Полная версия научной работы 964 КБ

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНККАЗАХСТАНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ.
Ондыбаева С.Б., Кусаинова А., Булгакова О.В.
Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева
Астана, Казахстан
XRCC1
И
XRCC3
В
GENE POLYMORPHISMS OF DNA REPAIR-XRCC1 AND XRCC3 IN THE KAZAKH
POPULATION
Ondybaeva SB Kusainova A. Bulgakov OV
L.N. Gumilyov Eurasian National University.
Astana, Kazakhstan
Рак легкого (РЛ) занимает лидирующие позиции в структуре онкологической
заболеваемости мужчин, которые болеют почти в 7 раз чаще, чем женщины [1]. Согласно
данным международного агентства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется около
1 миллиона новых случаев рака лёгких, 60 % онкологических больных погибает в результате
данного заболевания [2].
Основными причинами канцерогенеза является сбой в системе контроля за процессами
пролиферации, репарации ДНК, апоптоза и детоксикации канцерогенных веществ, вызванные
не только генетическими и эпигенетическими нарушениями, но и вариабельностью
функционирования генов, обусловленной генетическим полиморфизмом [3].
Есть несколько генетических полиморфизмов генов, продукты которых вовлечены в
механизмы репарации ДНК [4]. Фермент XRCC1 играет ключевую роль в эксцизионной
репарации ДНК [5].
Описано три кодирующих полиморфизма в гене XRCC1 в кодонах 194 (Arg to Trp), 280 (Arg to
His), и 399 (Arg to Gln). Полиморфизм Arg399Gln 10 экзона затрагивает его центральный
домен, необходимый для активации BER (base excision repair). Есть сведения что данный
полиморфизм связан c риском развития рака легких [6], однако анализ литературных данных
показал достаточно противоречивые результаты ассоциации Arg399Gln полиморфизма с
раком легких [7].
Что же касается полиморфизмов Arg194Trp и Arg280His, не было обнаружено связи с риском
рака легких для европейской популяции [8]. Ван и др. провели 30 исследований
полиморфизма XRCC1 Arg399Gln методом случай-контроль и 16 исследований полиморфизма
Arg194Trp. Их результаты показали, что конкретные кодоны XRCC1 399 и 194 могут
негативно влиять на предрасположенность к раку легких [9].
В процессах репарации двунитевых разрывов ДНК и рекомбинационной репарации ДНК
вероятно
участвует
XRCC3 [10, 11, 12]. Двунитевые разрывы ДНК
- наиболее
распространенная форма повреждений ДНК вызванная радиационным воздействием,
репарация возможна по средствам двух механизмов - репарации гомологичной репарации
(HRR - homologous recombination repair) и репарации негомологичных концов (no homologous
end-joining). Механизм HRR состоит, по крайней мере, из 16 белковых компонентов, включая
XRCC3. Полиморфизм в 7 экзоне XRCC3 приводит к замене аминокислоты в кодоне 241
(Thr241Met), который может затронуть функцию фермента и/или взаимодействие с другими
белками, вовлеченными в репарацию повреждений ДНК [13]. Во многих литературных
источниках говорится о значительном снижении риска развития рака легких в европейской
популяции для носителей полиморфизма XRCC3 T241M. Однако, исследования данного
полиморфизма, проведенные в азиатских популяциях не выявили достоверной ассоциации
между XRCC3 T241M и развитием рака легких.
Можно предположить что, несогласованность этих результатов может лежать в основе
различий в этнической принадлежности, образе жизни и распространении болезни [8].
В связи с вышеизложенным, нами была поставлена цель – изучить популяционные
особенности полиморфизма генов репарации ДНК (XRCC1 и XRCC3) в казахстанской
популяции здоровых людей, выбранных в качестве контрольной группы для изучения роли
полиморфизма генов XRCC1 и XRCC3 в патогенезе развития рака легких .
В исследование были включены 70 добровольцев
без патологии легких. Из всех
обследованных 73% составили мужчины, 27% - женщины, возрастной интервал составил от
42 до 80 лет (60,2±8,6 лет).
Геномная ДНК была выделена из цельной венозной крови с последующей фенольнохлороформной экстракцией (Дейвис К., 1990).
Оценка полиморфизмов генов проводилась с помощью ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа (условия
см. таблица 1). Визуализация продуктов ПЦР-ПДРФ реакции проводилась методом гельэлектрофореза. Продукты амплификации или рестрикции анализировали в агарозном или
полиакриламидном геле. Использовали 2% агарозный гель.
Таблица 1. Условия анализа
полиморфизма локусов изучаемых генов
Ген
Последовательность праймеров
XRCC1
5´GCCCCGTCCCAGGTA3´,
Arg194Trp
5´AGCCCCAAGACCCTTT3´
XRCC1
5´CAAGTACAGCCAGGTCCTAG3´,
Arg399Gln
Температура
Ферменты
отжига (°C)
рестрикци
57
и
PvuII
55
NciI
5´CCTTCCCTCACTGGAGTAC-3´
XRCC3
5´GCCTGGTGGTCATCGACTC3´
Thr241Met
R 5´ACAGGGCTCTGGAAGGCACT
60
NcoI
Распределение частот генотипов гена XRCC1 Arg194Trp в казахстанской популяции было
следующим: гомозиготные носители нормальной аллели Arg/Arg составили 73% от общего
числа (51/70), гетерозиготы Arg/Trp 16% (11/70) и гомозиготы по мутантной аллели Trp/Trp
11% (8/70) соответственно.
