al. Influence of DNA repair gene
polymorphisms on the yield of chromosomal aberrations // Environ. Mol. Mutagen.- 2005.Vol.46. –P.198-205.
6.
http://www.eco.gov.kz/old/public/public/radon.doc