Таким образом, полученные данные говорят о преобладании варианта нормальной аллели
Arg/Arg в контрольной группе, представленной здоровыми людьми без патологии легких. На
рисунке 1 представлены результаты ПЦР-ПДРФ-анализа на полиморфизм XRCC1 Arg194Trp.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
500 b.p
Рисунок 1 - Примеры идентификации генотипов по гену XRCC1 Arg194Trp
Дорожки 3,5,8 представляют гетерозиготный вариант Arg/Trp (длина фрагментов после
рестрикции 490/294/196 b.p.).
В случае полиморфизма гена XRCC1 Arg399Gln гомозиготные носители нормальной аллели
Arg/Arg составили 37% от общего числа (26/70), гетерозиготы Arg/Gln 26%
(18/70) и
гомозиготы по мутантной аллели Gln/Gln 37% (26/70) соответственно.
Таким образом, в контрольной группе здоровых людей оказалось равное количество
носителей как нормальной аллели Arg/Arg, так и мутантной аллели Gln/Gln.
В
казахстанской популяции гомозиготные носители нормальной аллели XRCC3 Trp/Trp
составили 26% от общего числа (18/70), гетерозиготы Trp/Met 72% (50/70) и гомозиготы по
мутантной аллели Met /Met 2% (2/70). Полученные данные говорят о преобладании варианта
гетерозиготной аллели Trp/Met в контрольной группе, представленной здоровыми людьми без
патологии легких.
На рисунке 2 представлены результаты
ПЦР-ПДРФ-анализа на полиморфизм XRCC3
Thr241Met.
200 b.p
Рисунок 2 - Примеры идентификации генотипов по гену XRCC3 Thr241Met
Дорожки 2, 8 представляют гомозиготный мутантный вариант Met /Met (длина фрагментов
после рестрикции 97/39 b.p.); 3,7,9,10 дорожки – гомозиготная нормальная аллель Trp/Trp (136
b.p.); дорожки 4,5,6 – гетрозиготная аллель Trp/Met (длина фрагментов после рестрикции
136/97/39 b.p.)
1.
Perera FP (1998). Molecular epidemiology of environmental carcinogenesis. Recent Results
Cancer Res, 154, 39-46.
2.
Raunio H, Husgafvel-Pursiainen K, Anttila S, et al (1995). Diagnosis of polymorphisms in
carcinogen-activating and inactivating enzymes and cancer susceptibility-a review. Gene, 159, 11321.
3.
4.
Malik, Brown, 2000; Singletary, 2003; Yokota, Kohno, 2004; Hunter, Crawford, 2006.
Perera FP (1998). Molecular epidemiology of environmental carcinogenesis. Recent Results
Cancer Res, 154, 39-46.
5.
Kubota Y, Nash RA, Klungland A, Scha¨ r P, Barnes DE, et al. (1996) Resconstitution of DNA
base excision repair with purified human proteins: Interaction between DNA polymerase beta and the
XRCC1 protein.EMBO J 15:6662–70.
6.
Hao B, Miao X, Li Y, Zhang X, Sun T, et al. (2006) A novel T–77C polymorphism in DNA
repair gene XRCC1 contributes to diminished promoter activity and increased risk of non-small cell
lung cancer. Oncogene 25:3613–20.
7.
Egger M, Smith DG, Schneider M, Minder C (1997)Bias in meta-analysis detected by a simple,
graphical test. BMJ 315:629–34.
8.
Higgins JPT, Green S (2008) Cochrane handbook for systematic reviews of interventions
version 5.0.1. The Cochrane Collaboration, Oxford
9.
Wang Y, Yang H, Li H, Li L, Wang H, et al. (2009) Association between X-ray repair cross
complementing group 1 codon 399 and 194 polymorphisms and lung cancer risk: a meta-analysis.
Cancer Lett 285:134–40.
10.
Shin A, Lee KM, Ahn B, Park CG, Noh SK, et al. (2008) Genotype-phenotype relationship
between DNA repair gene genetic polymorphisms and DNA repair capacity. Asian Pac J Cancer Prev
9:501–5.
11.
Tebbs RS, Zhao Y, Tucker JD, Scheerer JB, Siciliano MJ, et al. (1995) Correction of
chromosomal instability and sensitivity to diverse mutagens by a cloned cDNA of the XRCC3 DNA
repair gene. Proc Natl Acad Sci USA 92:6354–8.
12.
Thacker J, Zdzienicka MZ (2004) The XRCC genes: expanding roles in DNA double-strand
break repair. DNARepair (Amst.) 3:1081–90.
13.
Kuschel B, Auranen A, McBride S, Novik KL, Antoniou A, et al. (2002) Variants in double-
strand break repair genes and breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 11:1399–440.